一種檢測樣品中汞離子濃度的方法
2023-07-28 07:40:06
一種檢測樣品中汞離子濃度的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其包括：（1）設計與合成能與汞離子特異性結合的富含T鹼基的DNA探針分子；（2）將DNA探針分子與陽離子聚合物加入到緩衝液中，並向其中加入待測樣品及金納米溶液，進行T-Hg2+-T雜交反應；（3）金納米粒子發生聚集，體系顏色發生改變，測定相對吸光度值，確定所述待測樣品中的汞離子濃度。本發明所述方法能夠簡單、快速、準確地檢測樣品中汞離子濃度。
【專利說明】—種檢測樣品中汞離子濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分析化學領域，涉及一種檢測樣品中汞離子濃度的方法。
【背景技術】
[0002]核酸配子是一個單鏈的DNA或RNA分子，選擇性地綁定到各種具有高親和力的目標物如小分子、蛋白質和藥物等。與傳統的分子識別系統相比，寡核苷酸適配子由於容易合成而有很大的優勢。寡核苷酸適配子容易被標記，可以長期穩定存儲，具有優良的穩定性，、廣泛的適用性，以及高敏感特性。因此，它們的優異屬性使其在醫學診斷、環境監測、生物分析方面的應用有很大潛力。此外核酸配子可以與陽離子聚合物由於靜電引力而吸引相互纏繞。
[0003]汞是一種劇毒的全球性環境汙染物。汞離子的長時間沉積會造成土壤和水域環境的不可逆性汙染，水溶性汞離子是其中最常見也是最穩當的汞汙染物。無機汞能夠損傷哺乳動物的心臟，腎臟，胃以及小腸系統，對人類的危害顯而易見。因此，對於檢測水溶性汞離子的技術的開發隨之而來。目前對汞離子的檢測主要有光譜法和電化學兩大類，但這些方法往往還需要大量的預處理，增加了很多成本，而且對操作人員有很高的技術要求，所以不能滿足社會對實際樣品檢測的日益增加的需求。有學者發現了二價的金屬汞離子能夠與核酸中的兩個胸腺嘧啶鹼基(T)形成非常穩定的T-Hg2+-T配合物結構，基於這個重大發現，好多學者利用寡聚核苷酸對汞離子的特異性識別作用，分別構建了一系列對汞離子檢測的生物傳感器，這類傳感器具有選擇性好，特異性好的優點，成為最近人們研究的熱點。
[0004]作為現代四大標記技術之一的納米金標記技術(nanogold labellingtechique)，實質上是蛋白質等高分子被吸附到納米金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是納米金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合，而且吸附後不會使生物分子變性，由於金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中。利用氯金酸還原出的納米金溶液為酒紅色，當在其中加入少量電解質後，誘導金納米顆粒團聚，可使溶液由紅寶石色變為藍色，並最終凝集為無色，故在其中加入適當的鹽溶液或者陽離子聚合物時會導致溶液顏色的變化。
[0005]但目前未有理想的以納米金標記技術檢測樣品中汞離子濃度的技術方案。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，用以實現水中汞離子的簡單、快速、高靈敏檢測。
[0007]本發明通過以下技術方案來實現:
一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其特徵在於，包括:
(I)設計與合成能與汞離子特異性結合的富含T鹼基的DNA探針分子；(2)將DNA探針分子與陽離子聚合物加入到緩衝液中，並向其中加入待測樣品及金納米溶液，進行T-Hg2+-T雜交反應；
(3)金納米粒子發生聚集，體系顏色發生改變，測定相對吸光度值，確定所述待測樣品中的汞離子濃度。
[0008]DNA探針分子其中，所述的富含T鹼基的DNA探針分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其相對於緩衝液的濃度為ΙΟηΜ。
[0009]其中，結合文獻中的合成方法，所述的金納米粒子的濃度為4.9ηΜ，直徑為15nm，其在可見光523nm處有較好的吸光度。
[0010]其中，步驟(2)所述陽離子聚合物為聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)，TODA具有較高的探測限，且能與DNA較好的結合。所述緩衝液為Tris-HCl溶液。
[0011]其中，所述聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)相對於緩衝液的濃度為ΙΟηΜ，以獲得更準確的檢測結果。
[0012]本發明所述方法對於汞離子的檢測限為不低於0.02ng/mL。優選所述的待測樣品中汞離子濃度為0.05-10 ng/mL。
[0013]進一步的，基於下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度:
y=0.177+0.064x, y為不同汞離子濃度下的相對吸光度值，x為相應汞離子的濃度。由此，可以進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0014]根據本發明所述的技術方案，基於體系的顏色變化，確定所述樣品中的汞離子濃度是通過將所述體系的顏色與標準曲線進行比較而完成的，其中，所述標準曲線是基於已知萊離子濃度分別為 0ng/mL、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標準樣品進行平行實驗而建立的。從而進一步提高利用本發明方法進行汞離子濃度檢測的效率和靈敏度。
[0015]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
圖1是利用不同汞離子濃度標準樣品進行檢測所得到的紫外吸收曲線，其中汞離子濃度分別取 0ng/mL、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、lOOng/mL ；
圖2是本發明一個實施例建立的汞離子標準曲線圖；
圖3顯示了根據本發明一個實施例的特異性分析圖。
【具體實施方式】
[0017]為使實驗傳感條件最優化，本發明對TODA與TBA的最佳濃度做出了如下篩選試驗:
取7個小離心管，均加入500uL Tris-HCl (20 mM, pH 7.41)的緩衝液，在每個試管中加入聚二烯丙基二甲基氯化銨(^)04)，使其最終濃度分別為1、3、5、8、10、30和50 nM，然後向其中加入500uL的金納米溶液。可見光圖譜顯示，當I3DDA的濃度為1nM時，可見光吸收值最低，金納米粒子團聚程度最大，可知F1DDA的最優濃度為ΙΟηΜ。再取7個離心管,均加入500uL Tris-HCl (20 mM, pH 7.41)的緩衝液和終濃度為1nM的PDDA，將TBA加入到各離心管中，使其最終濃度分別為1、3、5、8、10、30和50 nM，混合併在室溫下穩定20min，然後向每個離心管中加入500uL的金納米溶液，由可見光吸收圖譜可知TBA的最優濃度為ΙΟηΜ。故以下實驗中I3DDA與TBA的濃度均選用1nM作為最優反應條件探測溶液中的汞離子。
[0018]實施例1設計與合成相應的寡核苷酸片段
通過查閱相關文獻，設計一段能夠對汞離子特異性識別且含T鹼基的DNA片段，序列通過DNA合成儀製備。
[0019]DNA探針分子(TBA)序列:
TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT (SEQ ID NO:1)
實施例2金納米顆粒的合成；
根據文獻報導，以檸檬酸鈉還原氯金酸獲得直徑為15nm的金納米粒子，獲得的金納米溶液的濃度為4.9nM，冷卻至室溫，在4°C下保存。
[0020]實施例3汞離子標準曲線的建立；
取7個離心管，將TBA(1nM)和PDDA(1nM)加入到500uL的Tris-HCl緩衝液中，向離心管中加入汞離子，使其終濃度分別為0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50和100 ng/mL，混合併在室溫下穩定20min，然後向每個離心管中加入500uL的金納米溶液，在波長為558處測量可見光吸收值，根據測定的不同汞離子濃度下可見光吸收值繪製汞離子濃度的標準曲線。如圖1所示，隨著汞離子的加入，金納米顆粒聚集度增大，從而導致吸光度降低，在汞離子濃度為零時，金納米溶液的吸光度為0.91 ;為使實驗展示出較好的效果，線性比較明顯，圖2中的吸光度值為空白溶液吸光值(0.91)減去加入汞離子溶液後得到的吸光度值。本傳感器的線性範圍0.05-10ng/mL，檢測限為0.02ng/mL。標準曲線的線性方程為y=0.177+0.064x, y為不同汞離子濃度下校正後得到的可見光吸收值，x為相應汞離子的濃度，線性相關性>0.98 (見圖1和圖2)
實施例4汞離子的特異性測定；
取5個小離心管，將TBA(1nM)和I3DDA(1nM)加入到500uL的Tris-HCl緩衝液中，向各離心管中分別加Hg2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Fe2+，使加入金屬離子的最終濃度為10ng/mL，混合併在室溫下反應20分鐘，然後向每個離心管中加入500uL的金納米溶液，在波長為558處測量可見光吸收值。由實驗結果得知這種基於比色檢測技術的汞離子檢測傳感器具有很高的特異性(詳見圖3)。
[0021]實施例5實際含汞粒子待測樣品的測定；
向自來水樣品中分別添加0.1 ng/mL、0.5ng/mL、l ng/mL及5 ng/mL的萊離子作為待測樣品，按照實施例1所述的方法設計與合成能與汞離子特異性結合的富含T鹼基的DNA探針分子，按照實施例2所述的方法製備金納米顆粒溶液；取4個離心管，在其中將TBA(1nM)和TODA(1nM)加入到500uL的Tris-HCl緩衝液中，向離心管中分別加入上述4個待測樣品，混合併在室溫下穩定20min，然後向每個離心管中加入500uL的金納米溶液，在波長為558處測量可見光吸收值，代入實施例3所建立的標準曲線(y=0.177+0.064x，y為不同汞離子濃度下的相對吸光度值，X為相應汞離子的濃度)，計算汞離子濃度，結果見表I:
表1:汞離子水樣品的測定
【權利要求】
1.一種檢測樣品中汞離子濃度的方法，其特徵在於，包括: (1)設計與合成能與汞離子特異性結合的富含T鹼基的DNA探針分子； (2)將DNA探針分子與陽離子聚合物加入到緩衝液中，並向其中加入待測樣品及金納米溶液，進行T-Hg2+-T雜交反應； (3)金納米粒子發生聚集，體系顏色發生改變，測定相對吸光度值，確定所述待測樣品中的汞離子濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的富含T鹼基的DNA探針分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的富含T鹼基的DNA探針分子相對於緩衝液的濃度為ΙΟηΜ。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的金納米粒子的濃度為4.9nM，直徑為 15nm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟(2)所述陽離子聚合物為聚二烯丙基二甲基氯化銨，緩衝液為Tris-HCl溶液。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述聚二烯丙基二甲基氯化銨相對於緩衝液的濃度為ΙΟηΜ。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述方法對於汞離子的檢測限為不低於0.02ng/mL。
8.根據權利要求1或7所述的方法，其特徵在於:所述的待測樣品中汞離子濃度為0.05-10 ng/mL。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:基於下列線性方程，確定所述樣品中汞離子的濃度: y=0.177+0.064x, y為不同汞離子濃度下的相對吸光度值，x為相應汞離子的濃度。
10.根據權利要求1或9所述的方法，其特徵在於:所述的相對吸光度值在波長558處測量得到。
【文檔編號】G01N21/78GK104076004SQ201410339731
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】朱穎越, 蔡義林, 丁鑫, 王立梅, 齊斌 申請人:常熟理工學院