6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯並[g]異喹啉－5,10－二酮二馬來酸酯的脂質體製劑的製作方法

2023-07-15 00:05:06 1

專利名稱：6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯並[g]異喹啉－5,10－二酮二馬來酸酯的脂質體製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及化合物6，9-二-[(2-氨基乙基)氨基]苯並[g]異喹啉-5，10-二酮二馬來酸酯(BBR 2778)的脂質體藥物製劑。
脂質體是由一個或多個雙分子層構成的天然和/或合成磷脂(具有生物相容性的和生物降解性)的水分散體。當磷脂在水性介質中形成水合物時，它們自動形成膠體微粒或載體，其直徑通常為0.05-5.0μm。脂質體的粒度在0.025-2.5μm範圍之間，這依賴於它們的結構，其中所述結構可為單一或多個雙分子層。囊泡的大小是決定脂質體半衰期的一個關鍵參數並且它影響到可裝入膠囊中藥物的量。
脂質體可根據它們在天然和/或合成磷脂(含磷-鞘脂類)中的組成分類，並且它們的雙分子層可進一步包含其它成分，如膽固醇和與脂質共軛的親水性聚合物。根據其雙分子層的大小和數量，也可以將脂質體分成下列種類(a)多層脂質體(MLV)，(b)大單層脂質體(LUV)，(c)小單層脂質體(SUV)，(d)多泡脂質體(MVV)，(e)少層脂質體(OLV)。
構成脂質體的磷脂之理化特性(如膜流動性、電荷密度、位阻和通透性可影響脂質體與血成分、組織和細胞間的相互作用。
脂質體被公認為是潛在的有價值之藥物載體。脂質體容納、攜帶和釋放藥物的能力已導致了許多臨床應用。脂質體在藥學領域最簡單的用途是作為不溶性藥物的無毒性載體。更複雜的應用涉及將脂質體用作「儲庫」，用於藥物的緩釋或藥物的定位，以避開或到達特定組織。脂質體形式的藥物對許多疾病的治療和預防都提供了良好的結果，如在抗微生物治療中、在抗癌治療中、作為疫苗中的佐劑、在激素和酶的治療中、在診斷技術中以及在皮膚和眼疾的治療中。用於治療疾病如癌症的藥物通常具有有限的治療指數，並且對正常組織可能是高毒的。脂質體製劑可通過改變藥物的生物分布，從而改善治療指數。與給予游離藥物的對照動物相比，用具有延長血漿半衰期之脂質體封裝的蒽環黴素(anthracycline)進行的一些試驗顯示其可降低心臟毒性並且動物存活較好。在阿黴素(一種蒽醌抗腫瘤藥)的情況下，應用脂質體製劑證明在降低毒性方面是有效的。阿黴素最危險的副作用是進行性、不可逆的心臟損害。脂質體封裝的阿黴素顯示了較低的毒性同時保留了其治療功效。US 4,797,285、US 4,898,735和US5,043,166中公開了阿黴素/脂質體製劑及其在癌症治療中的應用。
化合物BBR 2778是蒽醌類抗腫瘤藥物，具抗腫瘤活性和降低的心臟毒性，其結構式如下 有關化合物BBR 2778的完整描述報導於US 5,587,382、US 5,717,099、US 5,506,232、US 5,616,709和醫學化學雜誌(J.Med.Chem.)，1994，37卷，828-837中。
將40或60mg/kg劑量的BBR 2778以彈丸注射方式靜脈內施與CD1小鼠後，在治療期間或治療後立即觀察到一些動物死亡。
此類突然死亡被認為是由於與使用BBR 2778有關的下列因素之一形成血栓的活性；血凝固參數的改變，其導致播散性血管內凝固的形成；過敏性休克的誘導；對中樞神經系統的直接毒性效應；形成心律失常的活性；電解質不平衡。當注射速率降低(每次注射7-8分鐘，速率為0.1ml/min)並通過腹膜內施用時，該劑量-依賴現象減小。
因此，本發明所要克服的根本問題是找到化合物BBR 2778的合適製劑，以克服上述缺點，特別是以彈丸注射形式施用活性組分後觀察到的突然死亡。意外地發現，以特定組成表徵的BBR 2778脂質體製劑成功地解決了所述問題。
因此，本發明提供了由脂質體組成的化合物BBR 2778的脂質體製劑，其中所述脂質體包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和BBR 2778，其中膽固醇/磷脂的重量比為1∶2至1∶7，並且BBR 2778/磷脂的重量比為1∶4至1∶25。磷脂醯膽鹼優選地包含選自棕櫚酸、油酸、亞油酸、γ-亞油酸、亞麻酸和硬脂酸的脂肪酸殘基，並且脂質體由氫化和非氫化磷脂醯膽鹼以1∶2至2∶1的比例混合而成，其中磷脂醯膽鹼具有所述的脂肪酸組分，更優選地，所述混合物是由具有120℃熔點和90℃結晶點的氫化磷脂醯膽鹼以及具有如圖5所報導之溫譜圖的非氫化磷脂醯膽鹼組成。具有上述組分的氫化和非氫化磷脂醯膽鹼可分別在PHOSPHOLIPON90H和PHOSPHOLIPON90的商品名稱下，通過商業渠道獲得。
優選地，本發明之組合物除包含上述組分外，還包含帶電化合物，如硬脂醯胺和二鯨蠟基磷酸酯。所述組分的加入給脂質體提供了表面電荷，這些表面電荷誘導脂質體相互排斥，因此可阻止它們萎陷。磷脂混合物也可以包含十二烷基硫酸鈉、cremophor RH60、α-生育酚磷酸鹽和醋酸鈣。而且，在膜的雙分子層中可包含小部分(5-19mol％)具有親水基的化合物，如單唾液酸神經節苷酯、氫化磷脂醯肌醇和與脂質共軛的聚乙二醇(PEG-DSPE)，以減少脂質體與細胞和血成分之間的相互作用。
根據本發明的脂質體製劑通過體內試驗，對其抗腫瘤活性和毒性進行了測試。P388鼠白血病用作腫瘤模型。特別地，通過與施用游離藥物製劑的對照組比較來評價對突然死亡的抑制活性。在實施例中進行了詳情報導。該試驗結果證實了本發明之脂質體製劑可導致平均存活時間的顯著改善和毒性的顯著降低。此外，再也觀察不到突然死亡。
總之，可因此陳述本發明之製劑可保持抗腫瘤活性而不誘發突然死亡，而在施用游離藥物或含活性組分的其它常規製劑時，可觀察到突然死亡。
下列實施例對本發明進行了更詳細的闡述。實施例1-將卵磷脂純化為磷脂醯膽鹼卵磷脂的主要來自大豆、棉花、向日葵和菜籽的植物油或來自動物組織(卵)。按照產量來說，大豆和卵來源的卵磷脂是最重要的。將大豆用己烷提取，得到半固體形式的粗卵磷脂，它包含52％的磷脂、35％的油和脂肪、10％的糖脂和糖、2％的不可皂化物以及1％的水。
從粗卵磷脂中提取脂肪酸，以獲得細的或顆粒狀的卵磷脂粉末，再進一步用乙醇提取並分級分離，以獲得具有較高磷脂醯膽鹼含量的較純的卵磷脂。
粗卵磷脂也可使用工業生產磷脂醯膽鹼的一步法來純化，所述方法為使用丙酮提取，US5,442,276中對此進行了公開。
粗卵磷脂的純化
提取(乙醇)色譜層析(矽膠)
色譜層析(氧化鋁)
氫化作用
通過對PHOSPHOLIPON90(PHO90)的氫化作用，獲得了PHOSPHOLIPON90 H(PHO90H)。
兩種商購磷脂(Rhone-Pouleno Rorer)具有下列特性PHOSPHOLIPON90一過氧化物指數最大5一酸值最大0.5一乙醇最大0.5％
-水最大1.5％-形態黃色糊狀固體-加入的d，1α-生育酚最少0.1％。
PHOSPHOLIPON 90H-碘值最大1-水最大2.0％-在水中的20％分散液的相轉化溫度約為54℃-形態白色結晶固體。
用脂肪酸如棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和硬脂酸來酯化磷脂醯膽鹼分子中的甘油1-和2-位。實施例2-磷脂的色譜分析通過GLC分析來定量和定性確定磷脂醯膽鹼樣品的脂肪酸組分。使用純脂肪酸甲基酯(Carlo Erba)和標準橄欖油檢測和定量磷脂樣品中的脂肪酸。
樣品的皂化作用將50mg產品置於試管中，並加入3ml 1N氫氧化鈉(Baker)。緊緊密封試管並在合適的烤箱中於110℃下放置1小時。冷卻到室溫後，將樣品用2N鹽酸(Baker)酸化，並用10ml正己烷/乙酸乙酯90/10(Merck)混合物提取。在溫和的氮氣流下除去有機溶劑。
樣品的酯化作用從試管中除去有機相，加入1ml BF3甲醇液，緊緊密封試管並於100℃保持1小時。冷卻到室溫後，向樣品中加入5ml蒸餾水並用正己烷/乙酸乙酯90/10混合物提取兩次，每次5ml。用硫酸鈉乾燥1μl有機相，然後注射到氣相色譜裝置中。操作條件氣相色譜Mega 5300 Carlo Erba柱Megawax，長度30m，內徑0.32mm，f.t.0.25μm載體氦氣速度45cm/sec注射器250℃，1/100分流檢測器F.I.D.280℃烘烤120℃1分鐘最終溫度250℃，每分鐘熱增加5℃附

圖1-3分別顯示標準物、PHO90和PHO90H的氣相色譜圖。
表1顯示在所分析脂中酸的百分數表1
實施例3-磷脂的熱分析通過DSC分析單一的以及混合物中的商購磷脂PHO 90和PHO 90H。
如下製備樣品將500mg PHO 90溶解於10ml二氯甲烷+1ml MeOH中(S1)；將500mg PHO 90H溶解於10ml二氯甲烷+1ml MeOH中(S2)。
樣品12ml S1樣品22ml S2樣品30.5ml S1+1.5ml S2樣品41ml S1+1ml S2樣品51.5ml S1+0.5ml S2在氮氣流和適當加熱下乾燥樣品，然後通過DSC分析。用Mettler DSC20，以3℃/分鐘的梯度加熱到200℃，然後讓樣品冷卻來進行分析。
附圖4-5報導了兩種磷脂的溫譜圖。由圖4可見，PHO 90H具有明顯的、界限分明的熔點(120℃)和結晶點(90℃)。
就PHO 90而言，圖5顯示其不是結晶粉末，而是糊狀物，所以就像所有脂肪一樣，它沒有界限分明的熔點，但有軟化點(脂肪開始流動時的溫度)和透明點(脂肪完全透明時的溫度)。
這一點通過PHO 90的溫譜圖得以證實，其中觀察到了與軟化點相對應的寬帶，而不是像PHO 90H的溫譜圖那樣有特定的峰。
至於混合物的溫譜圖，在較低溫度下觀察到了結晶點的降低，從PHO90H∶PHO 90 2∶1混合物到1∶1混合物進一步降低，直至PHO 90H∶PHO90 1∶2混合物(其中PHO 90的性能佔優勢)最終完全消失。實施例4-脂質體製劑的製備將3.6g PHO 90、1.8g PHO 90H(2∶1比例)和0.52g膽固醇置於500ml圓底燒瓶中，並加入50ml二氯甲烷。超聲該混合物約10分鐘以促進溶解。將所得溶液在旋轉式膜蒸發器(Rotavapor)中，於40℃真空蒸發至幹，並輕輕旋轉直至獲得均一的磷脂膜。
冷卻所得磷脂膜；然後加入BBR 2778溶液，該溶液是通過將300mg BBR2778溶解於60ml水/丙二醇60/40並通過0.22μm濾器過濾製得；並加入10ml平均直徑為2mm的玻璃珠。將與旋轉蒸發器連接並緩慢運轉的圓底燒瓶在室溫和室壓下放置過夜(15小時，300轉/分鐘)直至完全再水合。表2報導了對所得BBR 2778製劑的分析結果。
表2
實施例5-BBR 2778脂質體抗腫瘤活性的評價動物小鼠，由Charles River Breeding laboratories(Calco，Como，Italy)提供；為6-8周齡的雄性小鼠，在標準飼養條件下飼養。
製劑以10mg/kg劑量的BBR 2778(施與小鼠前用無菌水溶解和稀釋)作為對照。使用實施例4的脂質體製劑。
腫瘤模型通過在DBA2小鼠中的一系列腹膜內移植而維持P388鼠白血病(由NCI Frederick Cancer Facility(USA)提供)。每隻小鼠移植106個P388鼠白血病細胞，在腫瘤移植後第1、4、7天靜脈內施與脂質體化合物和對照標準品。
通過測定小鼠存活時間的增加百分數來測定抗腫瘤活性，以治療組(T)平均存活時間(TMS)與對照組(C)平均存活時間的百分比T/C％表示
表3報導了試驗製劑中BBR 2778的抗腫瘤活性結果。表3
*中毒死亡數/小鼠總數**多次試驗的平均值實施例4的製劑和BBR 2778溶液之間進行比較，可清楚地表明施用脂質體製劑的小鼠突然死亡消失。對施用的每個單劑量的分析顯示出脂質體製劑和溶液劑之間T/C％和毒性的變化；在18mg/kg和27mg/kg劑量下，所觀察到的T/C％基本上沒有差異，然而僅在用非封裝BBR 2778治療後可觀察到毒性方面有差異。
在40mg/kg劑量下，與BBR 2778溶液相比，本發明製劑顯著改善平均存活時間分別為287、250和159，並顯著降低毒性(分別12％和60.4％)。在60mg/kg的劑量下，兩種製劑都引起中毒。
因此說明，施用本發明的BBR 2778脂質體製劑不引起突然死亡，並可降低毒性。
至於抗腫瘤活性，即使在某些劑量下T/C％可明顯上升，但來自BBR2778溶液的試驗結果仍可證實抗腫瘤活性。
權利要求
1.下式化合物6，9-二-[(2-氨基乙基)氨基]苯並[g]異喹啉-5，10-二酮二馬來酸酯(BBR 2778)的脂質體藥物製劑 其特徵在於所述脂質體包括磷脂醯膽鹼、膽固醇和化合物BBR2778，其中膽固醇/磷脂的重量比為1∶2至1∶7，並且BBR2778/磷脂的重量比為1∶4至1∶25。
2.如權利要求1所述的脂質體製劑，其中所述磷脂醯膽鹼包含選自棕櫚酸、油酸、亞油酸、γ-亞油酸、亞麻酸和硬脂酸的脂肪酸殘基。
3.如權利要求1所述的脂質體製劑，其中所述磷脂醯膽鹼是以1∶2至2∶1重量比混合的氫化和非氫化形式混合物。
4.如權利要求3所述的脂質體製劑，其中所述氫化形式的熔點為120℃且結晶點為90℃，所述非氫化形式的溫譜圖基本上如圖5所示。
5.如任一上述權利要求所述的脂質體製劑，其中脂質體進一步包含硬脂醯胺和/或二鯨蠟基磷酸酯。
6.權利要求1-5之脂質體製劑的用途，其用於製備抗腫瘤藥物。
全文摘要
化合物6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯並[g]異喹啉－5,10－二酮二馬來酸酯的脂質體藥物製劑、其製備方法及其應用。
文檔編號A61K47/24GK1382039SQ00814600
公開日2002年11月27日 申請日期2000年10月19日 優先權日1999年10月22日
發明者C·布蓋逖 申請人:諾威斯藥物有限公司