利用微流體設備進行的血小板聚集的製作方法

2023-07-15 04:18:51 2

專利名稱：利用微流體設備進行的血小板聚集的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種便於分析生物樣品中血小板或其前體(progenitor)聚集的設備。該設備誘發導致空間控制血小板聚集(spatially controlled platelet aggregation)的血流局部控制紊亂。本發明還涉及一種使血小板在已知部位聚集以便診斷血小板功能和活性的方法。本發明還涉及一種可控制地調節血小板聚集的速率和程度的方法。本發明的方法尤其用於評估受試者血小板功能方面是否存在異常。該設備還用於在進行藥物治療時測定血小板及其前體的功能和活性。
背景技術：
動脈血栓形成仍然是工業化社會發病率和死亡率的最常見原因。這個過程的核心是在動脈粥樣硬化斑塊破裂的部位過度積累血小板和纖維蛋白，導致血管閉塞，組織梗死 (infarction)禾口器官衰竭。早期動脈粥樣硬化斑塊(advanced atherosclerotic plaque) 突出的凝血潛力取決於多種因子，包括發生病變(lesion)的高含量組織因子、有效的血小板活化基質(即膠原蛋白)的存在以及在動脈粥樣硬化過程中血管腔縮小引起的高剪切應力(shear stress)舌白勺石導(rheological disturbance)是動脈粥樣硬化血栓發生的主要特徵，血流障礙在調節動脈粥樣硬化過程的各個階段中起著重要作用。動脈粥樣硬化病變通常發生在剪切率(shear rate)可以較低且可不均勻流動的動脈分支點或彎曲(即頸動脈竇)處。隨著病變不斷發展，管腔狹窄導致一系列的流動變化，例如剪切梯度、流分離、渦流形成和湍流(turbulence)，每種變化對動脈粥樣硬化過程具有不同的影響。血流的最大變化可發生在血栓形成過程中。隨著血管閉塞的不斷發展， 流量和剪切率可能會達到極限，構成了在血栓形成過程中血栓剪切依賴性增長的潛在的惡性循環。血管損傷部位的血小板聚集對終止出血和後續血管修復來說是非常重要的；然而，過大的血小板聚集反應會導致動脈血栓的發生，促使諸如急性冠脈綜合症和缺血性中風等疾病的發生。越來越多的人贊同流體力學因素(hydrodynamic factors)在血管疾病發病機理中的重要性。然而，仍然不能完全被理解流變加速動脈粥樣硬化過程的確切機制。 血流障礙對血小板的粘附及活化機理產生重大影響，高剪切應力尤其能加速血小板活化和血栓生長。流過管子的流體可歸類為牛頓流體(Newtonian)或非牛頓流體，其中牛頓流體中流體粘度與流體剪切率無關，非牛頓流體中流體粘度可根據流體剪切率發生改變。對於血液來說，細胞成分提供了複雜的粘度分布，可根據流量(flow rate)和血管的幾何尺寸發生變化，因此從定義上講，血液為非牛頓流體。在大多數體外或體內條件下，血流可以被視為流線型(streamlined)或層流型(laminar)，相鄰流體層相互平行移動。對流過對稱血管的牛頓流體來說，血管壁處的流體阻力(fluid drag)導致拋物線流動剖面(parabolic flow profile)的形成，流的中心具有最大流量，血管壁處具有最小流量。作為粘性阻力的結果， 假設的平行血流布局導致在相鄰流體層之間產生剪切應力。局部血流施加的機械剪切應力，特別是在微尺度(microscale)血管狹窄的情況下，是複雜的並與簡單的層(平行)流模型(laminar flow model)存在很大差異。流過狹窄血管的血液在狹窄部位的進入點可能會出現速度降低，穿過狹窄部位時可能出現急劇的流體加速，在狹窄部位的出口會出現回流(flow reversal)和流分離(擴散流線)。這些複雜的流變條件可顯著調節血小板功能。血流影響下的血小板聚集主要取決於表面表達糖蛋白(surface expressed glycoprotein)GPIb/V/IX以及整合素家族成員aIIbi33(GP Ilb-IIIa)的粘附功能。在高或提高的剪切率的條件下，GPrt/V/IX引發可逆的血小板-血小板粘附接觸，而整合素ciIIbi33 穩定形成的聚集體。關於說明書中包含的文件、法案、材料、設備、物品等的任何討論僅僅是為了對本發明提供背景。不能被視為承認任何或所有構成現有技術的一部分，或因為在本申請的每項權利要求的優先權日之前存在，而認為這些內容為本發明相關領域的常識。

發明內容
根據第一方面，本發明提供一種對從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集進行實時監控的微流體設備，該設備包括通道，用於供該生物樣品通過，該通道包括突起部，該突起部用於引起形成與下遊剪切減速區耦合的上遊剪切加速區，並在該上遊剪切加速區與該下遊剪切減速區之間限定剪切率峰值區(region of peak rate of shear)，該下遊剪切減速區限定了血小板聚集區域；以及血小板檢測裝置，用於檢測該生物樣品通過該通道而導致在該聚集區域出現的血小板聚集。當以一定速率泵送所述生物樣品通過所述設備時，其中該速率將初始剪切率限定並限制到生理範圍150s—1 10，000s 1內，所述突起部用於引起10X10V1至150X10V1範圍內的剪切率峰值。所述突起部可用於將初始剪切條件限定並限制在300^-70008-1的範圍內。所述突起部可用於將初始剪切條件限定並限制在450^-3，500s—1的範圍內。所述突起部可用於將初始剪切條件限定並限制在大約1,800s-1。流量可以為非常穩定的、或可以為脈動的或者為變化的流量，以改變血小板聚集的速率和程度。所述突起部包括與通過過所述通道流動的主方向成0°至90°角以限定所述剪切加速區的上遊面，以及與通過該通道流動的主方向成0°至90°角以限定所述剪切減速區的下遊面。更優選地，所述上遊面和所述下遊面分別與通過所述通道流動的主方向成 30°至90°角，更優選與主流向成大約85°角。所述上遊面和下遊面基本上是平面的、凹面的或凸面的。在一個實施例中，所述剪切峰值區由所述突起部和相對的通道壁(oppositechannel wall)之間的間隙寬度限定，該間隙寬度選自10 μ m至40 μ m之間，例如但不限於 15 μ m、20 μ m、25 μ m、30 μ m以及35 μ m。平行於通過所述通道流動的主方向測量的間隙寬度為 0. 5-20 μ m。根據第二方面，本發明提供了一種用於評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的微流體設備，該設備包括通道，用於供該生物樣品通過，該通道具有用於幹擾樣品流動的突起部，該突起部 ^hiIiiMX (cross-sectional dimension) BJM (substantially) /j、T"100it
米，該突起部用於在該通道內限定血小板聚集區域；以及血小板檢測裝置，用於檢測該生物樣品通過該通道而導致在該聚集區域出現的血小板聚集。在第二方面的實施例中，所述突起部可包括位於所述通道內的球狀突起部，所述樣品必須繞該球狀突起部流過。所述球狀突起部位於所述通道寬度的中心，使得基本上等量的該樣品在該球狀突起部的各個面流過。所述突起部或突出可包括位於所述通道內的立柱，所述樣品必須繞該立柱流過。 在這種實施例中，所述立柱可從所述通道的一個壁部分延伸穿過所述通道。在另一實施例中，所述立柱位於所述通道的中心，使得基本上等量的樣品在所述立柱的各個面流過。在第一或第二方面的實施例中，所述設備可設置多個通道，各個通道具有尺寸基本相同的突起部。在這種實施例中，所述檢測裝置可用來檢測所有該通道中所有血小板聚集的總和。在一個實例中，所述多個通道並行設置。當單一樣品被分開並通過所述多個通道的每一個時，本發明實施例具有改善檢測血小板聚集的可靠性的優點。在第一或第二方面的實施例中，可設置多個通道，各個通道具有尺寸基本不同的突起部。在這種實施例中，所述檢測裝置可用來平行檢測該通道陣列中的差別 (differential)血小板聚集。在一個實例中，所述多個通道並行設置。當單一樣品被分開並通過所述多個通道的每一個時，本發明實施例具有改善篩選檢測血小板異常的優點。在第一或第二方面的實施例中，所述通道表面的至少一部分可具有血清蛋白、粘附基質或聚合物，以便增加血小板聚集。在第一或第二方面的實施例中，所述通道的配置和流量適於維持該通道內的雷諾數小於或等於26，以便維持完全穩定的血流，沒有流分離或渦流形成。在一個實施例中，以每分鐘8微升的流量通過直徑20微米的微通道產生0. 86的雷諾數，從而確保在無流動不穩定性或渦流形成的情況下出生減速流動或剪切率增加。可使用能夠檢測並監測血小板聚集的任何檢測裝置。該檢測裝置可根據時間來記錄血小板聚集的圖像。在第一或第二方面的實施例中，本發明進一步結合可能被或不被整合到所述設備、並可用作血小板檢測裝置的光學檢測裝置。該光學檢測裝置包括全內反射傳感器 (total internal reflection sensor)，該全內反射傳感器緊鄰所述通道突起部，以實時監測所述血小板聚集區域中的血小板聚集的。任選地，所述光學檢測裝置可包括光發射器 (light emitter)以及對準光檢測器(aligned light detector)，其中該光發射器用於發出光，以在構成所述通道的材料內進行內反射，這樣該光檢測器檢測到由於血小板聚集區域中血小板聚集引起的內部光反射的變化。任選地，所述光學檢測裝置可包括光發射器以及對準光檢測器，該光發射器用於發出光，以穿過血小板聚集區域傳輸，使得該光檢測器檢測到由與血小板聚集引起的透射光強度的減弱。任選地，所述光學檢測裝置包括光發射器以及對準光檢測器，該光發射器用於發出光，以穿過由多個通道的每一個通道各自的突起部限定的血小板聚集區域，使得該光檢測器可檢測由所有所述通道中全部血小板聚集引起的透射光強度的減弱。所述光學檢測裝置和/或血小板檢測裝置可用於在遠離所述通道側壁的位置觀察血小板聚集，以避免對血小板行為產生側壁效應(side wall effects) 0例如，所述光學檢測裝置和/或血小板檢測裝置可用於在遠離所述通道側壁大約35微米的位置觀察血小板聚集。任選地，所述血小板檢測裝置可包括攝像機。該攝像機可為C⑶攝像機。該攝像機可包括輻射導向設備(radiation direction device)，該設備將來自目標的輻射導向該攝像機的圖像採集元件，例如一個或多個透鏡和/或濾光片和/或反射鏡。所述檢測裝置可包括顯微鏡。所述顯微鏡可通過檢測來自相互作用的目標的輻射(例如可見光)來檢測目標的相互作用。所述顯微鏡可採用明視場模式進行操作，檢測包括可見光的輻射。所述顯微鏡可採用螢光模式進行操作，檢測包括螢光信號的輻射。所述顯微鏡可為落射螢光顯微鏡。所述顯微鏡可包括輻射導向設備，該設備將來自目標的輻射導向所述顯微鏡的圖像採集元件，例如一個或多個透鏡和/或濾光片和/或反射鏡。所述顯微鏡的圖像採集元件可為攝像機。在第一或第二方面的實施例中，所述設備可包括用於製造的塊體材料，該塊體材料內部形成、嵌入或模製一個或多個密封通道。該塊體材料可以選自由聚合物、樹脂、玻璃、 聚碳酸脂、聚氯乙烯或矽組成的組。在一個實施例中，製成所述設備的所述塊體材料是聚二甲矽氧烷(PDMS)、硼矽玻璃、SFll玻璃、SF12玻璃、聚苯乙烯和聚碳酸酯中的一種。在優選實例中，所述塊體材料為 PDMS0如果不希望受理論的約束，一般認為所述塊體材料可結合血液樣品中存在的可溶性蛋白，且所述塊體材料的特性會影響所述微流體設備的有效性。相應地，優選所述塊體材料具有允許可溶性血蛋白與材料結合的特性。所述微流體設備的微通道可以與所述塊體材料的材料相同或不同。在一個實施例中，所述微通道的橫截面直徑小於1000 μ m。在另一實施例中，橫截面直徑在100-200 μ m之間。在又一實施例中，所述微通道的長度在大約3mm至7mm的範圍內，優選從入口至出口大約為5mm ο所述設備可包括防汙阱，位於所述或每個突起部的上遊，以便充分防止各自的通道產生積垢。所述設備可進一步包括「固體載體」(solid support)，該固體載體包括任何具有基本上水平的平面、所述塊體材料可放置在上面的固體結構。在一個實施例中，該固體載體例如可為玻璃(如顯微鏡載玻片等)、聚合物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、纖維素或任意其他光學透明材料。應了解本發明的所述微流體設備可設置為一次性的或可更換的產品或作為系統的一部分。
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根據另一方面，本發明提供了一種對從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集進行實時監控的系統，該系統包括外殼(housing)；根據第一或第二方面的實施例的任一項所述的微流體設備，該微流體設備容納在該外殼中。所述系統可包括與所述微流體設備的一個或多個入口和/或一個或多個出口連接的流體輸送系統。所述流體輸送系統可直接與所述微流體設備的一個或多個入口和/或一個或多個出口連接。任選地，所述流體輸送系統可通過所述外殼的相應入口和/或出口間接與所述微流體設備的一個或多個入口和/或一個或多個出口連接。所述流體輸送系統可用於通過所述微流體設備的所述或每個流道控制流體樣品的流量。與所述微流體設備的出口連接的所述流體輸送系統可為抽吸泵(suction pump)。 與所述微流體設備的樣品入口連接的所述流體輸送系統可為灌注泵、自流餵送器、蠕動泵或任意形式的壓力驅動泵。抽吸泵和壓力泵可為電動泵或手動泵(例如灌注泵)。所述系統可進一步包括將熱量提供給所述微流體設備的加熱器。所述加熱器可設置在或連接到放置所述微流體設備的平臺上。所述加熱器可包括電氣電阻線圈、電阻油墨印刷圖案等。所述加熱器可為電阻加熱器(resistive heater)，該電阻加熱器包括塗敷有導熱粘合劑的蛇形線。所述加熱器能夠將所述微流體設備內的樣品流體的溫度調節到37°C 至60°C，優選約37°C。所述系統可包括軟體，所述軟體集成在所述系統內部，可以控制系統的各個部件， 例如控制放置所述微流體設備的平臺的溫度，控制流體注入所述設備的泵，所述設備內流量的計算，控制攝像機的配置(例如採集參數和圖像處理)。這些控制範圍的每一個都可被模塊化並且可以獨立使用，或結合主控處理器使用。所述系統可包括定位裝置，用以定位所述微流體設備相對於所述檢測裝置的位置。所述光學檢測裝置可進一步結合記錄血小板聚集的裝置。當所述檢測裝置記錄圖像時，可記錄不同時間點的多張圖像以便確定在所述微流體設備中實時觀察到的血小板聚集程度。通過利用彩色或螢光標記物標記生物樣品中的目標，可提高目標的可視化，更容易確定血小板的聚集。因此，所述方法可包括將彩色或螢光標記物與生物樣品混合的步驟。 該步驟可以在所述生物樣品進入所述通道之前、過程中或之後進行。例如，生物樣品可以在下列位置與彩色或螢光標記物混合在生物樣品被引入樣品入口之前在所述設備外；在樣品入口和流動腔(flow cavity)之間(例如在入口和流動腔之間的通道內設置的混合井中)。根據本發明，可使用的合適的螢光標記物的實例包括例如長鏈碳花青、如Dil、 DiO及其類似物。具體實例包括由hvitrogen製備的親脂性碳花青DilC18、DiIC6, DiOC18, DiOC6以及由Sigma製備的膜探針。其他適用於本發明的膜探針為本領域的技術人員所熟知。顯現含有螢光標記的目標時，所述方法可包括將來自激發輻射源(excitation radiation source)的輻射照射到標記的血小板上以激發螢光標記的步驟。輻射可通過合適的感光濾光片照射到血小板上。激發輻射源例如可為藍色發光源，如二極體或其他合適的光源。所述檢測裝置可包括發射光濾光片(emission filter)，定位於使所述光源到達所述設備之前引導輻射從該發射光濾光片通過。根據第三方面，本發明提供了一種實時評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的方法，該方法包括使生物樣品按照一定速率通過特定通道，該速率使該通道幹擾該樣品的流動，並因此引起形成與下遊剪切減速區耦合的上遊剪切加速區，並在該上遊剪切加速區與該下遊剪切減速區之間限定了剪切率峰值區，該下遊剪切減速區限定了血小板聚集區域；以及檢測由於該生物樣品通過該通道而在該聚集區域發生的血小板聚集。所述特定通道被理解為包括與第一方面、第二方面或實施例的任何一個相關的突起部。本發明還提供了一種用於評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的方法，該方法包括使該生物樣品通過通道，該通道具有用於幹擾樣品流動的突起部，該突起部的至少一個橫截面的尺寸明顯小於100微米，該突起部用於在該通道內限定血小板聚集區域; 以及檢測由於該生物樣品通過該通道而在該聚集區域發生的血小板聚集。本發明還提供了一種用於評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的設備，該設備包括通道，用於供該生物樣品通過，該通道用特定方式幹擾樣品的流動，以便在該樣品以合適的流量通過該通道時誘導形成該樣品中的高剪切區域，以及在該高剪切區域下遊的負剪切梯度區域中誘導形成血小板聚集區域；以及血小板檢測裝置，用於檢測由於該生物樣品通過該通道而在該聚集區域發生的血小板聚集。本發明還提供了一種用於評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的方法，該方法包括使該生物樣品按照一定速率通過特定通道，該特定速率使該通道具有幹擾該樣品流動特徵，以誘導該樣品中形成的高剪切區域以及在該高剪切區域下遊的負剪切梯度區域中誘導形成血小板聚集區域；以及檢測由於該生物樣品通過該通道而在該聚集區域發生的血小板聚集。在本發明的某些實施例中，樣品灌注之前，脫氣臺氏緩衝液(Turodes buffer) (4. 3mM K2HPO4,4. 3mM NaHPO4, 24. 3mM NaH2PO4,113mM NaCl，5. 5mM D-葡萄糖，ρΗ7· 2)用於灌注所述通道，用於除去所有氣泡，該臺氏緩衝液加熱至45°C。所述突起部或突出可包括部分阻塞所述通道的屏障。在該實施例中，該屏障和相對的通道壁之間的間隙優選大約在0. 5-40微米之間。平行於通過所述通道流動的主方向(dominant direction)測量的間隙寬度優選為0. 5-20微米，更優選約為15微米，並優選配置為在合適流量下產生大約20，000s—1的剪切條件。然而應了解剪切率峰值基本上在10，OOOs-1至150，OOOs-1的範圍內或更大。輸入通道優選配置為在間隙的上遊產生大約 I1SOOiT1的剪切條件。屏障優選包括與通過所述通道流動的主方向成30°至90°角的上遊面。屏障優選進一步包括與通過所述通道流動的主方向成30°至90°角的下遊面。所述上遊面和下遊面基本上是平面的、凹面的或凸面的。在一個實施例中，所述設備進一步包括容納生物樣品的入口或小孔(aperture) 以及出口。入口和出口位於微毛細管或與之相連的微通道的任一端。本文涵蓋的標準流量(typical flow rate)涉及構成被提出存在於體內血管系統的流量所需的範圍。一般來說，通過微毛細管或微通道的生物樣品的流量在500-0. 5微升 /分鐘的範圍內，例如可以在2-42 μ 1/min的範圍內。本發明還提供了一種用於檢測或評估患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性疾症或障礙性疾病或具有患該疾病風險的受試者的診斷方法；該方法與本發明的微流體設備相結合。本發明還提供了一種診斷患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性症狀或障礙性疾病或具有患該疾病風險的受試者的診斷方法，該方法包括i)從受試者獲得生物樣品；ii)在確定的流條件(defined flow condition)下且在來自該生物樣品的細胞足以發生聚集的時間內，使該生物樣品通過根據本發明的設備；iii)檢測該細胞的聚集；以及將該生物樣品細胞聚集的時間和聚集體的大小與預定標準作比較，其中任何變化都表示患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性疾症或障礙性疾病或具有患該疾病的風險。 在本發明的一個實施例中，所述方法可用於診斷血栓形成和溶解、心血管疾病、由疾病和藥物引起的止血機制變化、血小板功能障礙和受體異常、藥物治療敏感、出血病症如血管性血友病或維生素K缺乏症、狹窄症、糖尿病、凝血功能障礙、中風、血小板功能紊亂如血小板無力症、巨大血小板綜合症以及貯存池病(Storage Pool Disease)。利用「血小板功能或活性異常」，它指的是與血小板粘附、血小板聚集、血小板易位 (translocation)、血小板速率(velocity)、血小板形態以及血栓穩定性相關的任何活性或缺陷。該術語還旨在包括血小板脫粒以及細胞質顆粒釋放的任何缺陷。該術語還旨在包括影響血小板功能的細胞質因子(plasma factor)的異常。本發明領域的技術人員應了解各種血小板缺陷。本發明還提供了一種用於判斷或評估試劑對生物樣品中血小板或其前體聚集的調節作用的方法，該方法包括i)在確定的流動條件下且在足以判斷在本發明的微流體設備內是否發生血小板聚集的時間內，並在該試劑存在的情況下，使該生物樣品通過該設備；以及ii)將步驟(i)中獲得的結果與在該試劑不存在的情況下進行步驟(i)的結果作比較。應了解本發明的設備和方法可用於評估用抗血小板藥物治療的受試者體內抗血小板藥物的有效性。該受試者包括利用介入心臟病學導管插入術治療的受試者。介入心臟病學導管插入術包括血管造影術、血管成形術和支架植入術。此外，所述設備可用於監測接受人工心臟瓣膜的患者體內的抗血小板藥物的有效性。本發明的設備和方法可用於評估服用藥物防止心血管事件，例如冠狀動脈血栓形成(心臟病)、肺動脈栓塞、中風或由過度血小板活性引起深靜脈血栓的形成的患者體內阿斯匹林或其它抗血小板藥物的有效性。本發明的設備和方法還可用於診斷受試者是否有失血過多的危險。例如，在外科或牙科手術之前該測試是必須的。例如，所述方法可用於在患者拔牙或拔掉智齒之前確定是否有失血過多的危險。本發明還提供了本發明的微流體設備在診斷患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性症狀或障礙性疾病或具有患上該疾病的風險的受試者的方法中的用途。根據一個實施例，在通過所述設備進行灌注之前，可將試劑添加至生物樣品。或者在從受試者獲取生物樣品之前，可將試劑施加給受試者。在另一實例中，試劑可施加到微通道的壁上，這樣在樣品通過所述設備的微通道時，該試劑被添加到該生物樣品中。例如，對從服用抗血小板藥物氯吡格雷(clopogrel)的患者取得的血液樣品來說，利用試劑P2Y1 (ADP)受體拮抗劑MRS2179對生物樣品進行預處理，以便使系統對氯吡格雷(clopidogrel)的作用敏感。本領域的技術人員應了解，在通過微流體設備進行灌注之前選擇適當劑量的試劑對樣品進行預處理。預處理過程中使用的抑制劑濃度可由下面的方法確定響應於將外源ADP加入該血小板樣品的標準化血小板聚集試驗(standardised platelet aggregometry)、基於通過將外源ADP加入該血小板樣品引起的血小板整合素α IIb β 3活化的螢光激活細胞分類術、或微流體設備本身的多種重複中的劑量響應測量法(dose respose measurement)0本發明還提供了一種對利用試劑療法的受試者的治療進行監測的方法，該方法包括(i)在確定的流條件下且在足以判斷在本發明的設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自該受試者的第一生物樣品通過該設備，該第一生物樣品在給該受試者施用該試劑之前獲得；以及(ii)在確定的流動條件下且在足以判斷在本發明的設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自該相同受試者的第二生物樣品通過該設備，該第二生物樣品在給該受試者施用該試劑之後獲得；以及(iii)將步驟(i)中獲得的結果與步驟(ii)中獲得的結果作比較。在根據本發明的另一實施例中，第一樣品和第二樣品都是在對受試者施用試劑後獲得的，以便隨時監測該試劑的作用。例如，該第二生物樣品可在第一樣品後規定的時間段提取，例如，1天後、5天後、1周後、1個月後、4個月後，以便逐步監測患者的治療。相應地，本發明還提供了一種用於對使用試劑療法的受試者的治療進行監測的方法，該方法包括(i)在確定的流條件下且在足以判斷在本發明的設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自受試者的第一生物樣品通過該設備，該第一生物樣品在給該受試者施用該試劑的第一劑量之後獲得；以及(ii)在確定的流動條件下且在足以判斷在本發明的設備內是否發生血小板聚集時間內，使來自該相同受試者的第二生物樣品通過該設備，該第二生物樣品在給該受試者施用該試劑的第二劑量之後獲得；以及(iii)將步驟(i)中獲得的結果與步驟(ii)中獲得的結果作比較。通過試劑療法後隨時比較血小板聚集行為，臨床醫生有可能減輕給受試者施用的試劑的劑量，並作出準確判斷是否停止該試劑治療或是否改變所施用的試劑。本發明還提供了根據本發明的設備監測受試者抗血小板治療的用途。在一個實例中，所述設備可用於識別具有阿司匹林和氯吡格雷的「抗藥性」或治療失敗的其他表現的受試者。術語「足以判斷是否發生血小板聚集的時間」是生物樣品流過所述設備的一段時間，這段時間為本發明領域的技術人員所熟知。在一個實例中，時間段至少為10分鐘左右。 在另一實例中，至少為20分鐘左右。本發明還提供了一種根據本發明的微流體設備監測生物樣品中血小板功能和/ 或活性的用途。例如，所述設備可用於篩選以及作為血小板分離和製備的質量控制形式，該質量控制形式用於對患有血小板相關性出血病症的患者的臨床治療(例如輸液)。所述設備還可用於在血小板輸注產品在向患者施用之前評估其可行性和有效性。所述設備還可用於評估血小板在長期存儲後的存活率(viability)和有效性。本發明還提供了根據本發明的微流體設備用作出血病症篩選裝置的用途。在一個實例中，從受試者獲得的生物樣品可利用一種或多種血小板抑制劑進行預處理，並通過該微流體設備的多個限定的幾何體，在該設備中觀察到的血小板聚集程度可能與出血病症相關。所述設備可用於確定先天性(例如血管性血友病(von Willebrand'disease))和獲得性出血缺陷(例如藥物，獲得性血小板病(acquired thrombocytopathies))中出血的原因。先天性出血病症可包括下列疾病-血管性血友病、血小板無力症、巨大血小板綜合症、斯科特綜合症；- α -顆粒缺陷，例如灰色血小板綜合症、魁北克血小板綜合症(Quebec Platelet)、α -SPD (存儲池缺陷)、α，δ -SPD ；-緻密顆粒缺陷，例如赫曼斯基-普德拉克綜合症、塞迪埃克-東綜合症、格裡塞利綜合症、δ -SPD ；-細胞骨架缺陷，例如威斯科特-奧爾德裡奇綜合症以及相關巨大血小板綜合症。所述設備還可用於評估病人間對藥物反應的差異，且可用於識別出血高風險患
者ο本發明還提供了根據本發明的微流體設備用於分析兒科受試者出血病症的用途。 例如，所述設備可用於篩選患者中的新生兒和兒科人群，其中只有少數血液樣品可用。在另一實例中，所述設備可用於檢測患顱內出血風險的嬰兒和/或新生兒。所述設備可用於確定出血是否主要與血小板功能障礙有關。在本發明其他實施例中，本發明結合範圍並行在6-300幾何變異之間的不同幾何體陣列作為第一通過測定設備(first assay device)。廣譜陣列的結果然後用於限定一組特定幾何體，該特定幾何體最適合於有問題的血小板樣品。這被視為校準步驟，重點在於對一部分幾何體的測定。所述設備的陣列形式在高通量篩選方案(protocol)中比較實用。
相應地，本發明還提供了本發明的微流體設備用作抗血小板治療藥物開發的實驗高通量篩選工具的用途。在一個實施例中，利用一系列小分子或多肽抑制劑處理多種血小板樣品，並使該樣品通過該微流體設備進行分析。這樣，可從大型化合物庫迅速有效地識別新型抗血小板藥物。分析具有抗血小板活性的分子或多肽，並與通過定義的一系列微通道幾何體灌注的未處理的對照樣品作比較。本發明還提供了一種用於高通量篩選多種候選抗血小板化合物的方法，該方法包括(i)將從受試者獲得的至少一種生物樣品與該多種候選抗血小板化合物的至少第一種化合物(member)接觸；(ii)在確定的流動條件下且在足以判斷在根據本發明的微流體設備內是否發生血小板聚集的時間內，使該至少一種樣品通過該設備；(iii)檢測該多種候選抗血小板化合物的該第一種化合物對該至少一種生物樣品的血小板聚集的影響；以及(iv)將步驟(iii)中觀察到的影響與不與該候選化合物接觸的對照樣品作比較。本發明領域的技術人員應了解，所述候選抗血小板化合物可包括可檢測的標記組，便於檢測和觀察設備中的血小板聚集。同樣應了解上述高通量篩選方法的優點在於篩選來自轉基因動物(如轉基因小鼠)的多種血小板樣品是否具有剪切依賴性(shear dependent)血小板缺陷的篩選工具。 所述設備的高通量陣列形式快速篩選來自經重整或化學突變的小鼠的大量樣品是否具有血小板缺陷。所述方法還可用於篩選大量轉基因小鼠的樣品。本發明還提供了一種新型抗血小板試劑，通過高通量篩選法獲得的所述試劑包含根據本發明的微流體設備。本發明還提供了一種用於監測血小板功能的試劑盒，該試劑盒包括包裝材料，該試劑盒還包括⑴根據本發明的微流體設備；以及(ii)用來說明該微流體設備在監測血小板功能的系統中如何使用的說明書。提出的實施例發現到局部剪切微梯度(local shear microgradient)促使剪切減速區發生血小板聚集，該剪切減速區緊接高剪切加速區。因此，該剪切加速區之後接著便是與之緊密耦合的剪切減速區(剪切梯度)，是有助於穩定的血小板聚集體發展的環境。


現在參照附圖對本發明的實例進行描述，其中圖1為總體示出了通過限定血小板聚集區域的球狀突起部的樣品流動的示意圖；圖加為血管損傷處及其下遊血小板聚集的顯微序列(micrograph sequence)，圖 2b和圖2c為血管損傷周圍三個區域中血小板聚集的程度，圖2d為根據剪切率的血小板聚集的程度；圖3a為一系列差分相差圖像，圖北包括掃描電子顯微圖像，每張圖像為血小板系鏈；圖如為根據本發明一個實施例的具有屏障的通道的總體透視圖，圖4b為本發明某些實施例中選擇的可變通道參數的頂視圖，圖4c為根據本發明第二實施例製造的設備的顯微照片；圖fe為根據本發明實施例製造的具有屏障臺階幾何微通道的塊體材料的截面端視圖，圖恥為圖fe的塊體材料通道部分的放大部分端視圖，圖5c為圖fe和圖恥的塊體材料的頂視圖，以及圖5d為圖的塊體材料的放大部分頂視圖；圖6a為本發明實施例，其中突起部包含通道的包含球體，圖6b_6d為這樣的球狀幾何體的變形；圖7a為根據本發明另一實施例的製造有球狀幾何微通道的塊體材料的截面端視圖，圖7b為圖7a的塊體材料的通道部分的放大部分端視圖，圖7c為圖7a和圖7b的塊體材料的頂視圖，圖7d為圖7a_7c的塊體材料的放大部分側視圖，以及圖7e為圖7a_7d的塊體材料的放大部分頂視圖；圖8為本發明的一個實施例，其中突起部包括通道內的立柱；圖9a為根據本發明另一實施例的製造有立柱幾何微通道的塊體材料的截面端視圖，圖9b為圖9a的塊體材料的通道部分的放大部分端視圖，圖9c為圖9a和圖9b的塊體材料的頂視圖，圖9d為圖9a_9c的塊體材料的放大部分側視圖，圖9e為圖9a_9d的塊體材料的放大部分頂視圖；圖IOa為聚二甲矽氧烷(PDMS)塊體材料的透視圖，其內部根據本發明實施例製造了微通道設備，圖IOb為差分幹涉相差圖像，示出了並行陣列配置中設備設計的幾種物理實施例，圖IOc為PDMS塊體材料的頂視圖，其內部根據本發明另一優選實施例製造了微通道設備；圖Ila-Ile為在本發明第一實例中獲得的結果；圖12a_12e為在本發明第二實例中獲得的結果；圖13⑴和13(ii)都有圖像(a)_圖像(f)，分別為本發明第三實例中獲得結果的彩色及黑白圖像；圖1 為未抑制的全血在三種通道微觀幾何體中的血小板聚集，其中三種通道微觀幾何體的擴張角b各不相同，分別為90度、60度和30度；A = c90e90g20wl5100-700 μ m 幾何體，B = c90e60g20wl5100-700 μ m 幾何體，以及 C = c90e30g20wl5100_700 μ m幾何體；圖14b為經抑制劑處理的全血在三種與圖14a中相同的幾何體中的血小板聚集； A = c90e90g20wl5100-700ym 幾何體，B = c90e60g20wl5100-700 μ m 幾何體，以及 C = c90e30g20wl5100-700 μ m 幾何體；圖為選擇的臺階幾何體應變率以及加速度分析；圖16a_16d為承受側壁壓力的代表性小鼠腸繫膜微動脈的結構及CFD模擬結果， 圖16e-16f 為對應於圖16a-16d的黑白圖；圖17描述了三種選擇的對稱微通道設計案例；圖18(i)和圖18(ii)中的每個表示圖像(a)-(d)分別示出了腸繫膜微動脈和 c60g20e60模擬血管中計算的應變率分布的彩色及黑白圖像；圖19(i)和圖19(ii)中的每個表示圖像(a)-(d)分別示出了該設備的流體動力學性能的彩色及黑白圖像；圖20a和圖20b分別表示實時落射螢光圖像顯示聚集的彩色及黑白圖像；
圖21a_21b表示對稱修改微通道幾何體的收縮角和擴張角的一系列測試用例實驗，圖21c-21d表示對應於圖21a-21b的黑白圖；圖22為包含c85g30e85100-100 μ m幾何體的微流體設備中抗血小板抑制劑作用的比較；圖23為包含c85g30e85100-100 μ m幾何體的微流體設備中正常健康供體樣品與血管性血友病患者樣品進行比較；圖M為在包含cX g20e85100-100 μ m幾何體的微流體設備中比較減小的收縮角對血小板聚集反應的影響，其中cX =收縮角；圖25為在包含c85g20eX 100-100 μ m幾何體的微流體設備中比較減小的擴張角
對血小板聚集反應的影響，其中eX =擴展角；圖沈為分析了在包含c75gX e75100-100 μ m幾何體的微流體設備中間隙寬度對血小板聚集反應的影響，其中gX =可變間隙寬度；圖27為分析了在包括c75g20e75100-100 μ m幾何體的微流體設備中間隙長度對
血小板聚集反應的影響。
具體實施例方式本發明人確定了血液流變學(blood rheology)的突然改變在血管損傷部位引發血小板聚集以及血栓生長方面的重要作用。尤其是，本發明人已經表明微尺度的剪切梯度在誘導盤狀血小板(discoid platelet)聚集方面的關鍵作用，聚集體的穩定依賴於獨特的膜粘附結構(稱為膜系鏈重組(membrane tether restructuring))的形成。因此，響應於局部剪切微梯度，發展中的血栓主要由盤狀血小板構成，可溶性血小板激動劑，例如凝血酶、ADP以及TXA2的生成在穩定形成的聚集體方面起著次要作用。這些新發現對長期認為可溶性激動劑的生成是血小板聚集和血栓生長的主要因素的觀點提出了質疑。圖1為總體示出了通過限定血小板聚集區域的球狀突起部的樣品流動的示意圖。 WM &^^tkMM (shear gradient-depedent platelet aggregation,
S.G.A)的工作模型，用以支持下文中進一步描述的微剪切梯度技術。由血管壁幾何尺寸的改變或部分管腔阻塞(即形成血栓)引起的局部血流障礙構成了局部剪切梯度，其特徵為剪切加速的狹窄區域，之後是剪切減速的緊密耦合區域(tightly coupled zone) 0沿著與剪切加速區相交路線流動的盤狀血小板在剪切峰值(peak shear)區域(區域幻形成絲狀膜系鏈交互(filamentous membrane tethering interaction)。隨後血小板轉運至Ij減速剪切區域(區域3)，導致膜系鏈活性(Ca2+-依賴型)重組，特徵在於整體系鏈增厚，粘附力增強。持續的盤狀血小板補充以及系鏈重組促進了血管損傷部位下遊的穩定盤狀聚集體和血栓的生長。圖加為發生在小鼠腸繫膜動脈壁有化學損傷的部位上，盤狀血小板聚集的代表性微成像序列(micro-imaging sequence) 0注意，不斷生長的血小板聚集體名義上已被分割成上遊象限(upstream quadrant)(區域1)，橫向象限(lateral quadrant)(區域2)以及下遊象限(downstream quadrant)(區域3)。黑箭頭表示化學處理引起的病變。白箭頭表示觀察到初始血小板補充的點。白色虛線限定盤狀血小板聚集體的外部邊緣。比例尺為 5 μ m。圖2b為體外血小板血栓表面的不同剪切區域(區域1、2和3)中的盤狀血小板凝聚
17壽命的圖(n = M次實驗)。注意，凝聚壽命在較低剪切區域(區域幻中顯著變大。圖2c為體外體內發展中的小鼠血栓的不同剪切區域(區域1、2和3)內盤狀血小板系鏈的相對分數的圖。體外血栓(in vitro thrombi)-體外血栓表面上的凝聚頻率 (cohesion frequency) (η = M 次實驗)；體內血栓(in vivo thrombi)-C57B 1/6 野生型小鼠的體內血栓表面上的凝聚頻率；ADP、TXA2拮抗劑+水蛭素(體內)_ 口服200mg/kg阿司匹林、50mg/kg氯吡格雷(clopidogrel orally) +靜脈注射50mg/kg水蛭素的P2Y1+小鼠的體內血栓表面上的凝聚頻率(n = 14)。注意，血小板補充的主要區域在減速區域(區域3)內。圖2d為根據應用的體積剪切率(bulk shear rate) ( γ ) [η = 3]，體外預成型的血小板單層表面上盤狀血小板凝聚壽命的圖。該數據集表示利用系鏈形成的血小板補充在剪切率為300s—1或以下時是最有效的，該剪切率接近體內外血栓的區域3中發現的值。總的來說，該數據集表明其餘盤狀血小板粘附和凝聚互動對發生在體內外血栓下遊面的剪切減速區敏感。這是基礎觀察，構成設備設計的生物學基礎，並刊登在Nesbitt W. S.等"A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation". Nat Med. 2009Jun ； 15 (6) :665_73。圖3a為一系列差分相差圖像(differential contrast image)，圖3b包括掃描電子顯微圖像，每張圖像為根據微剪切梯度應用的血小板動態結構重組。圖加為表示血栓下遊面的動態血栓系鏈行為的差分幹涉相差(DIC)成像，該血栓預形成在固定的1型纖維膠原蛋白上(應用的體積剪切率=1800. s—1)[比例尺=2μπι]。白色選取框突出顯示了盤狀血小板系鏈的發展初始血小板相互作用導致了短系鏈的形成(IMsec)，該短系鏈迅速變粗(161-188seC)產生接近盤狀體(白色箭頭191seC)的球狀膜結構。圖2b為盤狀血小板掃描電子顯微鏡(SEM)成像(以300. s—1的速率流動)[比例尺=Iym],展示了在粘附到展開的血小板單層表面的過程中的絲狀重組膜系鏈。識別新型剪切梯度依賴性血小板聚集機制的研究開發出了微流控流設備 (microfluidics-based flow device)，該設備利用時間剪切梯度來誘導血小板聚集和血栓生長。圖4a4c分別為具有臺階幾何體(st印geometry)的微剪切梯度設備 (micro-shear gradient device)的示意圖。圖如為微剪切梯度設備的示意圖，描述了臺階幾何配置的總原理。血液樣品通過微剪切梯度室從左至右進行灌注。樣品與微尺度臺階幾何體的相互作用導致屏障上的初始剪切加速度，緊接著是屏障和臺階下遊處的緊密耦合減速階段，這樣促使在聚集區域內盤狀血小板的聚集。圖4b為在該實施例中，臺階幾何體由 6個主要參數限定i.流入通道寬度(100-1000 μ m)，將初始血液剪切率限定並限制到生理範圍(150-10，OOOiT1) ；ii.內流角或收縮角(Θ。)，範圍在0°至90°之間(更優選地，30° 至90° )，限定血流加速速率；iii.臺階間隙高度，範圍在ΙΟμπι至40μπι，限定加速階段後的剪切峰值；iv.擴張角(θε)，範圍在0°至90°之間(更優選地，30°至90° )，將血流減速臨界速率限定至擴張幾何體(expansion geometry)，限定血小板聚集區域；v.擴張通道寬度，範圍在100-1000 μ m之間，限定減速階段大小；以及vi.間隙寬度，範圍在0. 5-20 μ m 之間，限定突起部的寬度。圖4c為製造的微剪切梯度設備的顯微照片(40倍的放大倍率)， 該設備由IOOym流入寬度、Θ。= 90°、10 μ m間隙高度、θ e = 30°以及700 μ m擴張寬度組成(圖中僅部分可見)。圖5a_5d分別示出了具有圖4中描述類型的臺階幾何體的微剪切梯度設備的示意圖。圖fe和圖恥為微通道聚二甲矽氧烷(PDMS)塊體材料(block) 500的橫截面視圖，示出了矩形微通道510的位置和尺寸。圖5c為具有臺階幾何體的微通道設備500的頂視圖， 示出了直徑為16mm的入口 520以及直徑為2mm的出口 522。圖5d為塊體材料500的臺階幾何體的詳細頂部示意圖，示出了相對於微通道512的臺階幾何體的位置。如圖5d所示， 入口 520的流入通道(feed channel) 516寬725微米，微通道512寬100微米，臺階屏障 (barrier of st印)514在微通道512的下遊端保留寬度在10-40 μ m之間的間隙，流出通道518寬在100-1000微米的範圍內。臺階屏障514的上遊面與流動方向呈現角度Θ。，該角度Θ。為0-90度之間(更優選地，30°至90° )選取的角；臺階屏障514的下遊面呈現角度θε，該角度Qe為在0-90度之間(更優選地，30°至90° )選取的角。圖6a_6d為其中使用球狀幾何體的微剪切梯度設備的實施例。圖6a為微剪切梯度設備的示意圖，示出了球狀幾何配置的總體原理。箭頭610表示血液樣品從左至右進行灌注通過微剪切梯度室612。樣品與微尺度臺階幾何體614相互作用導致接近球體614 上遊的橫向和軸向剪切加速度，接著導致接近球體614下遊的緊密耦合的減速階段，後者促使球狀幾何體614下遊面的盤狀血小板聚集。球狀幾何體由兩個主要參數限定i.通道寬度(100-200 μ m)，根據流量限定並限制初始血液剪切率；以及ii.球體直徑，範圍在 0. 5-100 μ m之間，該球體直徑限定了球體進入基本為層流剖面(laminar flow profile) 的峰值流量區域的穿透能力，並限定了剪切梯度的大小、空間分布以及變化率。圖6b-6d描述了可能出現在本發明的選擇性實施例中的球狀幾何體的總體變化。這些三維幾何體或特徵可有下述變化半球體(例如圖6 (b)中所示的624)，更像是原位血栓形狀的淚珠形狀 (tear drop shape)(例如圖6(c)所示的634)，和/或具有不同拱度的凸形(例如圖6(d) 所示的644)。圖7a_7d為根據本發明另一實施例的聚二甲矽氧烷(PDMS)塊體材料700的示意圖，該塊體材料700中製造有具有球狀幾何微通道的微剪切梯度設備。圖7a和7b給出了微通道塊體材料700的截面視圖，示出了矩形微通道710的位置和尺寸。圖7c為具有球狀幾何體的微通道設備700的頂視圖，示出了直徑為16mm的入口 720以及直徑為2mm的出口 722。圖7d和圖7e分別給出了球狀幾何體714的詳細側視圖和頂視圖，示出了相對於微通道712的球狀幾何體714的位置。如圖7d所示，微通道712高100-200微米，球體714保留有寬度在50-99. 75微米之間的頂上間隙(overhead gap)，以及流出通道718高為100-200 微米。球體714直徑在0. 5-100微米之間。如圖7e的頂視圖所示，球體714位於通道712 底部的中央，保留有在50-99. 75微米範圍內的相同大小的側間隙。微通道712上遊的流入通道716寬725微米。圖8為本發明的一個實施例，其中突起部包括通道812內的立柱(post)814。箭頭 810表示血液樣品通過微剪切梯度室812從左至右進行灌注。樣品與微尺度立柱幾何體814 的相互作用導致接近立柱814上遊和其周圍的橫向剪切加速，接著導致立柱814周圍和接近其下遊的緊密耦合的減速階段，後者促使立柱幾何體814下遊面的盤狀血小板聚集。這樣的立柱幾何體由三個主要參數限定i.通道寬度(100-200 μ m)，根據流量限定並限制初始血液剪切率；ii.立柱高度，範圍在0. 5-100 μ m之間，限定立柱進入大致層流剖面的峰值流量區域的穿透能力；以及iii.立柱直徑，範圍在0. 5-100 μ m之間，限定剪切梯度的大小、 空間分布以及變化率。圖9a_9e為根據本發明另一實施例，具有立柱幾何體的微剪切梯度設備900的截面示意圖。圖9a和圖9b為微通道塊體材料900的截面視圖，示出了矩形微通道912的位置和尺寸。圖9c為具有立柱幾何體的微通道設備900的頂視圖，示出了直徑為16mm的入口 920以及直徑為2mm的出口 922。圖9d和圖9e分別為立柱幾何體的詳細側視圖和頂視圖，示出了相對於微通道912的立柱914的位置。如圖9d所示，微通道912高100-200微米，立柱914保留有50-99. 75微米之間的頂上間隙，以及流出通道918高為100-200微米。 立柱914直徑在0. 5-100微米之間，高度為0. 5-100微米之間。如圖9e的頂視圖所示，立柱914位於通道912底部的中央，保留有在50-99. 75微米範圍內的相同大小的側間隙。微通道912上遊的流入通道916寬725微米。圖IOa示意地示出了根據本發明實施例的微流體設備。該微流體設備為一次性暗盒(cartridge)的形式，包括三層第一外層(未示出)、第二外層1008以及製作的插入層 (fabricated interposed layer) 1000。該暗盒可位於多用外殼(未示出)內。組合插入層1000具有兩個微製造流道100 和1002b，兩個流道除特殊的入口和出口幾何體外是相同的。微通道100 和1002b形成在聚二甲矽氧烷(PDMS)內，塊體材料抵靠在蓋玻片1008上，密封各微通道。微通道100 和1002b的各端分別是入口 1004和出口 1006。每一通道100 和1002b由5mm長的具有矩形橫截面的通道組成，其中心引入不對稱臺階或突起部。臺階幾何體由六種參數限定，即i)流入通道寬度(100-1000μπι)，將初始血液剪切率限定並限制到生理範圍 (150-10，OOOs-1)；ii)內流角或收縮角(9。)，範圍在0°至90°之間(更優選地，30°至90° )，限定血流加速率；iii)臺階間隙高度g，範圍在10 μ m至40 μ m，限定加速階段後的剪切峰值；iv)擴張角(θε)，範圍在0°至90°之間(更優選地，30°至90° )，將血流減速臨界率限定至限定血小板聚集區域的擴張幾何體；ν)擴張通道寬度，在100-1000 μ m之間，限定減速階段的大小；以及vi)間隙寬度，範圍在0.5-20 μ m之間，限定突起部或屏障的寬度。微通道的製造採用標準軟光刻技術(soft-lithography techniques)，將微通道100 和微通道1002b製造在3英寸矽片上的PDMS (Sylagard，來自KMPR 1025光阻劑(microChem Corp, 微化公司)模具)中(ffeibel, D. B.，Diluzio, W. R. &ffhitesides, G. Μ. Microfabrication meets microbiology. Nature reviews 5, 209-218 (2007)) 採用高解析度鉻掩模(chrome mask)獲得明確的特徵，來製造模具。為了獲得具有良好均勻性的130μπι厚的膜，使用 300rpm 和 IOOrpm 的傳播周期(spread cycle)十秒，IOOOrpm 和 300rpm 的研製周期 (development cycle)三十秒，在 4 英寸矽片上旋壓覆蓋 KMPR 1025 (microChem Corp)光阻劑。利用邊緣珠粒去除溶劑(edge bead removal solvent)進行一個循環的邊緣珠粒去除，時間為三十秒。從23°C開始通過每分鐘將溫度升高6°C對塗覆有KMPR的晶片進行軟性烘烤處理，100°C時保持四分鐘，使溶劑幹透。在波長為360nm、功率為8mW cm_2的MJB3接觸式掩膜對準器(contact mask aligner)上，將掩膜圖案(mask pattern)與KMI3R膜一起在紫外線下曝光兩分鐘，一分鐘曝光兩次，以免基板(substrate)過熱。曝光後，在100°C (從 23°C開始每分鐘將溫度升高6°C)在加熱板上烘烤四分鐘，使圖案交聯。加熱板上的樣品與曝光並交聯的膜一起緩慢冷卻至室溫，以免對膜產生熱應力並避免由於溫度突然改變可能引起的裂縫。曝光後的KMI3R顯影(develop) 12分鐘(定期攪拌)，以除去未曝光的材料。 KMPR圖案顯影后，利用異丙醇和DI水清洗晶片，將樣品加熱至120°C處理三小時進行最終的硬性烘烤處理，以便提高並加強交聯的KMPRO圖案。然後，KMPR圖案可用作澆鑄PDMS通道的模具。一旦製成模具，PDMS及其固化劑 (curing agent)按照10 1的比例進行定量混合，並脫氣(degass)處理三十分鐘。混合物澆入先前製造並盛在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)膜的的KMI^R模具中。然後在烤箱中100°C 對PDMS進行二十分鐘固化處理。從KMI3R模具上剝下PDMS通道，利用活檢穿孔器(biopsy punch)做出6mm的蓄存室入口孔(inlet reservoir hole) 1004。使用2mm活檢穿孔器將出口連接至灌注器(syringe)和泵。打完兩個孔後，直接將PDMS通道放置到65x22mm的載玻片1004上。由於PDMS的低表面能，實現粘附。第一外層包括6mm厚的PDMS細長板(elongate plate)，該板加工成匹配插入層 1000的尺寸。第一外層設置有包括進樣通道(sample inlet passage)和進樣口(sample inlet port)的樣品入口(sample inlet)。樣品輸入通道通過第一外層。樣品入口由第一外層的外表面中的樣品輸入通道限定。樣品輸入加工為穿過第一外層並輕敲入M5配件，以便將暗盒迅速連接至流體輸送系統。第一外層進一步設置有包括出樣通道和出樣口的出通過將第一層壓制在插入層1000上並利用壓敏膠粘劑將兩者粘貼，來裝配暗盒。 對暗盒定向，使得第一外層形成頂層，蓋玻片1004形成暗盒的底層。裝配時，第一外層的樣品輸入通道分別與插入層的入口 1004對準。同樣地，第一外層的樣品輸出通道分別與插入層的出口 1006對準。因此形成的暗盒可限定流道100 和流道1002b。因此形成的流道基本上沿直線運轉，分別在第一端與樣品入口 1004連接，在第二端與出口 1006連接。在使用設備的過程中，將來自受試者的血液樣品或細胞懸液經由各自的入口引入設備，然後在灌注泵(syringe pump)、自流餵送器(gravity feed)、蠕動泵或任何形式的壓力驅動泵的控制下以預定流量通過微通道100 和微通道1002b進行灌注。利用檢測裝置 (例如DIC、落射螢光顯微鏡或其它光學方法)檢測微通道100 和微通道1002b內的血小板聚集。值得注意的是，雖然微通道100 和微通道1002b配置相同，且血小板聚集區域離得非常近，仍可光學監測到每個微通道100 和微通道1002b內的血小板聚集總和(注意， PDMS是透光的)。累積監測法(cumulative monitoring method)提高了血小板聚集測量的可靠性，降低了任意微通道內血小板聚集隨機變化的影響。儘管在此顯示的實例僅有兩個微通道，例如為進一步使測量順利進行，更多的微通道可適當地設置在PDMS塊體材料中(例如3、4、5、6或更多)。圖 IOb 為差分幹涉相差圖像(differential interference contrast image) (10X放大倍率)，示出了並行陣列配置中設備設計的幾種物理實施例。使用CXgYeZ命名， 其中cX為突起部上遊面的角度，gY為間隙的長度(單位為微米)，eZ為突起部下遊面的角度。圖中示出了六個重複實驗，但是陣列可由多達300個不同的重複(iteration)或300 個相同的通道構成，其中每個通道具有獨立的流量(泵)控制項。圖IOc為根據本發明實施例的供選擇設備1040的示意圖。與圖IOa所示的設備 1000相比，微剪切梯度設備1040的臺階幾何體配置包括微製造流通道1042a、微製造流通道1042b和微製造流通道1042c，每個微製造流通道具有唯一的入口儲存室1044和出口儲存室1046。各個入口儲存室1044的幾何體直徑為8mm，具有相同的清晰應變率微梯度幾何體(same defined strain rate micro-gradient geometry)。各個出 Dfi者存室 1046 白勺/L 何體直徑為1. 5mm。上遊阱(trap) 1050設置在各個微通道1042a、微通道1042b和微通道1042c中，可至少防止由於抗凝作用不足而在血液樣品中形成的顆粒物質和/或微血塊(micro-clot) 而導致微通道堵塞。阱1050協助血液流過設備達到最大流動效率(flow efficiency) 0 該設備設置有供給通道(feeder channel) 1052，該供給通道1052經由單一微收縮裝置 (micro-contraction) 1054將各個阱1050與各個微通道連接起來。在使用如圖IOa所示設備的過程中，將來自受試者的血液樣品或細胞懸液經由各自的入口 1020引入設備，然後在灌注泵、自流餵送器、蠕動泵或任何形式的壓力驅動泵的控制下以預定流量通過微通道1012進行灌注。利用DIC、落射螢光顯微鏡或其它光學方法檢測微通道1012內的血小板聚集。值得注意的是，雖然微通道1012配置相同，且血小板聚集區域離得非常近，仍可光學監測每個微通道1012內的血小板聚集總和(注意，PDMS是透光的)。累積監測法提高了血小板聚集測量的可靠性，降低了任意微通道內血小板聚集隨機變化的影響。為進一步使測量順利進行，更多的微通道可適當地設置在PDMS塊體材料1000 中。臺階配置構成大量微尺度幾何體，其中已對一個或所有參數進行了修改。臺階的全部尺寸是關鍵限制，為滿足此要求使長度和高度為0-100 μ m。在0 μ m高的臺階或擴張幾何體的情況下，通道包括100 μ m寬的通道，該通道按照給定的擴張角擴張為200-1000 μ m 寬的直通道。人們認識到血小板粘附過程在止血和血栓形成中具有關鍵作用，發展相對簡單可靠的診斷測試(可對血小板體外粘附功能進行準確評估)具有重要的臨床需求，因此開發了本發明的這些實施例。傳統使用血小板功能測試的目的是識別血小板缺陷，用於風險增高患者的出血病症及監測止血(monitoring haemostatic)治療，確保圍手術 (peri-operative)期正常的血小板功能。然而，認識到越簡單可靠的血小板功能測試對監測抗血小板治療的有效性有潛在的作用，開發了上述實施例，以便識別具有血小板反應過度和血栓風險增強的患者，便於對血小板集中進行質量控制，篩選血小板供者，還有可能預測手術出血的風險。認識到理想的血小板功能測試應易於操作，提供迅速、容易解釋的測試結果，使用少量血液(天然或抗凝的)，能夠在大範圍血流條件下評估血小板功能，能夠評估生理相關血栓表面上的血小板粘附和聚集，可再生性好，可靠性高，開發了本發明的上述實施例。本發明上述實施例提供設備以及結合設備使用的方法，用於評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集。實施例利用血流中的微小變化(剪切梯度)代表體內血栓發展 (thrombus development)的一般特徵。通過提供包括一個或多個微毛細管或微通道(每個都具有明確的幾何體)的體外用設備，這些實施例模擬一系列條件(例如體內較為典型的流量和壁剪切應力)來近似模擬體內的自然環境。因此，這樣的設備具有評估受試者血栓發展(或凝血活性)的用途，受試者被懷疑具有諸如發生在血栓形成、心臟病、中風或其它血管疾病(包括深靜脈血栓形成(DVT))的病人體內的血小板活性或功能異常，或者表現出對在疾病治療過程中使用的標準療法(例如肝素或其它血栓溶解劑)缺乏反應。牛物樣品此處使用的術語「生物樣品」旨在包括任何包含血小板的樣品，包括但不限於處理和未處理的生物樣品，例如全血(自然或抗凝)、血漿、血小板或紅色球。在優選實施例中， 樣品包括血小板或其前體。因為不希望受理論的約束，而利用注射器提取的生物樣品會導致血液樣品發生剪切。因此為了獲得準確結果，建議以最大限度減小剪切的方式獲得樣品。一個實例是使用更大號的針頭例如16號針頭來提出血液樣品。其它最大限度減小剪切的方法為本領域的技術人員所熟知。本發明的生物樣品優選來源於人類或靈長類動物。生物樣品還可來源於家畜或寵物。受試者此處使用的術語「受試者」旨在包括健康受試者以及血小板活性或功能存在已知或可疑異常的受試者。受試者包括上文描述的任意一種。優選受試者為人類。根據本發明的受試者包括患可疑或已知出血風險的受試者，例如血管性血友病患者、巨大血小板綜合症患者、血小板無力症患者以及維生素K缺乏患者。根據本發明的其他適合的受試者為患可疑或已知凝血風險的受試者，例如中風患者、糖尿病患者、吸菸者、心臟病患者、最近接受手術的患者、或將要接受治療或牙科手術但可能會出現失血過多風險的患者。術語「流量(flow rate)」在整個說明書中也指等效術語「灌注量(perfusin rate)」。生物樣品可利用任何流量調節裝置(例如單速泵(single speed pump)、變速泵、 灌注泵或重力)單向穿過微毛細管或微通道。可利用任何適合的方法(例如改變泵速)來調節流量。流量定義為每分鐘流過多少毫升的流體。剪切是流動過程中流體平面相對平行運動的結果，因此血管中，靠近血管壁的流體速度比接近中心位置的速度低。這種流體同心層之間流量的差值產生「剪切」效應。剪切定義為剪切率(shear rate)或剪切應力。剪切率表示為cm/s per cm—1 (或秒的倒數-s—1)。剪切應力為單位面積的力(表示為Dyn/cm2或帕斯卡Pascals))，等同於剪切率χ粘度。本發明上下文中使用的術語「剪切微梯度」旨在指由生物材料流量的變化引起的剪切效應。通過將微毛細管或微通道具體設計為具有不同的流入和流出幾何體，本實施例檢測剪切微梯度的差異對血小板聚集的影響。值得注意的是，在小於應用於圖10的實施例約250 μ Ι/min的流量時，流過微通道的流體雷諾數(Reynolds number)小於沈。在該方案中，血液的流量是穩定的，沒有流分離(flow separation)或渦流(vortex)形成。在本發明的特別優選實施例中，流量約為 8μ Ι/min，雷諾數大約為0. 86，與依賴導致流分離或渦流形成的其他設備相比，絕對不會有分離或渦流形成的機會。本發明實施例反而利用了減速流和由此產生的剪切梯度。更特別地，在認識到局部剪切微梯度促使血小板聚集在緊接高剪切加速出現剪切減速的區域，而提出本實施例。因此，剪切加速區之後接著便是使剪切減速的緊密耦合區 (剪切梯度)是有助於穩定血小板聚集體發展的條件。應了解對血小板功能進行準確的評估，有助於診斷和對受試者治療的恰當管理。 進一步地，持續的血小板功能監測同樣有助於評估受試者對特殊治療方案的反應。特別是，本發明方法特別適用於確定受試者發生血凝塊或血小板血栓的風險。受試者發生血凝塊的風險可以通過比較不同組的受試者來確定。例如，在指定流量和溫度的標準化指定時間段內，將來自正常健康受試者的血液樣品和來自有發生血凝塊歷史或增加風險的受試者的血液樣品分別通過多個不同微毛細管或微通道幾何體，然後對上述樣品的血小板聚集行為進行比較。同樣應了解本發明的裝置和方法還可用於辨別不同的血小板缺陷。進一步應了解本發明的裝置和方法還可用於測定特殊藥物或物質的有效性。例如，發明人發現在來自人類血液的經依替巴肽(integrilin，一種常見的抗血小板藥物)處理樣品和正常樣品的特定微通道幾何體上觀察到具有不同外觀的血小板聚集。本發明方法涵蓋的臨床情況包括(但不限於)以下幾種對其他健康受試者進行的完整心血管風險評估；對患血栓的患者進行評估；監測指定的抗血小板治療的有效性； 對要進行大手術的患者的出血或凝血情況進行評估；對具有心血管疾病高風險患者進行凝血風險情況評估，該患者包括糖尿病患者、高血壓患者、高血脂患者、具有強大家族凝血病史的患者、吸菸者以及帶可識別血栓形成標誌的患者；對患外周血管疾病的患者進行凝血風險評估；以及對出血病症患者情況的研究。^M根據本發明的試劑可為藥物或其他非醫藥物質。例如，試劑可以選擇抗血小板藥物、抗凝血劑、溶栓藥(thrombolytic drug)/纖溶劑(fibrinolytics)，或非醫藥物質例如檸檬酸、EDTA或草酸鹽。適用的抗血小板藥物的實例包括糖蛋白ILb/IIIa抑制劑，例如阿昔單抗 (abciximab)、依替巴肽和替羅非班(tirofiban) ；ADP受體/P2Y12抑制劑，例如噻氯吡啶(thienopyridine)(氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、噻氯匹定 (ticlopidine))和替卡格雷(ticagrelor)；前列腺素類似物，例如貝前列素(beraprost)、 前列環素(prostacyclin)、伊洛前列素(iloprost)、曲前列環素(tr印rostinil)、COX抑制劑例如乙醯水楊酸/阿司匹林、阿洛普令(aloxiprin)、卡巴匹林鈣(cartasalate)以及其他，例如地他唑(ditazole)、氯克羅孟(cloricromen)、雙嘧達莫(dipyridamole)、 吲哚布芬(indobufen)、匹可託安(picotamide)以及三氟柳(triflusal)；維生素K拮抗劑，例如香豆素(coumarin)危香豆酉享(acenocoumarol)、殺鼠迷(coumatetralyl)、 雙香豆素(dicoumarol)、醋酸乙基雙香豆素酯、苯丙香豆素(phenprocoumon)，以及華法林(warfarin)、1，3-弗滿二酮(Indandione)氯弗二酮(clorindione)、二苯弗酮 (diphenadione)、￥^5二Sl (phenindione) ，l^XRMilk,(tioclomarol)。適用抗凝血劑的實例包括因子)(a抑制劑(Factor Xa inhibitor)例如肝素貝米肝素鈉(bemiparin)、舍託肝素鈉(certoparin)、達肝素鈉(dalt印arin)、依諾肝素鈉
24(enoxaparin)、男β 屈月幹■ (nadroparin)、中白月幹■ (parnaparin)、Jfnf 會隹月幹■ (reviparin)、 亭扎肝素(tinzaparin)；低聚糖例如磺達肝癸鈉(fondaparinux)以及艾卓肝素 (idraparinux)；沙班(xaban)例如阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)以及利 (rivaroxaban)。其他適用抗凝血劑包括凝血酶直接抑制劑例如水蛭素(比伐盧定 (bivalirudin)、來匹盧定(1 印irudin)、地西盧定(desirudin))、阿力口曲班(argatroban) > 達比加群(dabigatran)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)以及其他例如 REG1、去纖苷(defibrotide)、雷馬曲班(ramatroban)、抗凝血酶III、蛋白質C。適用的溶栓藥/纖溶劑的實例包括TPA(阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(ret 印 Iase)、替奈普酶(tenect 印 lase))、UPA (尿激酶(urokinase)、沙 p 普酶(saruplase))、鏈激酶(streptokinase)、阿尼普酶(anistreplase)、孟替普酶 (monteplase)以及絲氨酸肽鏈內切酶(serine endop印tidase)例如安克洛酶(ancrod)和纖溶酶(fibrinolysin)。此處使用的術語「試劑」，從廣義上來說，用於包含單一化合物或化合物的混合物。 術語包括合成或天然物質；包括生物材料，例如抗體、激素、其他蛋白質或多肽等。試劑可為活化血小板的製劑，例如膠原蛋白、ADP、凝血酶、血栓素A2、血清素和腎上腺素。試劑例如可為已知的抗血小板製劑。或者，物質可為篩選出對血小板或其前體或其他細胞具有調節作用的物質。術語「調節」此處用來指物質對生物樣品中的血小板或其前體的血小板聚集活性的任何影響。相應地，該術語包含對血小板聚集活性的增強或抑制。值得注意的是，本系統在血小板聚集區域的突起部下遊面提供剪切微梯度，從而覆蓋大範圍的剪切率，更加恰當地模擬體內的自然環境。進一步地，本系統不要求在測定之前對血液樣品進行操作。更進一步地，本系統可以在血液量少的情況下使用。這對從嬰兒或幼童獲得的血液量較少和/或困難的兒科尤其重要。更進一步地，本系統不依賴於阻塞率(rate of occlusion)，但允許血小板聚集進入動態平衡，從而提供最大血栓尺寸的信息。更進一步地，本系統允許實時測量血栓的穩定性。本系統某些實施例的另一優點在於本設備允許對待實時監測的血小板聚集的可視化(visualisation)和分析。更進一步地，本系統能夠提供有關血小板聚集速率和程度的動力學數據。本領域的技術人員應了解在不背離本發明大致描述的範圍的情況下可對本發明進行許多變化和/或修改(如具體實施例所述)。因此本實施例被視為在所有方面都是說明性的，而不具有限制性。在整個說明書中，術語「包括(comprise)」，或變體，例如「包括(comprises) 」或 「包括(comprising)」，被理解為暗示包括一個所陳述的元件、整體(integer)或步驟，或一組元件、整體或步驟，但不排除任何其他元件、整體或步驟或一組元件、整體或步驟。本發明的其他特徵在下列的詳細說明和實例中被更全面的描述。然而應理解，所包括的實例僅僅是為了舉例證明本發明。不應理解為是以任何方式限制以上對本發明的廣泛描述。
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SM方法血液樣品的採集採用配有19號針頭、含有作為抗凝劑的800U/ml水蛭素的IOml注射器，通過肘前靜脈切開術(venisection of the antecubital vein)從受試者提取血液樣品。血液樣品的處理從同意的人類供體身上提取全血，使用水蛭素(800U/ml)抗凝該全血，繼而將經抗凝處理的全血通過該設備進行血液灌注研究。全血樣品與親脂膜染料(lipophylic membrane dye)DiOC6(1 μ g/ml)或 DiIC12(l μ g/ml)在 37°C孵育 10 分鐘，使細胞通過該設備更容易的顯現出來。微通道製造採用標準軟光刻技術，將微通道製造在3英寸矽片上的聚二甲矽氧烷(PDMS， Sylagard)(來自 KMPR 1025 光阻劑(microChem Corp)模具)中(Weibel，D. B.，Diluzio, W. R. &ffhitesides, G. Μ. Microfabrication meets microbiology. Nature reviews 5, 209-218(2007))。採用高解析度鉻掩模獲得明確的特徵，以製造模具。採用SuS顯影劑使 KMI3R顯影。構成了通道的逆模(inverse mould)。整體通道深度為80 μ m。構建好模具後， 聚二甲矽氧烷(PDMS)和固化劑按照10 1的比例混合，並脫氣處理20分鐘，澆入厚度大約為4mm的模具中。90°C，PDMS固化20分鐘。最後將PDMS通道直接粘合到160 μ m厚的高硼娃蓋玻片(borosilicate cover glass)上。為了實現所需的耐受性(tolerance)，光刻工藝的各個階段都需要高度的質量控制。例如，由於當前製造工藝的限制，嚴格限定的角(corner)是初步設計的一部分；將圓角製造成半徑大約為5微米(其為CFD建模過程中要考慮的因素)。儘管該限制不會嚴重影響血小板反應，製造方法的進一步完善可能會最終導致對血液動力學和由此產生的血小板聚集的更精確的控制。儘管PDMS具有成本低和製造方便的優點，但能夠提供更精確幾何體的其他材料可能在本發明其他實施例中具有優勢。液體流的數值模擬(CFD)利用不可壓縮液體流的質量守恆定律和動量方程解出流速場(velocity field) 後，利用基於有限體積格式(finite volume scheme)的計算流體學(Computational Fluid Dynamics, CFD)軟體包 FLUENT 6. 0 (Fluent USA，黎巴嫩，NH)來預算應變率(strain rate)，更多實施細節可參閱FLUENT手冊。連續統假設(continuum hypothesis)和無滑移邊界條件(no-slip boundary condition)被假定為保持有效。流動被視為三維的、穩定的、層流的(laminar)以及不可壓縮的。流體介質被視為具有998. 2km/m3的恆定密度以及 0. 00345Pa. s (中白·秒)的粘度。離散格式壓力(discretization scheme pressure)是標準壓力，計算中允許二階迎風動量選擇(second order upwind momentum option)。實例1通過臺階幾何體的血液灌注圖Ila為通過微剪切梯度設備的人類(水蛭素抗凝結)血液灌注的一系列代表性顯微照片(40X放大倍率)，該設備由ΙΟΟμπι流入(入口)寬度、90°收縮角θ。、10μπι 間隙高度、60°擴張角θ。700μπι擴張/出口寬度組成。灰色箭頭表示初始聚集點[t = 12sec]，黑色箭頭表示擴張區域血栓生長的範圍(n = 3次實驗)。
圖lib為由計算流體學(CFD)模擬得出的結果(速度ν位移(displacement)圖)， 表示血小板(顆粒)從(a)中的微通道壁幾何體表面移動1 μ m(l/2盤狀血小板直徑)速度發生的變化。對直線微通道部分(1，800. s—1層流)來說，血小板在其整個路徑長度上勻速運動。血小板經過剪切梯度幾何體時，快速加速階段連接快速加速階段。圖Ilc包括代表性聚集記錄(trace)，表示通過圖Ila所述的PDMS微通道設備進行的全血灌注的反應。臺階幾何體，表示以1，800. s—1的輸入(前狹窄)剪切率進行的水蛭素抗凝全血灌注(n = 3次實驗)；抗-Cillb β 3，水蛭素抗凝全血在進行血液灌注之前用 30 μ g/ml c7E3Fab處理10分鐘(η = 2次實驗)。注意，不存在整合素α IIb β 3時，在狹窄頂點處的初始補充受到顯著延遲並抑制整體聚集；抗-GPIb，水蛭素抗凝全血用50 μ g/ml 的抗-GPrt封閉IgG ALMA12處理10分鐘(n = 3次實驗)。注意，不存在GPrt/V/IX參與時，完全不存在血小板的相互作用。圖Ild為代表性聚集記錄，表示與不引起剪切梯度的直微流體設備相比，通過圖 Ila所述的微通道進行的全血灌注的反應；臺階幾何體，表示以1，800. s—1輸入(前狹窄) 剪切率進行的水蛭素抗凝全血灌注(n = 3次實驗)；直通道，表示以20，000. s—1體積剪切率通過100 μ m直微通道進行的水蛭素抗凝全血灌注(n = 3次實驗)。圖lie包括代表性聚集記錄，示出了可溶性激動劑(agonist)與通過圖(a)所述的微剪切梯度設備進行的與全血灌注的血小板聚集反應無關；臺階幾何體，表示以1，800. S"1輸入(前狹窄)剪切率進行的水蛭素抗凝全血灌注；+ADP/TXA2拮抗劑+水蛭素，表示水蛭素抗凝全血用 MRS2179 (100 μ M)、2-MeSAMP (10 μ Μ)以及吲哚美辛(Indomethacin) (10 μ Μ)處理10分鐘(η = 3次實驗)。在提出的臺階幾何體樣品中，使用水蛭素(50mg/kg)抗凝全血的試驗血液流動 (trial blood flow)實驗表明按照血小板聚集的剪切梯度模型，血小板血栓只形成在臺階幾何體下遊面已識別的流減速區域內(見圖Ila)。對照研究表明不具有臺階幾何體的直微通道中的持續升高的層流剪切力(laminar shear) (20，000. s—1)不能誘導血小板前聚集表型(圖llb-d)。根據血小板聚集的剪切梯度模型，化學血小板激動劑(ADP和TXA2)的抑制不會阻止臺階幾何體的剪切梯度依賴性聚集(圖He)。然而，聚集過程主要依賴於血小板整合素aIIbi33的參與。實例2兩種臺階幾何體相互作用的流量依賴性(flow rate dependency)圖1 包括代表性聚集記錄，取決於通過微剪切梯度設備的流量⑴=2、4、6、 8μ Ι/min)，該設備由IOOym流入/入口寬度，90°收縮角(θ。)，20 μ m間隙高度，30°擴張角(θε)，700μπι擴張/出口寬度組成。圖12b為代表性聚集記錄，取決於通過微剪切梯度設備的流量⑴=2、4、6、8μ 1/ min)，該設備由IOOym流入寬度，90°收縮角θ。，20 μ m間隙高度，90°擴張角θε，700μπι
擴張寬度組成。在擴張角為30°和90°的兩種臺階幾何體配置中檢測流量⑴=2、4、6、8μ 1/ min)依賴性的分析(分別見圖1 和圖12b)。在兩種幾何體配置中，隨著流量降低到8 μ 1/ min以下，聚集體的尺寸明顯減小。θε = 90°的第二幾何體配置中觀察到初始聚集的時間縮短(圖12b)，表明人類血液血小板聚集的發生主要依賴於擴張角幾何體(expansion angle geometry)。
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實例3球狀幾何體圖13a包括DIC圖像框，示出了以使用的10,000. ^T1Y進行人類全血(用100 μ M MRS2179、10 μ M 2-MeSAMP以及10 μ M吲哚美辛預處理)灌注之後，塗覆有VWF的球狀幾何體的下遊面盤狀血小板聚集的性質和程度(n = 5)。圖1 為平均盤狀血小板聚集體的尺寸(表面積以μ m2表示)，取決於下遊低τ χ, y凹坑(區域3的表面積，以μ m2表示)，顯示τ彡30. 4Pa(n = 3)。圖13c為在使用10，000. s—1的γ，塗覆有5 μ mVWF的球狀幾何體的下遊面平均盤狀血小板聚集體的尺寸；對照，水蛭素抗凝全血；抗-a IIb β 3，在進行血液灌注之前用 30 μ g/ml c7E3Fab處理10分鐘的水蛭素抗凝全血；抗_GPIb，用50 μ g/ml的抗-GPrt封閉 IgGALMA 12處理10分鐘的水蛭素抗凝全血。圖13d為在使用10，000. S—1的Y，球狀幾何體周圍的血液平面剪切應力(τ x,y)的 CFD模擬的結果。圖和圖13f為對距離2μπι和15 μ m球狀幾何體的側面1μπι(1/2血小板直徑)處的單個血小板軌跡的CFD分析結果。在提出的球狀幾何體樣品中，使用水蛭素抗凝全血的試驗血液流動實驗表明按照血小板聚集的剪切梯度模型，血小板血栓只形成在球狀幾何體下遊面已識別的流減速區域內(圖13a)。值得注意的是，已證明血小板聚集的程度主要依賴於球面直徑(spherical diameter)和輸入流量。如圖13d所示，取決於球體下遊面的直徑和低、,y區域(區域 3)的球體側的剪切應力增加；該區域的尺寸直接依賴於球面直徑。平面剪切應力 (τ x,y)表示自由流動血小板承受的預測應力(predicted stress)，該應力垂直於珠子表面 (bead surface)且與之距離與血小板直徑相同。依賴於相對於球體表面的位置，血小板將承受τ x,y不同大小和變化率。位於珠子赤道處的粒子路徑線(particle path line)的τ x,y增加(接近IOOPa (15 μ m的珠子))，隨後在區域3中降到小於30. 41^。值得注意的是，在珠子更小Qym)的情況下，變化率(τ χ, yv時間)、空間分布(、,yV路徑長度)以及峰值τ x,y都明顯降低，然而其剪切梯度仍然能夠誘導強烈的聚集反應。實例4三種微通道幾何體中血小板聚集動力學圖1 為通過通道幾何體進行水蛭素抗凝人類全血灌注的結果，該通道幾何體由 100微米流入段、90°收縮角(c90)、20X15微米峰間隙、700微米流出段、90° -30°間變化的擴張角(e90、e60、e30)組成。以輸入應變率1，800. s—1進行全血灌注10分鐘後確定平均血小板聚集體的尺寸(畫面(panel) 1)，微觀幾何體頂點的峰值應變率接近20，000. S^10 組合數據來自獨立的血液供體(n = 5) (SEM顯示)。畫面2-4為13分鐘的時間範圍內三種具體微觀幾何體中的血小板聚集動力學結果。軌跡為來自獨立血液供體(n = 5) (SEM顯示)結果的組合。圖14b為水蛭素抗凝全血用MRS2179(100yM)、2-MeSAMP(10yM)以及吲哚美辛 (10 μ M)處理10分鐘以抑制血小板放大信號傳遞(platelet amplification signalling) 的結果。這些數據集示出了血流參數對血小板聚集反應的直接影響，而血小板分泌的複合作用(compounding effect)與血小板聚集反應無關。血液樣品通過由100微米流入段、90°收縮角(c90)、20微米峰間隙、15微米間隙長度、700微米流出段、90° -30°間變化的擴張角(e90，e60, e30)組成的通道幾何體進行灌注。以輸入應變率1，800. s—1進行全血灌注10分鐘後確定平均血小板聚集體的尺寸(畫面1)，微觀幾何體頂點的峰值應變率接近 20，000. s—1。組合數據來自獨立血液供體(n = 5) (SEM顯示)。畫面2_4為13分鐘的時間範圍內三種具體微觀幾何體中的血小板聚集動力學結果。軌跡為來自獨立血液供體(η = 5) (SEM顯示)結果的組合。實例5四種微通道幾何體的加速度和應變率分析圖15a為對由100微米流入段、90°收縮角(a90)、10X 15微米峰間隙、60°擴張角(e60) ,700微米流出段組成的臺階幾何體的應變率和加速度的分析。畫面2和畫面3示出了相關應變率(Y.s—1)以及加速度大小的CFD分析，證明了微觀幾何體對血流的影響。圖15b為對由100微米流入段、90°收縮角(c90)、20微米峰間隙、15微米間隙長度、90°擴張角(e90)、700微米流出段組成的臺階幾何體的應變率和加速度分析。畫面2 和畫面3示出了相關應變率(γ. s—1)以及加速度大小的CFD分析，證明了微觀幾何體對血流的影響。圖15c為對由100微米流入段、90°收縮角(c90)、20微米峰間隙、15微米間隙長度、60°擴張角(e60)、700微米流出段組成的臺階幾何體的應變率和加速度分析。畫面2 和畫面3示出了相關應變率(γ. s—1)以及加速度大小的CFD分析，證明了微觀幾何體對血流的影響。圖15d為對由100微米流入段、90°收縮角(c90)、20微米峰間隙、15微米間隙長度、30°擴張角(e30)、700微米流出段組成的臺階幾何體的應變率和加速度分析。畫面2 和畫面3示出了相關應變率(γ. s—1)以及加速度大小的CFD分析，證明了微觀幾何體對血流的影響。這表明在血流量為11 μ Ι/min時，通道幾何體上建立的應變率(剪切)梯度，為該特殊製造的幾何體所需的剪切率，以便實現1，800. s—1輸入剪切(input shear) 0注意， 按照前面的定義，建立的三個明顯不同的剪切區域為區域1-剪切加速區；區域2-剪切峰值區；區域3-剪切減速區。為了了解在模型條件下改變壁幾何體(wall geometry)對血小板經受的應變率環境的影響，對於四種不同程度的狹窄症，對lym(l/2血小板直徑)的血管壁內血元素 (blood elements)的應變率歷程進行分析，結果如圖16a_d所示。圖16為承受側壁壓力的代表性小鼠腸繫膜微動脈的結構及CFD模擬結果。圖16a 為從活體視頻片段(intravital video footage)中取得的顯微照片，示出了小鼠腸繫膜微動脈(直徑為42m)狹窄症(斷面減縮率(area reduction)為 80% )，該微動脈承受玻璃微針(虛線)引起的血管側壁壓力並產生挫傷(crush iniury)。血小板聚集體的形成限定在圖16a的黃色陰影區內(由圖16e相應的黑白圖中的箭頭指示的區域限定)，流向為從左至右。當針頭接觸血管壁時，血液的主流向和壁之間產生一個角度。相關示意圖為結構模型，預測了造成30%、65%和80%狹窄時的逐步血管側壁壓力。注意，根據狹窄程度不同，預測收縮角和擴張角逐漸從35°增加到55°。黑色箭頭表示血流方向。圖16b表示65%和80%狹窄時(如圖16a所示)預測的應變率分布的等值線圖 (contour plot)。注意，液壓面積(hydraulic area)減小會使流體變形率從深藍區域(最低值)至紅色區域(最高值)逐漸增大/減小。這些變化顯然取決於由針頭造成的幾何形狀和角度，可局部影響血管中移動粒子所承受的應力。圖16c為取決於狹窄程度(血管壓縮)的小鼠血管壁的最大應變率。注意，最大血管壁應變率和狹窄程度之間呈指數關係，以獲得恆定流量。圖16d給出了針對四種不同程度的狹窄症(面積的30%、65%、80%和90%)，預測(CFD)的血小板應變率的歷程，該血小板在距微針壓力變形的側壁1微米(1/2血小板直徑)處移動。注意，一旦血小板進入該收縮處(contraction)，應變率就明顯增加。該流線 (streamline)上移動的顆粒在幾毫秒內經歷剪切加速、剪切峰值區域以及剪切減速過程。 研究發現對65%狹窄症(面積)來說，預測應變率適度增加；然而對80%狹窄症來說，當通過狹窄收縮處時，血小板的應變率增加2倍。進一步地，該模型預測在重度狹窄症(高於 80% )中每增加5% (2. 1 μ m)會導致應變率增加3倍(40，000-120，000. s"1)，暗示在80% 或大於80%的狹窄症中，輕微修改血管側壁就會對流過血管的血小板的應變率歷程產生重大影響。結合研究者進行的體內研究，圖16的數值模擬結果預測靠近血管壁的血小板在穿過狹窄部位時會經歷迅速極端的剪切加速和剪切減速階段，峰值應變率接近1X IOfV115 儘管這些值非常高，如果應力持續時間在1-5毫秒內，則表明血小板能夠承受升高的大約 IOOOPa(剪切率2. BXlO5iT1)剪切應力。該分析使我們能夠識別在研究者血管模擬設計的環境中可顯著影響血小板功能和聚集的三個原理性幾何參數i.收縮角及相關的血流力口速速率(rate of blood flow acceleration)；ii.狹窄間隙直徑(％狹窄)及相關的應變率峰值(peak strain rate)；以及iii.擴張角及相關的血流減速速率。圖17為三種對稱的微通道設計案例，選自研究者概念驗證研究中所有可能的案例。此外，使用CXgYeZ命名，其中eX為突起部上遊面的角度，gY為間隙的長度(單位為微米)，eZ為突起部下遊面的角度。進行數值(CFD)模擬來預測流速場(velocity field)、 產生的應變率分布並研究設備內選擇的血流流線內的粒子行為。圖Ife-ISd分別表示腸繫膜微動脈和c60g20e60模擬血管中計算應變率分布。圖 18a為小鼠腸繫膜微動脈(42微米)狹窄部位(側壁壓力)上遊，血流的計算應變率分布彩色圖。注意，由於粘滯效應(viscous effect)和圓柱幾何體，而使流體流產生均勻的側壁
應變率。圖18b為c60g20e60模擬血管確定的收縮幾何體上遊內，血流的計算應變率分布彩色圖。注意，由於矩形通道幾何體和較低縱橫比(aspect ratio)，微通道內側的流體沿壁形成拋物線分布，中心位置應變率最大，角邊處應變率最小。選擇距蓋玻片30微米處的平面用於所有成像實驗，以便該位置的流體和粒子經受 1700. S"1的應變率。65微米的中平面(mid-plane)的最大值為接近1960. s—1的應變率。圖18c為小鼠腸繫膜微動脈中80%面積狹窄處，血流的計算應變率分布彩色圖。 收縮區域內血管的幾何形狀由平針頭的形狀和血管側壁的彈性效應共同壓制形成。形成的不規則表面特徵，引起三維空間內非均勻應變率分布，具有兩個峰值為44，600. s—1，且在接近擴張區域時迅速減小。圖18d為c60g20e60模擬血管中確定的收縮幾何體處，血流的計算應變率分布彩色圖。注意，在模擬血管中產生更大的縱橫比，導致形成更均勻的應變率分布。所示流線表
30示在距微通道壁1微米(1/2血小板直徑)處運動的顆粒的計算軌跡；注意，在此距離上產生最大值41，200. s—1，儘管通道壁可能會經受更高的應變率，但流量為零。圖Ife和圖1 分別表現出血管模型和c60g20e60微通道結構的比較 (comparative)應變率分布(收縮部位上遊)。注意在血管中，預測應變率分布為軸對稱/ 均勻，然而由於微通道結構的矩形幾何形狀和較低縱橫比(寬-高=1.幻，流體沿側壁呈拋物線分布，壁中心為最大值，角處為最低值(圖18b)。然而，如果血流觀察平面局限於位於 30-65微米之間的流體體積(flow volume)，則血小板將具有1，500-1, 960s—1之間的均勻應變率，正好屬於報導的腸繫膜動脈和微動脈的標稱生理範圍。通過增加通道的縱橫比(增加設計的掩膜給定的寬度或增加光阻劑厚度給定的高度)來實現整個通道(光阻劑厚度限定的整個尺寸)更均勻的應變率分布，然而這可能會影響液力直徑(hydraulic diameter) (影響收縮部位的雷諾數以及血小板暴露在變率梯度的時間)。在本研究中，研究者有興趣在收縮部位在具有相似停留時間(residence time)的條件下維持可能的最低雷諾數，以便構建與體內環境具有類似慣性效果(inertia effect)的高應變率區域的模型(體內收縮部位的雷諾數為0. 45，微通道內的雷諾數Re為2. 4)。圖18c和圖18d分別呈現在微動脈模型(80%狹窄)和c60g20e60微通道結構的收縮區域內的應變率分布的計算結果。注意，在血管案例中，微針壓力的非均勻性導致不均勻的側壁形狀，由此產生不規則應變率分布，收縮區域上遊和下遊邊緣具有兩個高剪切局部區域( 44，660s-1)(圖18c)。相反，人造c60g20e60微通道結構的主要優點在於收縮部位的幾何形狀是均勻的(具有更大縱橫比)，由此產生更均質的(homogeneous)應變率分布 (圖18d)。此外，圖18d表示，對於距c60g20e60微通道壁1微米的流線，血小板將在靠近血管的收縮幾何體的中心處承受預計的峰值應變率41，200s-10總的來說，研究者的模擬表明 C60g20e60微通道結構顯示出與已公布的體內模型內產生的血流動力學環境良好理想化的擬合。圖19a-19d分別示出了該設備的流體動力學性能(hydrodynamic performance)。 圖19a表示c30g20e30、c60g20e60和c90g20e90模擬血管中預測應變率分布的等高線圖 (contour plot)。注意，液壓面積減小會使流體變形率逐漸增大，然後減小，變化從深藍區域(最低值)至紅色區域(最高值)。然而在各幾何體中「連續」增加至減小的速率不同。圖19b為CFD圖，表示在距三種指定微通道幾何體的臺階壁(st印-wall) 1微米處移動的模型血小板經歷的隨時間變化的預測應變率「歷程」。圖19c為CFD圖，表示在距三種指定微通道幾何體的臺階壁1微米處移動的模型血小板經歷的隨距離變化的預測應變率「歷程」。0微米參考點位於限定收縮幾何體的中線上。圖19d為CFD圖，表示距臺階壁1微米的流線分別在距限定收縮幾何體中線10微米和30微米處的應變率梯度的比較。圖19a_19d為關鍵流體動力學變量(variable)提供了理解，研究者的目的是通過將擴張角改變60°來對研究者概念證明的幾何體進行修改，即最初處於收縮區域內的血小板經歷的整體減速梯度。圖19c是當轉換到三種微通道結構擴張區域時，擴張角對血小板經歷的應變率減速的影響進行的分析。對距臺階壁1微米的血小板在距收縮區域(峰值階段)中心10微米和30微米處應變率瞬時值的研究表明，血小板在三個角等距離上的應變率減速大小明顯不同，因此在擴張區域第一個10微米內應變率減小分別為θ e = 30°減少 35% (41，000-28，OOOs"1)，θ e = 60° 時減小 46% (41，000-22，200s"1)，θ e = 90° 時減小 65% (41，000-14，400s-1)(圖 19c)。實例6取決於微通道設計的血小板聚集圖20a表示在10分鐘時間內以16 μ L/min (輸入應變率=1, 800s"1)的恆定流量通過c60g20e60幾何結構進行的DiOC6標記的全血灌注實時落射螢光成像照片，灌注之前用下面物質預處理10分鐘血小板抑制劑腙苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase) (0. 02U/ml)、 N6-甲基-2，-脫氧腺苷 _3，，5，- 二磷酸(100 μ M MRS2179)以及 2-甲硫基-AMP (10 μ M 2-MeSAMP)以阻斷ADP，用吲哚美辛(10 μ M)以阻斷TXA2，用水蛭素(800U/ml)以阻斷凝血酶。通過c60g20e60微通道結構進行的灌注產生劇烈的血小板聚集(圖20a)，該聚集始發生在剪切峰值(收縮)區域的下遊邊緣。重要的是，隨後發生在下遊應變率減速(擴張) 區域的血小板聚集形成了相對大而穩定的血小板聚集體。對三種獨立供體樣品進行比較表明整體聚集動力學和閉塞時間緊密一致。全血樣品用抗-整合素aIIbi33FabC7E3(20yg/ ml)預處理以阻斷血小板整合素a IIb β 3或用抗GPrt IgG Almal2 (50 μ g/ml)預處理以阻斷血小板VWF與GPrt/V/IX連接，以便研究介導聚集反應的血小板粘附受體。如圖21a所示，在整合素或GPrt阻斷劑存在時，c60g20e60幾何體內的血小板聚集完全被抑制，表明這些主要的血小板粘附受體在聚集過程中是必需的。實例7取決於微通道幾何體的血小板聚集的調節如前面討論，研究者對該設備的設計理念的首要目的是通過修改關鍵的幾何參數以限定應變率微梯度的大小和程度，從而能夠可控地調節血小板聚集。圖21a和圖21b 示出了一系列測試用例實驗，其中對微通道幾何體的收縮角和擴張角進行對稱修改。對 c60g20e60和c90g20e90幾何結構的比較結果表明血小板聚集的整體大小沒有明顯差異， 其中輸入前狹窄應變率保持恆定，為1，SOOiT1 (圖21b)。然而，c90g20e90幾何體會提高由於隨時間聚集體尺寸的變化整體減小而突出顯示的形成的聚集體的穩定性(圖21b)。相反，收縮角和擴張角從60°減小到30° (C30g20e30結構)顯著減少了血小板聚集的初始速率和大小(圖21a和圖21b)。有趣的是，c30g20e30結構中初始血小板聚集的位點從下遊移至狹窄部位的頂點，表明在血小板聚集明顯穩定之前必須使應變率整體減速(圖21a 和圖21b)。概念證明的研究清楚表明研究標準(prototype)設備中對應變率幾何體和由此產生的應變率分布修改可直接用於以可控方式調節血小板的聚集動力學機制。基於研究者當前的工作假設以及研究者詳細的CFD模擬結果，可以通過正在形成的聚集體(被迫發生在更高流量區域)承受的整體較高的應變率以及擴張區域內應變率的變化率整體減小來解釋c30g20e30結構不能支持穩定的血小板聚集。相反，可以通過更快的應變率減速以及更高流量區域對形成的聚集體的保護來解釋c90g20e90結構中聚集體穩定性的提高。更詳細地，圖21a表示通過c90g20e90微通道結構和c30g20e30微通道結構進行的血液灌注的代表性落射螢光圖像組。注意，在所有情況下，血液樣品在進行灌注之前都用擴增循環阻斷劑(Amplification Loop Blocker, ALB)、腙苷三磷酸雙磷酸酶(0. 02U/ml)、 MRS2179(100yM)以及 2-MeSAMP (10 μ Μ)、吲哚美辛(10 μ Μ)以及水蛭素(800U/ml)預處理 10分鐘(表示每次模擬η = 3次實驗)。
圖21b為代表性聚集軌跡，示出了通過c60g20e60、c90g20e90和c30g20e30ALB微通道結構進行經ALB處理的全血灌注的反應(n = 3次實驗)。實例8比較微通道陣列中抗血小板抑制劑的作用本實例描述了利用一種微觀幾何體設計的一次重複實驗證明各種單獨的抗血小板藥物或幾種抗血小板藥物的組合對血小板聚集的影響，使用的抗血小板藥物針對特定的血小板受體激活通路(receptor activation pathway)。所研究的抗血小板藥物為ADP受體/P2Y12拮抗劑。ADP是活化的血小板釋放的顆粒中的一種，該活化的血小板反過來可以活化其他血小板。顆粒中的內容物激活連接蛋白受體級聯反應(Gq-Iinked protein receptor cascade)，導致血小板細胞質中鈣離子濃度升高。本實例使用的微觀幾何體設備的收縮角(θ。)為85°、擴張角(θ e)為85°，間隙寬度為30 μ m、間隙長度為15 μ m、通道入口和出口寬度者為100 μ m(c85g30e85100_100 μ m
結構)。單獨或組合使用下列抗血小板藥1.水蛭素經水蛭素(800U/ml)進行抗凝處理的人類全血作為對照組。2.水蛭素+MRS 用100 μ M ？2Υ,腺苷_5，_ 二磷酸(ADP)拮抗劑Ν6-甲基_2，_脫氧腺苷_3』，5』 - 二磷酸(MRS2179)預處理10分鐘的人類全血(經水蛭素抗凝處理)。3.水蛭素 +2Me 用 10 μ M P2Y12 (ADP)拮抗劑 2_ 甲硫基-AMP (2MeSAMP)預處理 10 分鐘的人類全血(經水蛭素抗凝處理)。4.水蛭素 +MRS+2Me 用？Til (ADP), ？Til (ADP)拮抗劑 MRS2179 (100 μ M)和 2MeSAMP (10 μ Μ)預處理10分鐘的人類全血(經水蛭素抗凝處理)。數據如圖22所示，表明P2Y12(ADP)受體抑制劑(氯吡格雷(Plavix )的實驗等效物)導致設備內血小板的整體聚集減小50%。P2A (ADP)受體阻斷劑MRS對設備內聚集有更顯著的效果，然而與2Me組合使用時聚集被嚴重抑制。抑制劑的效果似乎取決於所使用的幾何體類型。例如，當微觀幾何體為90°收縮角、60°擴張角以及ΙΟμπι間隙寬度、微通道的入口段和出口段分別設置為 100 μ m和700 μ m(c90gl0e60100-700 μ m結構)時，血小板聚集不受這些抑制劑的影響。該數據在圖lie中示出，其中在按照上述相同濃度使用ADP拮抗劑的情況下，P2YpP2Y12、凝血酶及TXA2抑制劑的組合效應不會對聚集反應產生影響。這些數據表明可通過改變角度和收縮部位的尺寸來特別定製血小板的聚集反應。 這樣可使用多種設備設計來評估臨床環境中不同的抗血小板藥物。實例9比較來自正常健康供體的血液樣品與血管性血友病患者的血液樣品本實例證明了這樣的概念證明，即微觀幾何體設備可用於區分來源於正常供體的血液樣品和來源於III型血管性血友病(VWB)患者(其臨床測量的VWF血液水平在測定時為正常人的7%)的血液樣品。血管性血友病是最常見的遺傳出血性疾病(bleeding disorder)，具有常染色體隱性或顯性遺傳的特點。這種疾病的患者的vWF有缺陷，vWF介導糖蛋白Ib(GPrt)與膠原蛋白結合，從而幫助介導血小板活化和初期止血形成。使用包括85°收縮角(ea)、85°擴張角(eb)、30微米間隙寬度、15微米間隙長度、100微米通道寬度(C85g30e85100-100 μ m結構)的微通道幾何體。將用水蛭素和各種抗血小板藥物預處理的健康血液樣品與用水蛭素和各種抗血小板藥物預處理的血管性血友病樣品進行如下比較對照組人類全血(經水蛭素抗凝處理)用P2A (ADP)和P2Y12拮抗劑 MRS2179 (100 μ Μ)和2MeSAMP (10 μ Μ)，以及血栓素Α2抑制劑吲哚美辛(10 μ Μ)預處理10分鐘。vffD 血管性血友病患者全血樣品(經水蛭素抗凝處理)用P2Yi (ADP)和P2Y12拮抗劑MRS2179(100yM)和2MeSAMP (10 μ M)，以及吲哚美辛(10 μ Μ)預處理10分鐘。數據如圖23所示，表明在該vWF水平，來自血管性血友病患者的血液樣品不能在包含上述幾何體的設備中聚集。實例10比較減小的收縮角對血小板聚集反應的影響該實例探討了收縮(加速)角在設備一次重複中所起的作用。該設備由20μπι間隙寬度、15ym間隙長度、85°擴張角(減速角)、以及100 μ m微通道入口和出口寬度(cX g20e85100-100ym結構，其中cX =收縮角)組成。人類全血分別用800U/ml水蛭素和 ？Til (ADP)和 P2Y12 拮抗劑 MRS2179 (100 μ Μ)和 2MeSAMP (10 μ Μ)，以及吲哚美辛(10 μ Μ)預處理10分鐘。樣品灌注通過收縮角分別為0°、60°、75°和85°的設備。在該重複中，當收縮角小於60°時能有效消除聚集(見圖24)。實例11比較減小的擴張角對血小板聚集反應的影響該實例探討了擴張(減速)角在設備一次重複中所起的作用。該重複由20μπι間隙寬度、15μπι間隙長度、85°收縮角(加速角)、100μπι微通道入口和出口寬度(c85g20eX IOO-IOOym結構，其中eX =擴張角)組成。人類全血分別用800U/ml水蛭素，？Til (ADP) 和VTil2拮抗劑MRS2179 (100 μ Μ)和2MeSAMP (10 μ Μ)，以及吲哚美辛(10 μ Μ)預處理10分鐘。樣品灌注通過擴張角分別為15°、60°、75°和90°的設備。在該重複中，擴張角小於 30°時能有效消除聚集(見圖25)。實例12分析間隙寬度對血小板聚集反應的影響該實例展示了在該設備的一個重複中間隙寬度以及據此的剪切峰值因素的聚集反應中所起的作用。該重複由75°收縮角、75°擴張角以及100 μ m微通道入口和出口寬度(C75g20gX θ75100-100μπι，其中gX =可變間隙寬度)組成。人類全血分別用800U/ml 水蛭素和Ρ2 ! (ADP)和P2Y12拮抗劑MRS2179(100yM)和2MeSAMP (10 μ M)，以及吲哚美辛 (10 μ Μ)預處理10分鐘。樣品灌注通過間隙寬度分別為10 μ m、20 μ m、30 μ m和40 μ m的設備。該數據表明可通過在30-10 μ m範圍內縮小間隙來修改聚集的速率和程度。當間隙寬度降至小於30 μ m時血小板聚集停止(見圖沈)。實例13分析間隙長度對血小板聚集反應的影響該實例展示了在設備的一次重複中間隙長度以及據此的剪切峰值因素持續時間對聚集反應所起的作用。該重複由75°收縮角、75°擴張角以及IOOym微通道入口和出口 寬度(c75g20e75100-100 μ m，其中間隙長度分別為 10 μ m、15 μ m、20 μ m50 μ m 和 70 μ m) 組成。人類全血分別用800U/ml水蛭素和Ρ2 ! (ADP)和P2Y12拮抗劑MRS2179 (100 μ Μ)和 2MeSAMP (10 μ Μ)，以及吲哚美辛(10 μ Μ)預處理10分鐘。樣品灌注通過間隙長度在10 μ m 和70μπι之間變化的設備。該數據表明當間隙長度小於10 μ m大於70 μ m時聚集停止。此外，數據集表明聚集的速率和程度可通過在15-50 μ m範圍內改變間隙長度進行修改(見圖 27)。
權利要求
1.一種對從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集進行實時監控的微流體設備，其特徵在於，該設備包括通道，用於供該生物樣品通過，該通道包括突起部，該突起部用於引起形成與下遊剪切減速區耦合的上遊剪切加速區，並在該上遊剪切加速區與該下遊剪切減速區之間限定剪切率峰值區，該下遊剪切減速區限定血小板聚集區域；以及血小板檢測裝置，用於檢測該生物樣品通過該通道而導致在該聚集區域出現的血小板聚集。
2.根據權利要求1所述的微流體設備，其特徵在於，當以一定速率泵送所述生物樣品通過該設備時，其中該速率將初始剪切率限定並限制到生理範圍150s—1 10，OOOiT1內，所述突起部用於引起IOXlO3iT1至150 X IO3iT1範圍內的剪切率峰值。
3.根據權利要求1或2所述的微流體設備，其特徵在於，所述突起部包括上遊面和下遊面，該上遊面與通過所述通道流動的主方向成0°至90°角以限定所述剪切加速區，該下遊面與通過該通道流動的主方向成0°至90°角以限定所述剪切減速區。
4.根據權利要求3所述的微流體設備，其特徵在於，所述上遊面和所述下遊面分別與通過所述通道流動的主方向成30°至90°角。
5.根據權利要求3或4所述的微流體設備，其特徵在於，所述剪切峰值區由所述突起部和相對的通道壁之間的間隙寬度限定，該間隙寬度選自10 μ m至40 μ m之間。
6.根據權利要求5所述的微流體設備，其特徵在於，平行於通過所述通道流動的主方向測量的間隙寬度為0. 5 μ m-20 μ m之間。
7.根據權利要求3至6中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，所述上遊面和所述下遊面基本上是平面的、凹面的或凸面的。
8.一種用於評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的微流體設備，其特徵在於， 該設備包括通道，用於供該生物樣品通過，該通道具有用於幹擾樣品流動的突起部，該突起部的至少一個橫截面的尺寸明顯小於100微米，該突起部用於在該通道內限定血小板聚集區域； 以及血小板檢測裝置，用於檢測該生物樣品通過該通道而導致在該聚集區域出現的血小板聚集。
9.根據前述權利要求中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，所述通道的配置和流量適於維持該通道內的雷諾數小於或等於26，以便維持完全穩定的血流，沒有流分離或渦流形成。
10.根據權利要求8所述的微流體設備，其特徵在於，所述突起部包括位於所述通道內的球狀突起部，所述樣品必須繞該球狀突起部流過。
11.根據權利要求10所述的微流體設備，其特徵在於，所述球狀突起部位於所述通道寬度的中心，使得基本上等量的該樣品在該球狀突起部的各個面流過。
12.根據前述權利要求中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，該設備設置有多個通道，各個通道具有尺寸基本相同的突起部，並且其中所述檢測裝置可用來檢測所有該通道中所有血小板聚集的總和。
13.根據權利要求1至11中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，該設備設置有多個通道，各個通道具有尺寸基本不同的突起部，並且其中所述檢測裝置可用來平行檢測該通道陣列中的差別血小板聚集。
14.根據前述權利要求中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，所述通道表面具有血清蛋白、粘附基質或聚合物，以便增加血小板聚集。
15.根據前述權利要求中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，所述血小板檢測裝置包括光學檢測裝置。
16.根據權利要求15所述的微流體設備，其特徵在於，所述光學檢測裝置包括全內反射傳感器，該全內反射傳感器緊鄰所述通道突起部，以實時監測所述血小板聚集區域中的血小板聚集。
17.根據權利要求15所述的微流體設備，其特徵在於，所述光學檢測裝置包括光發射器以及對準光檢測器，其中該光發射器用於發出光，以在構成所述通道的材料內進行內反射，這樣該光檢測器檢測到由於血小板聚集區域中血小板的聚集引起的內部光反射的變化。
18.根據權利要求15所述的微流體設備，其特徵在於，所述光學檢測裝置包括光發射器以及對準光檢測器，該光發射器用於發出光，以穿過血小板聚集區域傳輸，使得該光檢測器檢測到由於血小板聚集引起的透射光強度的減弱。
19.根據從屬於權利要求12或13的權利要求15所述的微流體設備，其特徵在於，所述光學檢測裝置包括光發射器以及對準光檢測器，該光發射器用於發出光，以穿過由多個通道的每一個通道各自的突起部限定的血小板聚集區域，使得該光檢測器可檢測由所有通道中全部血小板聚集引起的透射光強度的減弱。
20.根據前述權利要求中任一項所述的微流體設備，其特徵在於，所述設備包括用於製造的塊體材料，該塊體材料內部形成、嵌入或模製一個或多個密封通道。
21.根據權利要求20所述的微流體設備，其特徵在於，製成所述設備的所述塊體材料是聚二甲矽氧烷(PDMQ、硼矽玻璃、SFll玻璃、SF12玻璃、聚苯乙烯和聚碳酸酯中的一種。
22.一種用於檢測或評估患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性疾病或障礙性疾病或具有患該疾病風險的受試者的診斷方法，其特徵在於，該方法與根據權利要求1至 21中任一項所述的微流體設備相結合。
23.一種用於診斷患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性疾病或障礙性疾病或具有患該疾病風險的受試者的診斷方法，其特徵在於，該方法包括i)從受試者獲得生物樣品； )在確定的流動條件下且在來自該生物樣品的細胞足以發生聚集的時間內，使該生物樣品通過根據權利要求1至21中任一項所述的設備；iii)檢測該細胞的聚集；以及將該生物樣品細胞聚集的時間和聚集體的大小與預定標準作比較，其中任何變化都表示患有血小板或其前體功能或活性異常的相關性疾症或障礙性疾病或具有患該疾病的風險。
24.一種用於判斷或評估試劑對生物樣品中血小板或其前體聚集的調節作用的方法， 其特徵在於，該方法包括i)在確定的流動條件下且在足以判斷在權利要求1至21中任一項所述的微流體設備內是否發生血小板聚集的時間內，並在該試劑存在的情況下，使該生物樣品通過該設備；以及ii)將步驟(i)中獲得的結果與在該試劑不存在的情況下進行步驟(i)的結果作比較。
25.一種用於對使用試劑療法的受試者的治療進行監測的方法，其特徵在於，該方法包括(i)在確定的流動條件下且在足以判斷在權利要求1至21中任一項所述的微流體設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自該受試者的第一生物樣品通過該設備，該第一生物樣品在給該受試者施用該試劑之前獲得；以及( )在確定的流動條件下且在足以判斷在權利要求1至21中任一項所述的設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自該相同受試者的第二生物樣品通過該設備，該第二生物樣品在給該受試者施用該試劑之後獲得；以及(iii)將步驟(i)中獲得的結果與步驟(ii)中獲得的結果作比較。
26.一種用於對使用試劑療法的受試者的治療進行監測的方法，其特徵在於，該方法包括(i)在確定的流動條件下且在足以判斷在權利要求1至21中任一項所述的設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自該受試者的第一生物樣品通過該設備，該第一生物樣品在給該受試者施用該試劑的第一劑量之後獲得；以及(ii)在確定的流動條件下且在足以判斷在權利要求1至21中任一項所述的設備內是否發生血小板聚集的時間內，使來自該相同受試者的第二生物樣品通過該設備，該第二生物樣品在給該受試者施用該試劑的第二劑量之後獲得；以及(iii)將步驟(i)中獲得的結果與步驟(ii)中獲得的結果作比較。
27.根據權利要求1至21中任一項所述的微流體設備用於監測生物樣品中血小板的功能和/或活性的用途。
28.一種用於高通量篩選多種候選抗血小板化合物的方法，其特徵在於，該方法包括(i)將從受試者獲得的至少一種生物樣品與該多種候選抗血小板化合物的至少第一種化合物接觸；(ii)在確定的流動條件下且在足以判斷在權利要求1至21中任一項所述的微流體設備內是否發生血小板聚集的時間內，使該至少一種樣品通過該設備；(iii)檢測該多種候選抗血小板化合物的該第一種化合物對該至少一種生物樣品的血小板聚集的影響；以及(iv)將步驟(iii)中觀察到的影響與不與該候選化合物接觸的對照樣品作比較。
29.一種新型的抗血小板試劑，其特徵在於，經高通量篩選獲得的該試劑與根據權利要求1至21中任一項所述的微流體設備相結合。
30.一種用於監測血小板功能的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包括包裝材料，該試劑盒還包括(i)根據權利要求1至21中任一項所述的微流體設備；以及(ii)用來說明該微流體設備在監測血小板功能的系統中如何使用的說明書。
31.一種用於實時評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的方法，其特徵在於，該方法包括使該生物樣品按照一定速率通過特定通道，該速率使該通道幹擾該樣品的流動，並因此引起形成與下遊剪切減速區耦合的上遊剪切加速區，並在該上遊剪切加速區與該下遊剪切減速區之間限定了剪切率峰值區，該下遊剪切減速區限定了血小板聚集區域；以及檢測由於該生物樣品通過該通道而在該聚集區域發生的血小板聚集。
全文摘要
本發明提供了一種對從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集進行實時監控的微流體設備。所述設備包括用於供生物樣品通過的通道，所述通道包括突起部，該突起部用於引起形成與下遊剪切減速區耦合的上遊剪切加速區，並在該上遊剪切加速區與該下遊剪切減速區之間限定剪切率峰值區，該下遊剪切減速區限定血小板聚集區域。所述設備進一步包括血小板檢測裝置，用於檢測生物樣品通過所述通道而導致在聚集區域出現的血小板聚集。本發明進一步描述了一種實時評估從受試者獲得的生物樣品的血小板聚集的方法。
文檔編號B01L3/00GK102348506SQ201080011673
公開日2012年2月8日 申請日期2010年3月10日 優先權日2009年3月10日
發明者A·D·米切爾, F·J·託瓦爾洛佩斯, J·卡伯裡, S·P·傑克遜, W·S·內斯比特 申請人:皇家墨爾本理工大學, 莫納什大學