一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法及應用的製作方法

2023-07-15 00:56:46 2

一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法及應用，在製備組織工程材料方面的應用；製備方法為將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理。本發明所得去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的免疫原性低、細胞粘附率高。在靜態培養條件下其所培養細胞的活性高、幹細胞表型保持完整、且由於去除了脫鈣骨基質中的蛋白活性成分，該類去蛋白脫鈣骨基質顆粒在培養過程中將不會引起幹細胞等目的細胞發生成骨分化；通過對BMSCs的動態培養實驗證實，該微載體顆粒可用於動態懸浮培養條件，在適宜於細胞培養的攪拌速度下可順利形成懸浮，其細胞粘附率較cytodex3稍高、擴增效率相仿。
【專利說明】一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法及應用。
【背景技術】
[0002]目前種子細胞的使用主要以自體細胞為主，但其可獲取量太少，遠遠不能滿足臨床使用所需，因此需要在體外進行擴增，待達到所需數目後進一步完成組織工程骨的構建。在種子細胞的體外擴增方面，今年來以微載體在動態懸浮培養條件下的培養效果較為優越且得到廣泛認可。
[0003]但是，目前使用較為廣泛的、可作為同類產品考量標準品的微載體選擇主要為Cytodex系列產品，其中以CytodeX3應用較為廣泛，該產品為人工合成的含變性蛋白表面包被的右旋糖酐顆粒，具有良好的細胞粘附性及均質性；其細胞培養效率高，可在短時間內大量擴增種子細胞用於疫苗、輔酶等的批量生產，或大量擴增幹細胞等種子細胞並經消化分離後收集以用於組織工程構建。但是，Cytodex類產品均為人工合成材料，多為不可降解材料，無法直接用於體內組織修復過程，導致經微載體培養擴增的種子細胞不能直接以微載體為體內移植載體而植入體內。大量實驗結果表明，額外的細胞消化分離過程會破壞胞外基質，從而造成細胞活性的喪失及細胞數目的浪費。在解決上述問題的過程中，研究者們試圖通過改良細胞獲取手段、優化微載體材料及製備等方法來提高細胞利用率及有效率，但大都因為細胞活性降低或體內局部酸累積無明顯改善而終止，導致可直接用於體內移植的微載體材料尚較為缺乏。
[0004]為了得到質地統一、可控性好的微載體顆粒(微載體的基本要求之一)，在微載體製備過程中多採用人工合成材料及方法來進行微載體加工，這將勢必造成微載體材料在體內的降解性差或不可降解，因而不能作為體內植入材料來應用於種子細胞的體內移植載體，導致種子細胞在經微載體培養擴增後仍需進行消化分離以進行其與移植支架材料的再貼壁過程。總而言之，在現行的微載體製備思路下，採用人工合成材料製備的微載體顆粒將很難作為種子細胞的移植載體，由其培養擴增所得的種子細胞將不可避免的進行再消化分離。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法及應用，製備出可用於體外動態懸浮培養條件並大量擴增種子細胞的微載體。
[0006]為實現上述目的，本發明採用如下的技術方案:
[0007]—種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體在製備組織工程材料方面的應用。
[0008]所述組織工程材料為修復腔隙狀組織缺損區的組織工程材料。
[0009]所述組織工程材料為修復大段骨缺損的組織工程材料。
[0010]一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。
[0011]所述冷凍粉碎前將牛皮質骨在-80°c保存24h以上。
[0012]所述脫脂具體過程為:向脫脂液中加入骨顆粒並持續攪拌2_3h後用蒸餾水衝洗骨顆粒，然後把衝洗後的骨顆粒加入到脫脂液中，持續攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g骨顆粒，脫脂液為甲醇與氯仿體積比為1:1的混合物。
[0013]所述脫鈣具體為:將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌8_12h，然後將骨顆粒取出，然後重複上述過程2-3次；其中，每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為0.8-1.2g0
[0014]所述脫蛋白處理具體為:室溫下，將脫鈣處理後的骨顆粒，依次置於2-3mol/L的CaCl2溶液攪拌16-24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然後在52°C的水浴下加熱4-6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36_48h，水洗後收集顆粒，並經過凍幹處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理後的骨顆粒質量的2_3倍。
[0015]相對於現有技術，本發明具有的有益效果:本發明將牛皮質骨進行脫鈣及脫蛋白處理，所得去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的免疫原性低、細胞粘附率高。在靜態培養條件下其所培養細胞的活性高、幹細胞表型保持完整、且由於去除了脫鈣骨基質中的蛋白活性成分(如BMPs等)，該 類去蛋白脫鈣骨基質顆粒在培養過程中將不會引起幹細胞等目的細胞發生成骨分化；通過對BMSCs (骨髓間充質幹細胞)的動態培養實驗證實，該微載體顆粒可用於動態懸浮培養條件，在適宜於細胞培養的攪拌速度下可順利形成懸浮，其細胞粘附率較cytodex3稍高、擴增效率相仿，14天的培養期結束後對培養細胞進行鑑定，證實BMSCs的表型、多能性、再增殖能力的保持令人滿意；通過動物體內初步試驗證實該微載體可經16#注射針頭順利完成體內注射，並可在異位成骨且細胞存活性更好。
[0016]另外，本發明對牛去蛋白脫鈣骨基質顆粒同樣進行了實驗動物(大鼠、紐西蘭兔)的體內免疫反應及降解性、成骨性的檢測，結果均可達到組織工程學組織構建對於植入型生物材料的要求；在以凝膠混合微載體-細胞複合物進行體內早期免疫反應測試的過程中，術後7d見微少量免疫細胞浸潤，表明其免疫原性低、生物相容性好。
[0017]本發明中去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法簡單，易於操作，並且製得的微載體的免疫原性低、細胞粘附率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為DpDBM微載體的表面掃描電鏡圖片；
[0019]圖2為DpDBM微載體的細胞粘附低倍掃描電鏡圖片；
[0020]圖3為DpDBM微載體的細胞粘附高倍掃描電鏡圖片；
[0021]圖4為Cytodex3微載體的表面掃描電鏡圖片；
[0022]圖5為CytodeX3微載體的細胞粘附低倍掃描電鏡圖片；
[0023]圖6為CytodeX3微載體的細胞粘附高倍掃描電鏡圖片。
【具體實施方式】[0024]下面結合附圖對本發明進行詳細說明。本發明中的溶液均是指水溶液。
[0025]一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，包括以下步驟:
[0026]先將牛皮質骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，加入到脫脂液中，持續攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g g骨顆粒篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒並持續攪拌2-3h後用蒸餾水衝洗骨顆粒，然後把衝洗後的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然後進行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌8-12h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌8_12h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌12_24h，然後將骨顆粒取出放入0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌12_24h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為0.8-1.2g，因為開始時脫鈣較快，所以在前24小時內以每12h更換脫鈣液一次；然後將將骨顆粒進行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小於200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。
[0027]其中，脫蛋白處理即採用標準的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理後的骨顆粒，依次置於2-3mol/L的CaCl2溶液攪拌16_24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然後在52°C的水浴下加熱4_6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36-48h，水洗後收集顆粒，並經過凍幹處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理後的骨顆粒質量的2_3倍。
[0028]實施例1
[0029]一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，包括以下步驟:
[0030]先將牛皮質骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，加入到脫脂液中，持續攪拌2h，其中每3mL脫脂液中加入0.Sg骨顆粒篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒並持續攪拌3h後用蒸餾水衝洗骨顆粒，然後把衝洗後的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然後進行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌12h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入0.5mol/L的鹽酸中，持續攪拌8h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入0.5mol/L的鹽酸中，持續攪拌24h，然後將骨顆粒取出放入0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌12h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為1.2g,因為開始時脫鈣較快，所以在前24小時內以每12h更換脫鈣液一次；然後將骨顆粒進行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小於200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。
[0031]其中，脫蛋白處理即採用標準的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理後的骨顆粒，依次置於2mol/L的CaCl2溶液攪拌16h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌24h，然後在52°C的水浴下加熱6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36h，水洗後收集顆粒，並經過凍幹處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理後的骨顆粒質量的3倍。
[0032]實施例2
[0033]一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，包括以下步驟:
[0034]先將牛皮質骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，加入到脫脂液中，持續攪拌3h，其中每3mL脫脂液中加入1.2g骨顆粒篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒並持續攪拌2h後用蒸餾水衝洗骨顆粒，然後把衝洗後的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然後進行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.5mol/L的鹽酸中，持續攪拌8h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌12h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入
0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌12h，然後將骨顆粒取出放入0.5mol/L的鹽酸中，持續攪拌12h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為0.8g，因為開始時脫鈣較快，所以在前24小時內以每12h更換脫鈣液一次；然後將骨顆粒進行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小於200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。
[0035]其中，脫蛋白處理即採用標準的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理後的骨顆粒，依次置於3mol/L的CaCl2溶液攪拌24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16h，然後在52°C的水浴下加熱4h，再用6mol/L脲素溶液抽提48h，水洗後收集顆粒，並經過凍幹處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理後的骨顆粒質量的3倍。
[0036]實施例3
[0037]—種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，包括以下步驟:
[0038]先將牛皮質骨在_80°C保存24h以上(冷凍處理可降低材料的免疫原性)，再將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，加入到脫脂液中，持續攪拌3h，其中每3mL脫脂液中加入Ig骨顆粒篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂，即向脫脂液中加入骨顆粒並持續攪拌2h後用蒸餾水衝洗骨顆粒，然後把衝洗後的骨顆粒，脫脂液為甲醇、氯仿體積比1:1的混合物；然後進行脫鈣，即將骨顆粒加入到0.5mol/L的鹽酸中，持續攪拌10h，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌llh，然後將骨顆粒取出，漂洗後放入
0.5mol/L的鹽酸中，持續攪拌18h，其中每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為lg，因為開始時脫鈣較快，所以在前24小時內以每12h更換脫鈣液一次；然後將骨顆粒進行脫蛋白處理，篩選出合適大小顆粒(直徑小於200um的顆粒)，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。
[0039]其中，脫蛋白處理即採用標準的BMP提取過程，具體為室溫下，將脫鈣處理後的骨顆粒，依次置於3mol/L的CaCl2溶液攪拌20h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌19h，然後在52°C的水浴下加熱5h，再用6mol/L脲素溶液抽提40h，水洗後收集顆粒，並經過凍幹處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理後的骨顆粒質量的2倍。
[0040]本發明製備的去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的應用通過以下實驗實現:
[0041]種子細胞的微載體動態懸浮培養(以BMSCs為例):採用攪拌式生物反應器動態懸浮培養預先培養至一定數目的幹細胞量，以與CytodeX3相仿的接種量及培養環境進行幹細胞擴增(接種參數為 3mg/mL ；l*105cell/mL ；40rpm/min)。BMSCs 採用 8w wistar 大鼠骨髓衝洗所培養的BMSCs原代，擴增至P3代後進行微載體接種，種植密度及微載體密度如上述接種參數，因需與CYT0DEX3形成對比，故採用CYT0DEX3的常用接種參數(也為微載體使用的推薦參數)。
[0042]培養所得微載體-細胞複合物體內移植:
[0043]I)利用藻酸鹽凝膠與微載體-細胞混合[0044]將質量分數為1-3%藻酸鈉溶液加入到lOOmmol/L氯化鈣溶液形成藻酸鈣凝膠，首先採用藻酸鈉溶液混懸微載體-細胞複合物，隨後緩慢添加氯化鈣溶液形成凝膠，製備出可通過20mL注射器針頭注射的凝膠狀混合物，構建的組織工程材料可通過微創注射的方式用於修復腔隙狀組織缺損區。
[0045]2)由於本發明去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體顆粒較小(<200um)，故在組織工程學構建過程中，可作為承載高活性的種子細胞的直接移植載體，以整體形式(移植單元)與大孔徑材料聯合應用，從而獲得負重區組織替代材料所需的力學特性，其優點在於:大孔徑材料整體營養供應率較高，但其可粘附的有效面積則相應不足，與微載體-細胞複合物的聯合應用則恰好解決這一難題，而大孔徑材料也可為微載體的使用提供所需的力學性能，從而拓寬可植入型微載體的利用途徑及方式。
[0046]本發明的去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體可用於構建組織工程學生物替代材料，具體為:體外對種子細胞的動態培養擴增(可同時完成所需相關分化誘導等步驟)；作為種子細胞的直接移植載體與凝膠、大孔支架等材料聯合應用於體內大段骨缺損的修復。
[0047]本發明的去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體與人工合成聚合物類似，不含誘導分化的活性成分，因此可完成對種子細胞的快速擴增及表型維持；對於部分已分化細胞的培養，添加相應的誘導性培養液即可得到表型的維持；本發明去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體具有良好的生物相容性及降解特性，免疫排斥小，故能在移植入體內後得到良好的組織修復效果，且由其所培養的細胞，其增殖率高、活性好，同樣確保了組織修復的高效性。
[0048]圖1-3為DpD BM微載體及細胞貼附情況的掃描電鏡圖片，圖4_6為及CytodeX3微載體及細胞貼附情況的掃描電鏡圖片，從圖1-6可以看出與CytodeX3微載體相比，DpDBM微載體取得了類似細胞培養擴增效果。
[0049]本發明對牛去蛋白脫鈣骨基質顆粒同樣進行了實驗動物(大鼠、紐西蘭兔)的體內免疫反應及降解性、成骨性的檢測，結果均可達到組織工程學組織構建對於植入型生物材料的要求；在以凝膠混合微載體-細胞複合物進行體內早期免疫反應測試的過程中，術後7d見微少量免疫細胞浸潤，表明其免疫原性低、生物相容性好。
【權利要求】
1.一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體在製備組織工程材料方面的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述組織工程材料為修復腔隙狀組織缺損區的組織工程材料。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述組織工程材料為修復大段骨缺損的組織工程材料。
4.一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，其特徵在於，將牛皮質骨進行冷凍粉碎後，篩出粒徑小於200um的骨顆粒，並對骨顆粒進行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。
5.根據權利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，其特徵在於，所述冷凍粉碎前將牛皮質骨在_80°C保存24h以上。
6.根據權利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，其特徵在於，所述脫脂具體過程為:向脫脂液中加入骨顆粒並持續攪拌2-3h後用蒸餾水衝洗骨顆粒，然後把衝洗後的骨顆粒加入到脫脂液中，持續攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g骨顆粒，脫脂液為甲醇與氯仿體積比為1:1的混合物。
7.根據權利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的製備方法，其特徵在於，所述脫鈣具體為:將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌8_12h，然後將骨顆粒取出，然後重複上述過程2-3次；其中，每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為0.8-1.2g。
8.根據權利要求4所述的一種去蛋白脫鈣骨基質製備植入型微載體的製備方法，其特徵在於，所述脫蛋 白處理具體為:室溫下，將脫鈣處理後的骨顆粒，依次置於2-3mol/L的CaCl2溶液攪拌16-24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然後在52°C的水浴下加熱4-6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36_48h，水洗後收集顆粒，並經過凍幹處理；其中，所用2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理後的骨顆粒質量的2_3倍。
【文檔編號】A61L27/38GK103990180SQ201410225274
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月26日 優先權日:2014年5月26日
【發明者】張智勇, 裴國獻, 鄒繼偉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學