生物吸附載體的製作方法

2023-07-15 01:28:01

專利名稱：：生物吸附載體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物吸附載體，特別涉及一種以亳微結構(nanostructured)的表面形態為基礎的生物吸附載體。
背景技術：
：常用生物吸附載體包括聚合物，共聚物或有化學官能團的沒有明顯物理顯微結構的聚合物表面(即，其表面積由載體的平均幾何形狀來確定)。從微觀角度來說，聚合物表面提供了親水和疏水位點是不均一的，從而使生物分子有不同水平的對吸附劑底物親和能力。在一個平的表面上，生物分子經擴散而脫離和吸附到底物上的可能性是相同的。通常吸附速度可通過搖動或振蕩溶液來提高。發明概要簡單的說，本發明一方面提供一種生物吸附載體，其含有一個惰性的底物來支持一個亳微結構表面，表面包含塗布金屬的，定向排列的，不連續的亞微米大小的單元，單元有很高的高徑比，例如大於3且表面數密度(arealnumberdensiy)在1-200/μm2範圍內。有利的是，亳微結構表面的物理形態(在這裡描述為亳微結構是因為表面的體積以納米表徵)為溶液內與表面接觸的生物分子在短的擴散路程長度內提供了高的比表面積。其上吸附生物分子的亳微結構須晶上的塗布材料可以不同，但最好用簡單金屬如貴金屬。有亳微結構表面的底物通常是柔性的，惰性的，並易被切開或成形的。生物分子可快速吸附到載體上，並形成高水平(85-90％)的牢固結合和高的絕對結合數量(～10μg/cm2)，且不需要搖動或振蕩。而且，牢固結合的生物分子表現出仍保持生物活性。鑑於生物活性物質的高度不均一性，即三聚物(通常只含有三個不同的單體)與生物活性物質(通常有11個或更多的不同的單體)相比是簡單的，因此其結合緊密度和生物活性的保留是特別驚人的。本發明亳微結構有高的高徑比，其表面數密度在40-50/μm2，與其它該領域已知的吸附載體相比可為吸附生物分子提供10-15倍的平面表面積。亳微結構須晶上的純金屬塗層如Pt可形成一個均一的吸附表面。而且，定向排列單元的很高的高徑比和它們的高填充密度(即表面數密度)可使生物分子在擴散入亳微結構層時被暫時截留，從而不需搖動或振蕩即可獲得更多的生物分子/吸附表面的碰撞機會。本發明另一方面是生物吸附載體可有利地用作分離裝置如過濾器，傳感器及其他。例如，含有生物活性物質的流體可在生物吸附載體上方流過或通過生物吸附載體，以使流體內的一個或多個生物活性物質從流體被抽提出或被分離。抽提出的或分離出的生物活性物質單層粘附在亳微結構單元上。生物活性物質可以某種方式在任意的終點時被取出，這些方式如直至吸附了預定水平的物質，吸附了預定的時間，或直至載體被生物活性物質所飽和。本發明還有一個方面是生物吸附載體可用於穩態的從一種物質轉變為另一種物質的生物轉變過程，如作為一種催化劑。這些特徵為本發明提供了幾個方面，這些是該領域技術人員所不能預見的。與吸附載體
技術領域：
的已知技術相比，生物分子結合到這種物質表面的速度比生物分子結合到常規平面表面上的速度更快。令人驚奇的是，生物分子的結合不僅快速而且有高的表面覆蓋率。本發明另一個有利的特徵是生物分子的結合緊密度，其可用十二烷基硫酸鈉(SDS)處理時耐受解吸的能力來描述。如此高的殘留結合通常只有當這種生物分子以共價鍵結合到表面上時才會有。同樣令人驚奇的是在如此牢固結合的同時，生物分子還可保留其生物活性。利用亳微結構單元特別的優點可製成一種組合體，其含有(a)一個生物吸附載體，其含有一個支持一個亳微結構表面的惰性底物載體，表面包含塗布金屬的，定向排列的，不連續的亞微米大小的單元，單元有高的高徑比且表面數密度在1-200/μm2範圍內和(b)吸附在塗布金屬的單元上的單層生物活性物質，其中被吸附的一層具有生物活性。有利的是，組合體也可用作一個分離裝置，其中吸附在塗布金屬的單元上的生物活性物質對特定的生物活性物質具有特異性。或者，本發明還有一個方面是提供一個組合體，其包含(a)一個生物吸附載體，其含有一個支持亳微結構表面的惰性底物，表面包含敷形塗布生物吸附劑的，定向排列的，不連續的亞微米大小的單元，單元有高的高徑比且表面數密度在1-200/μm2範圍內(b)一個吸附在敷形塗布生物吸附劑的單元上的第一生物活性物質單層，其中被吸附層具有生物活性，和(c)吸附在第一生物活性物質單層上的第二生物活性物質單層。例如，第一個組合體可用第一生物活性物質單層塗布，該單層可暫時或永久地與藥物(第二生物活性物質單層)結合，從而使藥物以飽和或預定劑量塗布在組合體上。然後塗布有藥物的組合體可用於使藥物在特定部位定時解吸或仍保留藥物，其通常可吸附到或離開所給定的區域。在本申請中「生物活性物質」也稱」生物分子「，是指分子如有生化，免疫化學，生理和/或藥物活性的分子，即能以一種影響生物過程的方式進行反應的分子，這類物質包括蛋白質，抗體，抗原，酶，輔因子，卵磷脂，激素，脂質，介質，受體，凝集因子，組蛋白，細胞受體和細胞表面抗原，以及還包括分子量(用SDS凝膠電泳測定)至少為1000以上，最好至少為5000以上的物質或生物分子。附圖簡述圖1A是未塗布的不連續的亞微米大小的須晶的立體圖，該須晶由底物支持。圖1B是圖1A不連續的亞微米大小須晶被敷形塗布後的立體圖。圖2是放大倍數為10,000倍的掃描電子顯微照片(SEM)，其表明用膠乳部分包埋的塗布Pt的須晶，須晶形成用於吸附蛋白質A的亳微結構單元。圖3是放大倍數為150,000倍的掃描電子顯微照片(SEM)，其表明未包埋的在塗布銅的聚醯亞胺底物上的塗布Pt的須晶。圖4表示最初結合和牢固結合的蛋白質A吸附量對應於時間的曲線圖。圖5表示最初結合和牢固結合的牛血清白蛋白(BSA)吸附量對應於時間的曲線圖。圖6表示最初結合和牢固結合的人免疫球蛋白G(IgG)吸附量對應於時間的曲線圖。圖7是放大倍數為150,000倍的掃描電子顯微照片(SEM)，其表明在吸附蛋白質A後的塗布Pt的須晶。較佳實施例描述本發明提供一種生物吸附載體，其含有一個惰性的底物來支持一個亳微結構表面，表面包含金屬塗布的，定向排列的，有不連續亞微米大小的須晶。或者，敷形塗布金屬的須晶可部分包埋或用第二種材料敷形塗布。亳微結構表面不需搖動或振蕩即可快速且高度牢固地結合吸附生物分子。有利的是，結合的生物分子仍保持其生物活性。本申請所用的「亳微結構」指在至少一個方向上空間大小大約為幾十納米數量級的組成不均勻的表面區域。這種在兩個方向上有空間不均勻性的亳微結構表面區域的例子是，底物表面上均勻地排列有伸展的塗布金屬的單元(納結構單元)，單元間互不接觸，每單位面積內有足夠的數目以獲得所需的性質，如快速牢固結合。兩個方向上空間不均勻的亳微結構表面區域可以是一種沿任何兩個或三個正交方向至少有兩種不同的物質如亳微結構單元和空隙的區域。這種亳微結構材料在如美國專利No.4,812,352中有所描述，它被引證包括在這裡。簡單的說，將一種有機材料在接近室溫時真空氣相沉積在一個柔性的底物如聚醯亞胺織物上，形成約0.15微米數量級的厚度，這種有機材料基本上有平面形狀的分子和非定域的π-電子密度，如顏料N，N』-二(3，5-二甲苯基)苝-3，49，10二(二羧醯亞胺)，以下稱為PR149。此後，底物和PR149塗層在足夠的真空中退火以使最初均勻的顏料膜變為具高度亳微結構的須晶。參照圖1(a)和1(b)，亳微結構表面(10)包括不連續的均勻排列的結晶須晶(12)，其高為1至2微米，有高的高徑比(長度對寬度)和高的表面數密度(1-200/μm2)，直徑約為0.05微米。由底物(11)支持的須晶間的距離約為0.05微米或更小。因此得到的結晶須晶(12)的幾何表面積可比平面表面積(10)增加10到15倍。然後附著在最初底物(11)上的結晶須晶(12)可用金屬，半金屬，半導體，電介質或有機物質敷形塗布。在本申請中，噴鍍或氣相沉積金屬塗層，特別是鉑層，是直接吸附生物分子所需的表面。金屬塗層(13)也有助於加固塗布過的須晶(14)和維持須晶粘結在底物(11)上以防止其進入溶液。或者，上述的塗布過的亳微結構單元還可任用一種有機物質進一步敷形塗布以圍繞每個亳微結構單元施加一層有生物官能團的薄的敷形塗層。這種塗層的塗敷方法包括，例如自組裝單層。而且，上述的亳微結構表面可通過用可流動的物質，如預聚合物，覆蓋須晶(14)結構來部分包埋，預聚合物只部分填充須晶間的空隙，當其固化成固態時，其可從原來的底物上剝落。在剝落時，固化聚合物的部分包埋劑將須晶拉出原來的底物，由於使須晶末端突出而形成起紋理的表面。該表面現在可作為生物分子吸附表面。許多聚合物可作為包埋劑，並可被選用來進一步增加生物分子的結合性。較佳的底物材料包括有機或無機材料，如聚合物，金屬，陶瓷，玻璃和半導體。較佳的有機材料是塗布金屬的聚醯亞胺薄層(工業上可從DuPontCorp.以商品名KAPTONTM獲得)。本發明適用的其它底物材料的例子在美國專利No.4,812,352中有描述，並且引證包括在這裡。在美國專利No.5,238,729中描述了一種用於證實本發明的特別有用的製造方法來製備生物吸附載體的亳微結構表面區域，且該描述被引證包括在這裡。在美國專利No.5,039,561和4,812,352中描述了含有亳微結構表面區域的亳微結構單元，該描述被引證包括在這裡。其它產生亳微結構表面的方法包括(1)有機顏料真空沉積在加熱的底物上，(2)用物理蒸氣遷移生長而不用真空蒸氣沉積，(3)無機材料以高入射角真空沉積，(4)有不同噴塗速率的聚合物，半導體或合金的離子噴塗浸蝕或RF噴塗浸蝕，(5)採用微島(microisland)掩蔽的聚合物噴塗浸蝕，(6)光刻法(UV和X-射線)，和電子束石印術，(7)鋁水解而形成一水軟鋁石，(8)金屬的電化學腐蝕和粗糙金屬的電鍍，(9)光聚合物表面的光刻法，(10)低共熔混合物直接固化和浸蝕法，和(11)氣液固(VLS)晶體生長。這些方法的任一個都可用於形成亳微結構表面。一些技術或方法有利於製備如須晶狀結構。在J.Vac.Sci.Tech.(1983，1(3)，1398-1402)和美國專利No.4,812,352，5,039,561和5,238,729中描述了無機物，金屬或半導體為基礎的微結構層或微結構的製備方法。可用於製備須晶的原材料包括有機和無機化合物。須晶對於後續的薄層金屬塗布，以及任選的和敷形塗布和任選的包埋必須是無反應性的或不活潑的骨架。較佳的有機材料可大致分為多環芳香烴和雜環芳香烴化合物。特別有用的多環芳香烴包括，例如萘，菲，苝，蒽，暈苯和芘這些類別。較佳的多環芳香烴是N，N』-二(3，5-二甲苯基)苝-3，49，10二(二羧醯亞胺)(工業上可從Hoechst-CelaneseCorp.以商品名「C.I.PigmentRed149」獲得，也稱為「PR149」)。用於製備須晶的有機材料可用該領域已知塗布技術來將有機材料層塗布在底物上，其包括(但不局限於)真空蒸發，噴鍍，化學蒸氣沉積，噴塗，溶液吸附，LangmuirBlodgett，或刮塗。有機層的塗布最好用物理真空蒸氣沉積(即，有機材料在所施加的真空下升華)。在沉積時底物較佳的溫度取決於所選擇的有機材料。對於PR149，底物的溫度近室溫(即，約25℃)是理想的。在製備有機須晶的較佳方法中，沉積的有機層的厚度將決定在退火過程中形成的微結構的主要方向。這一較佳的方法包括在或接近室溫時使形成須晶的材料沉積，然後升高底物的溫度，在低於約130帕斯卡的真空下，最好低於10-2帕斯卡的真空下對形成須晶的材料退火。須晶在底物上生長，其特徵和方法在美國專利No.5,039,561中有所描述，它被引證並包括在這裡。這種獲得須晶的方法在下面的實施例1中也有描述。另一種形成須晶的方法包括將形成須晶的材料沉積在底物上，其中對形成須晶的材料和底物升溫。材料被在低於約130帕斯卡的真空下沉積，直至獲得有高的高徑比的隨機取向的須晶。這種可供選擇的方法在美國專利No.5,352,651中有所描述，被引證並包括在這裡。在兩種情況下，PR149都是較佳的有機材料。PR149層在退火前的厚度通常為約0.05至0.3μm，更佳在0.05至0.15μm，最佳在0.1至0.15μm。當有機材料退火時，如在1.0×10-2帕斯卡和約250℃退火30分鐘，就形成了須晶。最好，須晶是單晶的或多晶的而不是無定形的。由於晶體的特徵和微結構的一致取向，須晶層的物理和化學性質是各向異性的。通常須晶的取向是一致的，是垂直於底物表面的。每個須晶的較佳長度在0.1至3μm，更佳為0.5至2.5μm。每個須晶的橫截面寬度最好小於0.1μm。須晶最好有高的高徑比(即須晶的長度和須晶的直徑之比約在3∶1至100∶1之間)。敷形塗布的亳微結構單元的表面數密度較佳是在1-200/μm2，最好在5-50/μm2範圍內。而且，無論亳微結構單元是同軸取向還是隨機取向，最好每個亳微結構單元的至少一端與所有亳微結構單元共有的二維平面接觸。參照圖1B，亞微米寬度和幾微米長度的亳微結構單元(14)，是一個包含有機須晶核心(12)和至少一個敷形塗層(13)的複合物。敷形塗層材料從生物材料，有機材料如自組裝單層、有機顏料如酞菁或雜環芳香族化合物，或無機材料中選出。通常敷形塗層材料被選擇用於優化生物分子的吸附和結合。無機塗層材料最好從導電金屬，半金屬，電介質和半導體中選出。較佳的金屬敷形塗層材料包括Pt，Pd，Ag，Cu，Au，和合金，如CrCo，NiCr和PtIr。圍繞須晶的敷形塗層材料其壁厚在約0.5nm至約50nm範圍內。敷形塗層可用常規技術沉積在須晶上，其包括，例如在美國專利No.5,039,561中描述的方法。敷形塗層沉積的方法應避免機械的或類似機械的力擾亂亳微結構表面區域。更佳的是無機敷形塗層採用真空沉積的方法沉積，例如真空升華，噴塗，蒸氣遷移和化學蒸氣沉積的方法。此外，可在亳微結構單元外塗敷第二，第三或更多層敷形塗層。一種特別有用的塗敷附加的敷形塗層的方法是從溶液中吸附有機材料，例如末端硫代的低聚物。儘管最好用多組分的亳微結構單元(如上所述)，但是本發明也考慮了含有一個組分的亳微結構單元。單一組分的單元有和多組分單元類似的尺寸，然而，單一組分的單元只含有一種材料，如金屬，參照如上所述的金屬敷形塗層。或者，儘管不是最佳的，但可任意在亳微結構表面區域的暴露表面塗敷一種有機或無機的包埋劑，其中包埋劑全部或部分地包埋亳微結構單元。包埋劑可用適於特定包埋劑的方法以液態，氣態或固態塗敷到亳微結構表面區域上。塗敷的包埋劑可用適於所用特定材料的方法固化，縮合或聚合。在亳微結構單元被包埋後，得到的複合體即被包埋的本發明的生物吸附載體，用機械的方法，如將包埋的生物吸附載體從底物中拉出，將底物從包埋的生物吸附載體中拉出或兩者共同作用的方法，使載體從底物-亳微結構層界面剝落。在一些例子中，包埋的生物吸附載體在包埋劑固化時會自動脫落。另一種較佳的方法是製造包埋的生物吸附載體的無溶劑方法，該方法可用於任何有亳微結構表面的組分，即，一個包含各種材料組分，形狀，取向和堆積密度的亳微結構單元的組合。如美國專利No.5,352,651中所述，亳微結構單元可用熱輥壓延入聚合物織物的任何預定的深度。生物吸附載體通常在25-50μm厚的底物上形成大面積的片材，適於切割或衝出許多小的樣品片。例如，可衝出小直徑的片(～6mm)並將其置於微量滴定孔的底部以使亳微結構表面面對孔的內部。有利的是，亳微結構表面的高表面積和小的體積不會受到由於化學和生物官能團包括在須晶的敷形塗層中的影響，因此增加了亳微結構表面的用途和對生物活性的特異性。我們相信本發明的生物吸附載體上結合的蛋白質數量的增加是由於實施例中所示的亳微結構表面的表面積增加了10至15倍。用對SDS的耐受性測定的牢固結合的生物分子的比率始終是高的，特別是對Pt，並且它代表了比常規載體性能的提高。不想受理論約束，但與常規的生物吸附載體相比，在天然氧化的純金屬底物上可以預期小的親水和疏水區域的均一性更好，這部分地解釋了更高的對SDS的耐受性和更高水平的結合數量。不想受理論約束，但據認為與絕緣(聚合物)材料相比，金屬底物(吸附劑)上的電荷容易重新分配，這也使溶解的生物分子易接近吸附劑-水界面而發生結合(在此處會產生色散力和靜電鏡像力)。當生物分子擴散進入或離開吸附劑時，與在均勻的平的吸附劑表面上發生的碰撞機會相比，在相對高的柱狀須晶間生物分子的有效截留將引起每單位隨機移動距離內有更多的生物分子/吸附劑間的碰撞機會。即，如果當生物分子接近須晶表面但不吸附而是擴散離開時，它將主要向另一個只有幾步「費克擴散」距離的須晶表面擴散，因為大多數須晶的表面是須晶的側面。在一個無此類結構的平的底物上，生物分子的一半時間是靜態擴散離開。碰撞率的增加可解釋吸附過程的動力學的改善。本發明的生物吸附載體可用於任何需要生物分子結合的場合。載體特別適於需要更牢固結合的生物分子，或更高密度或更高吸附速率的情況；例如，結合的生物分子數量限制了反應速度的場合。這類情況通常發生在酶反應器中，在這裡通常反應速率與酶濃度是表現出一級動力學。另一個例子是純化系統，其中系統的性能通常與某些官能團的數量成比例，如親和純化系統中的結合生物分子。另一個例子是分析測試，其中測試的靈敏度與檢測器分子(配體)的敏感性量成比例，且通常受檢測器分子的數量限制。如果結合的檢測器分子(通常是生物分子)的密度增加，結合的被分析物數量就增加，信號就增加。還有一個例子是結合的生物分子用作生物傳感器，其中檢測靈敏度隨結合的生物分子的數量而變。本發明的目的和優點還在下列實施例中進一步描述，但這些實施例中列舉的特定的材料和數量以及條件和細節不應被理解為本發明的限制範圍。所有的材料是工業上可獲得的或是該領域已知的，但加以描述或顯而易見的其他情況除外。所有的樣品除另有描述，均製備和分析三份，其平均值和標準偏差歸納列在下列表中。實施例對SDS的耐受性下面報告中的對SDS的耐受性百分比按下列公式計算[(牢固結合的蛋白質)÷(最初結合的蛋白質)]×100＝％對SDS的耐受性。它是耐受SDS增溶處理的蛋白質的百分數。實施例1-2一片3cm×10cm的玻璃微載物片，用銅進行RF噴鍍至厚度約為100nm。將有機顏料N，N』-二(3，5-二甲苯基)苝-3，49，10二(二羧醯亞胺)(PR149)以20nm/min的平均沉積速度真空(基礎壓力為約2.0×10-4帕斯卡)蒸氣相沉積在塗布銅的載物片上，至厚度為146nm。如美國專利No.4,812,352所述的那樣，將塗有有機顏料層的載物片在真空下退火至最高溫度為200℃，以使有機顏料層變成有不連續的垂直取向的結晶須晶的亳微結構層。然後大約一半的須晶狀有機顏料層用銅進行RF噴鍍，以在須晶上形成相當平面厚度約100nm的敷形塗層。由於須晶表面積比平面表面積大得多，因此銅塗層的有效厚度應遠遠小於100nm。大約三分之一的須晶用鉑噴鍍以形成相當於平面厚度為約100nm的敷形塗層。載物片剩下的約六分之一的面積不塗布，其上只有加上製備的裸PR149須晶。一個常用的空氣加壓塗料噴霧器可用於在敷形塗布的亳微結構層上噴塗一層包埋的膠乳前體(工業上可從3MCo.以商品名「STRIPPABLEMASKANTYR-43」獲得)，其形成的溼厚度為約0.157至0.165mm。然後包埋層在常規的空氣烘箱中在約66℃乾燥約20分鐘。從塗布的組合體的三個區域上分別切下一組(每組含有三個)邊長為5mm的正方形樣品，並用鑷子從載玻片上剝下。原先塗布在載玻片上的銅塗層仍在玻片上。第一組樣品含有以銅敷形塗布並包埋在可剝落的保護層中的須晶(實施例1)。三組樣品中的第二組樣品含有鉑敷形塗布並包埋在可剝落的保護層中的須晶(實施例2)。第一對照組是含有裸須晶(沒有敷形塗布)且包埋在可剝落的保護層中的5mm正方形的一組樣品。第二對照組是從乾燥的可剝落保護層上切下的一組三個5mm的正方形樣品，該保護層噴塗在鋼板上形成了一個無包埋的亳微結構的表面。由於有塗布金屬的須晶的樣品片其亳微結構表面有高度的光吸收效應，因此其看上去非常黑。部分包埋在可剝落保護層中的以鉑敷形塗布的須晶其表面比以銅敷形塗布的須晶表面更有紋理，圖2的SEM照片表示了以鉑敷形塗布的須晶表面。為測定蛋白質結合，每個正方形樣品在250μg/ml，125I放射標記的蛋白質A(GenzymeCorp.，Boston，MA)的磷酸鹽緩衝液中(0.15MNaCl在25mM磷酸鈉中)(這裡稱為PBS，pH7.5)振蕩恆溫反應18小時。色層分析雜誌，第512卷，345-363頁(1990)(J.Chromatog，vol.512，p.345-363(1990))。然後表面用3.0M，pH9.0的乙醇胺處理1小時，再用PBS衝洗四次。用Packard自動γ輻射計數儀(5230型，CanberraIndustriesInc./PackardInstrumentCo.，Meriden，CT)測定殘餘的放射性來得出蛋白質的最初結合水平。每一組樣品，即塗布鉑，塗布銅和未塗布的樣品均一式三份地進行製備和分析。膠乳對照品也一式三份地製備和分析。三個未塗布的，以鉑敷形塗布的和以銅敷形塗布的須晶樣品，以及膠乳對照品每單位面積吸附的蛋白質量的平均值和平均偏差歸納在表1中。然後樣品進一步在1％的SDS水溶液中於37℃下恆溫反應4小時，然後用SDS淋洗三次，以除去結合不牢固的蛋白質。再通過測定剩下的放射性以測定殘餘的牢固結合的蛋白質的量。三個樣品對SDS的耐受性和牢固結合的蛋白質密度的平均值和平均偏差歸納在表1中。值得注意的是，鉑敷形塗布的須晶樣品與其它樣品相比有顯著的較高的結合性和對SDS的耐受性。儘管，在SDS處理後，膠乳對照樣品和塗布銅的須晶樣品被損壞，未塗布樣品發生斷裂，但是樣品還可進行分析處理，結果列在表1。敷形塗布鉑的須晶仍保持完整。表1實施例3-4這些實施例採用相同類型的如實施例1和2製備的部分包埋的亳微結構樣品，但是恆溫反應的時間更短，所用的緩衝液也不同。將邊長為5mm樣品方片從如實施例1和2所述製備的的膠乳包埋的有須晶的樣品上切下，並將其與塗布銅的載玻片分離。從塗布銅和塗布鉑的區域和平面膠乳對照區上各切下6個方片。從裸須晶對照區域只切下三個方片。採用與實施例1和2所述相同的蛋白質A結合過程和測定方法，只是最初蛋白質恆溫反應時間為2小時而不是18小時，並用兩個不同的緩衝液。每種類型的三個方片用pH7.5的含蛋白質A的PBS塗布，其它三個方片用pH7.5，含蛋白質A的1.5M硫酸鈉的磷酸鈉緩衝液(下面稱為「硫酸鹽緩衝液」)塗布。三個從包埋的裸須晶樣品區域獲得的5mm的方片只用含蛋白質A的PBS緩衝液塗布。所有的樣品在乙醇胺鈍化後均用PBS淋洗三次。表2歸納了對於每種樣品類型和緩衝液條件的三份樣品的最初結合，對SDS的耐受性和牢固結合的蛋白質密度及標準偏差。表2證實了實施例1和2的結果，即塗布鉑的樣品比塗布銅或裸須晶能更好地吸附蛋白質，並繼續有很高的對SDS的耐受性的趨勢。對於鉑，硫酸鹽緩衝液可吸附更多的蛋白質。表2a(PBS)表2b(硫酸鈉)實施例5-8實施例5-8證明無包埋的須晶的亳微結構表面可在更短的暴露時間內吸附更多的蛋白質，並揭示不同金屬的相應效果，其與表面形態無關。這些實施例特別比較了四種金屬，它們均塗布在同一樣品的不同象限內，因此保證了每個須晶微結構是相同的，儘管在實施例9-12中有特別，但圖3顯示了以鉑敷形塗布的須晶，特別是用於本實施例的須晶的SEM顯微照片。在兩個不鏽鋼鋼圈之間拉伸安裝0.050mm(2mil)厚的聚醯亞胺薄層(ICIFilms)以形成一個直徑為8.3cm的片。在該聚醯亞胺底物片上rf噴鍍銅，形成的厚度約180nm。PR149紅顏料如實施例1-2所述用真空蒸氣沉積在塗布銅的聚醯亞胺上，形成大約150nm厚的塗層，然後在真空(基礎壓力為2.5×10-5帕斯卡)中於280℃退火40分鐘。塗布有紅色顏料的聚醯亞胺轉變成1-2μm高的取向的結晶須晶。在一個單獨的常規(13.47MHz)rf噴鍍真空器中，須晶連續地用Cu(實施例5)，CoCr(86∶14)(實施例6)和Fe(實施例7)沉積噴鍍分別敷形塗布在三個象限上，通過一個金屬網罩每次只暴露底物片的一個象限。20cm的靶在樣品上方10cm，底物用水冷卻，並使其在3.2帕斯卡Ar下用500瓦正向功率和1200-1600伏電壓靶偏壓噴鍍10分鐘。Cu，CoCr和Fe的等質量厚度分別為約350nm，250nm和250nm。在單獨的類似噴鍍容器中，鉑被噴鍍在底物片的第四象限，其等質量厚度為120nm(實施例8)。將第二個塗布銅的聚醯亞胺片用PR149蒸汽塗布，但不退火(即沒有須晶)來作為對照。Fe，Cu，CoCr和Pt塗層如實施例5-8所述同樣方式噴鍍沉積在未轉化的顏料層上。從亳微結構樣品片和對照樣品片的每個象限中切下邊長為5mm的六個方片(共有48片)。方片一式三份在含250μg/ml，125I標記的蛋白質A的PBS或硫酸鹽緩衝液中保溫兩個小時而不搖動或振蕩。所有的樣品均用適當的緩衝液淋洗。剩餘的未結合的表面用無放射性標記的BSA(牛血清白蛋白)溶液(2.5mg/ml，在PBS緩衝液中)在不搖動或振蕩下保溫或反應1小時來鈍化。如實施例1和2所述，在用PBS緩衝液衝洗三次後，通過測定剩餘的放射性來測定總的蛋白質A的結合量，如實施例1所述。然後用SDS處理，在不振蕩下除去未牢固結合的蛋白質。再測定放射性以測定牢固結合的蛋白質的密度。表3歸納了對於每種緩衝液，四種塗布金屬的須晶樣品類型的最初結合，對SDS的耐受性和牢固結合的蛋白質量。由於所有塗布金屬的PR149對照樣品沒有須晶結構，其在衝洗或用SDS處理後發生崩解，即覆蓋金屬層的苝塗層從聚醯亞胺底物上剝落，所以對照樣品沒有數據。所有的塗布金屬的須晶樣品在整個實驗中保持完整。表3a(PBS)表3b(硫酸鹽緩衝液)表3a和表3b的結果顯示，在僅僅兩個小時內，在所有步驟均不搖動或振蕩樣品的情況下，在未包埋的塗布金屬的須晶上牢固結合的蛋白質A的質量密度出乎意料地高。這些數量在數量級上大於實施例3-4的從被包埋的須晶獲得的數量。實施例9-14這些實施例研究了非包埋的，敷形塗布鉑的須晶的吸附動力學過程，其表明短達7.5分鐘的保溫時間足以實現顯著的結合，且也包括了另外兩個蛋白質，BSA和人IgG抗體。如實施例3-8所述，將片狀的直徑為8.3cm的塗布銅的聚醯亞胺用PR149蒸氣塗布，然後退火。如實施例5-8所述，將得到的亳微結構須晶用rf噴鍍壓力為1.3帕斯卡的Ar和200瓦正向功率進行Pt的敷形塗布以形成120nm的等質量厚度。圖3顯示了塗布鉑的須晶的放大倍數為150,000倍的高解析度SEM顯微照片。在須晶的鉑塗層上明顯有高度精細的結狀結構。從片上一式三份切下足夠數量的5mm樣品方片以對三個蛋白質(蛋白質A，人IgG抗體和BSA)，在PBS和硫酸鈉緩衝液系統中，採用五個保溫時間即7.5，15，30，60和120分鐘進行結合研究。125I標記的蛋白質A溶液與實施例1-8中的相同。三個蛋白質的濃度均為250μg/ml(BSA和人IgG在工業上均可從SigmaChemicalCo.獲得其無放射性的形式)。三個蛋白質溶液的氯化物濃度均為0.15M，pH為7.5。蛋白質A和BSA的硫酸鹽濃度為1.5M，pH為7.5，人IgG中硫酸鹽濃度為0.75M，pH為7.5。所有未反應的結合位點用無放射性標記的BSA溶液(2.5mg/ml)鈍化一小時，然後用PBS衝洗三次，一次30分鐘，另兩次洗10分鐘。實施例1所述的SDS處理過程用於使蛋白質變性，並除去未牢固結合的蛋白質。最後，用平面的未敷形塗布的聚醯亞胺膜的同樣的一組對照樣品進行操作。表4和6歸納了兩種緩衝液中不同的蛋白質類型和反應時間的最初結合質量密度，對SDS的耐受性和牢固結合的質量密度的三個測定值的平均值及其標準偏差。表5和7歸納了從未塗布的聚醯亞胺對照膜上取下的樣品對於三種蛋白質和兩種緩衝液在不同時間的最初結合質量密度，對SDS的耐受性和牢固結合的質量密度。圖4-6(曲線A-D)各自表示兩種緩衝液中最初結合和牢固結合的蛋白質對應於吸附時間的曲線。APBSBPBS(在SDS處理之後)C硫酸鹽緩衝液D硫酸鹽緩衝液(在SDS處理之後)E硫酸鹽緩衝液中的對照樣品FPBS中的對照樣品GPBS中的對照樣品(在SDS處理之後)H硫酸鹽緩衝液中的對照樣品(在SDS處理之後)首先，與實施例5-8一致，結合水平很高，且與人IgG和BSA的結合水平比與蛋白質A的結合水平更高。其次，結合水平在15分鐘後變為平穩，且在小於最小觀測時間7.5分鐘時就有顯著高的結合水平。第三，與實施例5-8不同，對於人IgG(hIgG)和蛋白質A來說，在PBS中的結合水平比在硫酸鹽緩衝液中要高。第四，對SDS的耐受性很高，且非常平均。表4下面歸納了在PBS中，塗布鉑的須晶對於三種蛋白質的蛋白質結合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標準偏差。表5下面歸納了聚醯亞胺膜對照樣品，在PBS中對於三種蛋白質的蛋白質結合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標準偏差。平面的未經塗布的聚醯亞胺對照樣品的結果進一步證明了平面的聚合物表面蛋白質吸附值相當低。在圖4-6中也繪出了對照樣品牢固結合的蛋白質量的平均值(曲線E-H)，其表明有亳微結構的膜在兩小時內比未塗布的聚醯亞胺可多吸附70倍的蛋白質。表6下面歸納了在硫酸鹽緩衝液中，塗布鉑的須晶對於三種蛋白質的蛋白質結合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標準偏差。表7下面歸納了聚醯亞胺膜對照樣品，在硫酸鹽緩衝液中對於三種蛋白質的蛋白質結合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標準偏差實施例15與圖3在吸附任何蛋白質之前的照片相比，圖7是放大倍數為150,000倍的高解析度掃描電子顯微照片，其表明了在不加振搖地吸附PBS中的蛋白質A(250μg/ml)一小時後再用水洗三次(每次10分鐘)後的同一塗布鉑的須晶樣品。在敷形塗布伯的須晶上可看見與圖3相同的超細紋理，只是紋理看上去並不明顯、清楚，好象解析度下降。在圖7中從蛋白質包覆的鉑須晶發出的次級電子發射並不象未暴露的須晶那樣高，即通常它們並不象未暴露的須晶那樣亮。這些觀察結果與在鉑上的第二層不導電的包覆層如蛋白質分子相符合，蛋白質分子位於噴鍍鉑的表面明顯高低不平的紋理的角落和縫隙內。未暴露的和暴露於蛋白質的須晶上的鉑塗層的粗糙度之間的區別可從所有的須晶上看出，即圖3和圖7的顯微照片是不同的。實施例16該實施例證明了結合到亳微結構膜上的蛋白質仍保持其生物活性，及亳微結構膜可用作蛋白質吸附載體。將銅塗布厚度為0.050mm直徑為8.3cm的聚醯亞胺片用PR149蒸氣塗布，並如實施例9-14一樣退火。得到的亳微結構須晶再如實施例9-14所述的用rf噴鍍(壓力為1.3帕斯卡的Ar)和200瓦正向功率進行鉑的敷形塗布至等質量厚度為120nm。圖3表示塗布Pt的須晶的高分辨SEM顯微照片。從亳微結構樣品片和未塗布的聚醯亞胺的對照層上各自切下兩組相同的每組為三個的5mm的方形片。第一組(組I)與300μL含濃度為250μg/ml的125I標記的蛋白質A的PBS(pH7.5)在室溫反應60分鐘。同時第二組(組II)同樣但與未標記的蛋白質A溶液在相同條件下反應。然後兩組均用500μL的含2.5mg/ml的BSA的PBS(pH7.5)在室溫下處理19小時。必須處理長時間以保證表面被完全封閉。如前述實施例一樣不進行搖動或振蕩，只是用輕微地迴蕩直至樣品被浸沒。這兩組均用500μL的純化水(從Millipore以商品名Milli-Q水獲得)洗4次，每次洗15分鐘。測定組I的放射性，而將組II在室溫真空乾燥箱內乾燥5小時。組II在室溫下與300μL含250μg/mld125I標記的人IgG的PBS(pH7.5)溶液保溫反應18小時。然後在測定放射性前將該組用500μLPBS清洗四次，每次洗15分鐘。表8歸納了結合到表面上的蛋白質A的量，結合的抗體和結合的蛋白質A之比，以及每單位表面積的抗體結合的量。表8下面歸納了蛋白質A上結合的人IgG抗體，蛋白質A固定在塗布鉑的有亳微結構的須晶上。表8顯示，樣品每單位面積上蛋白質S結合到亳微結構表面的量比聚醯亞胺對照膜50倍。結合的人IgG的量增加33倍，表明其生物活性大部分被保留。結果證明亳微結構的表面可用於從溶液中純化IgG並在固體載體上將其濃縮。對於該領域技術人員來說，不脫離本發明的範圍和精神的前提的許多改進和變化是顯而易見的，應當理解本發明並不能不適當地限於上面所述的描述性實施例。權利要求1.一種用生物吸附載體作為分離手段的方法，其中生物吸附載體包含一個支持亳微結構表面的惰性底物，亳微結構表面包含塗布金屬的，不連續的亳微結構單元，該單元的表面數密度在1-200/μm2。2.根據權利要求1所述的方法，其中每個亳微結構單元是含有兩個組分的單元，其中第一組分是定向排列的須晶，第二組分是生物分子吸附劑敷形塗層，敷形塗層塗布在第一組分上。3.根據權利要求1所述的方法，其中有生物活性的物質被吸附在生物吸附載體上。4.根據權利要求1所述的方法，其中亳微結構單元的高徑比大於3。5.一種組合體，包含(a)一種生物吸附載體，其包含一個支持亳微結構表面的惰性底物，亳微結構表面包含敷形塗布生物分子吸附劑的，定向排列的，不連續的亞微米大小的單元，該單元的表面數密度在1-200/μm2和(b)一個吸附在敷形塗布生物分子吸附劑的單元上的生物活性物質的單層，其中被吸附層有生物活性。6.根據權利要求5所述的組合體，其中生物分子吸附劑敷形塗層是貴金屬。7.一種用權利要求5所述的組合體作為分離手段，用作免疫測定的傳感器，抽提手段或過濾器中的至少一種的方法。8.一種組合體包含(a)一種生物吸附載體，其包含一個支持亳微結構表面的惰性底物，亳微結構表面包含敷形塗布生物分子吸附劑的，定向排列的，不連續的亞微米大小的單元，該單元的表面數密度在1-200/μm2和(b)一個吸附在敷形塗布生物分子吸附劑的單元上的第一生物活性物質單層，其中被吸附層有生物活性，和(c)一個吸附在第一生物活性物質單層上的第二生物活性物質單層。9.一種用權利要求8所述的組合體作為分離手段，用作免疫測定的傳感器，抽提手段或過濾器中的至少一種的方法。10.一種用權利要求8所述的組合體作為催化反應器的方法。全文摘要本發明提供生物測定方法和生物吸附載體,生物吸附載體包含一個支持有亳微結構表面的惰性底物,該表面包含塗布金屬的,定向排列的,不連續的亞微米大小的須晶。或者,敷形塗布金屬的須晶可被部分包埋或被第二種材料敷形塗布。毫微結構表面不需攪拌或振蕩即可快速且高度牢固地吸附結合生物分子。有利的是,結合的生物分子仍保留其生物活性。文檔編號G01N33/53GK1183735SQ96193700公開日1998年6月3日申請日期1996年4月1日優先權日1995年5月4日發明者P·L·科爾曼,M·K·迪布,J·B·斯託爾申請人:美國3M公司