含有枯草芽孢桿菌脂肪酶的洗滌劑組合物及其使用方法

2023-07-28 04:15:56 2

專利名稱：含有枯草芽孢桿菌脂肪酶的洗滌劑組合物及其使用方法
技術領域：
本發明的組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)克隆的脂肪酶、編碼所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。
背景技術：
當前的衣物洗滌劑和/或織物護理組合物包括諸如表面活性劑、酶(蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶)、漂白劑、助洗劑系統(builder system)、抑泡劑、懸汙劑、去汙齊U、螢光增白劑、軟化劑、分散劑、染料轉移抑制化合物、研磨劑、殺細菌劑和芳香劑之類的活性成分的複雜組合。脂肪分解酶(包括脂肪酶和角質酶)已被用於洗滌劑清潔組合物中，以通過水解甘油三酸酯產生脂肪酸來去除油潰。然而，清潔組合物中存在的表面活性劑和其它組分常常會抑制這些酶，幹擾其除去油潰的能力。因此，需要可在清潔組合物的苛刻環境中起作用的脂肪酶和角質酶。還需要有效進行轉酯反應以便製造生物燃料、潤滑劑以及其它合成和半合成烴的較為穩健且有效的脂肪酶和角質酶。優選地，這些酶將利用天然存在或常用的原料，而且在合成反應中不需要保護和去保護步驟，這些保護和去保護步驟會使合成變得複雜以及導致產生有毒廢產物。

發明內容
本發明組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶A(LipA)。在一些實施方案中，LipA與細菌纖維素酶催化結構域的羧基末端融合。在一些實施方案中，細菌纖維素酶是源自在位於荷蘭巴倫(Baam, The Netherland)的皇家荷蘭生物科技研究所培養物保藏中心(Central Bureau voor Schimme I cultures)以 CBS 670. 93 (稱為 BCE103)保藏的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株。在一些實施方案中，LipA通過可裂解連接物連接至BCE103纖維素酶。因此，在一些實施方案中，LipA不是融合蛋白。在本發明的一個方面中，提供了重組枯草芽孢桿菌LipA多肽。在一些實施方案中，重組LipA多肽與SEQ ID NO :3的胺基酸序列具有80%至99%的同一性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性)。在另外的實施方案中，重組LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實施方案中，重組LipA融合蛋白與SEQ ID NO :4的胺基酸序列具有至少80%的同一性(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性)。除非具體說明，否則本文使用的術語LipA多肽涵蓋LipA融合蛋白以及缺少融合搭配物的成熟LipA多肽二者。在一些實施方案中，LipA多肽是在枯草芽孢桿菌中表達。本發明還提供了表達載體，其包含以有效方式與啟動子組合的編碼LipA多肽的多核苷酸。在本發明的優選方面中，提供了洗滌劑組合物，其包含重組枯草芽孢桿菌LipA多肽。在一些實施方案中，重組LipA多肽與SEQ ID NO: 3的胺基酸序列具有至少80%的同一性(例如 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一丨I"生)。在其它實施方案中，重組LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實施方案中，重組LipA融合蛋白與SEQ ID NO :4的胺基酸序列具有至少80%的同一性(例如 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的同一性)。在一些優選的實施方案中，所述組合物包含表面活性劑(離子型或非離子型)。在一些實施方案中，表面活性劑包含選自如下的一者或多者十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚硫酸鈉、C14-15鏈烷醇聚醚-4。在一些實施方案中，表面活性劑包含離子型表面活性劑。在一些優選的實施方案中，離子型表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合。在一些實施方案中，洗滌劑是在8.0至10.0的pH值下配製。在一些實施方案中，洗滌劑選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質表面清洗劑。在一些實施方案中，洗滌劑是以選自液體、粉末、顆粒狀固體和小片的形式。在特別優選的實施方案中，在30°C至40°C的溫度下，LipA多肽在洗滌劑中具有酶活性。在相關的方面中，提供了洗滌劑組合物，其包含來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶和表面活性劑，其中所述洗滌劑組合物在去除待清潔表面的油潰方面比不含該脂肪酶的洗滌劑組合物更有效。在一些實施方案中，脂肪酶是LipA。在一些實施方案中，LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實施方案中，脂肪酶包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，脂肪酶包含與SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4具有至少95%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，脂肪酶是重組脂肪酶。在一些實施方案中，脂肪酶是在枯草芽孢桿菌中表達的重組脂肪酶。在一些實施方案中，表面活性劑是離子型或非離子型表面活性劑。在一些實施方案中，表面活性劑是一種或多種選自陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑。在一些實施方案中,表面活性劑包含一種或多種選自如下的表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚硫酸鈉和C14-15鏈烷醇聚醚-4。在一些實施方案中，洗滌劑組合物是在約8. 0至約10. 0的pH值下配製。在一些實施方案中，洗滌劑組合物是在約8. 2至約10. 0的pH值下配製。在一些實施方案中，洗滌劑組合物選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質表面清洗 齊U。在一些實施方案中，所述洗滌劑組合物的形式選自液體、粉末、顆粒狀固體和片。在一些實施方案中，洗滌劑組合物在約30°C至約40°C的溫度下有效水解脂質。
在一些實施方案中，與包含代替枯草芽孢桿菌脂肪酶的類產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶變體M21L (LIP0MAX )的洗漆劑組合物相比較，所述洗滌劑組合物在水解C4到C16底物方面更有效。在一些實施方案中，洗滌劑組合物還包含蛋白酶。在一些實施方案中，洗滌劑組合物還包含枯草桿菌蛋白酶。在另一個方面，提供了水解表面上的汙垢或汙潰中存在的脂質的方法，其包括使所述表面與包含重組LipA多肽和表面活性劑的洗滌劑組合物接觸。前一段落具體實施方式
和實例中的洗滌劑組合物適用於此目的。在另一個方面，提供了進行轉酯反應的方法，其包括使供體分子與包含重組LipA多肽的組合物接觸。在一些實施方案中，供體分子具有C4-16碳鏈。在一個優選的實施方案中，供體分子具有CS碳鏈。根據如下描述LipA組合物和方法的這些及其它方面將顯而易見。
具體實施例方式I.引言所描述的是涉及涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶A(LipA)的組合物和方法。這些組合物和方法部分基於以下觀察結果克隆並表達的LipA在存在洗滌劑組合物的情況下具有羧酸酯水解酶活性。LipA的這一特徵使其特別適用於多種清潔應用，在這些應用中所述酶可在存在於洗滌劑組合物中的表面活性劑和其它組分的存在下水解脂質。儘管LipA對多種天然和合成底物顯示出活性，但這種酶已顯示出對C4-C16底物的偏好，對CS底物具有峰值活性。這種特異性使得LipA特別適於水解短鏈甘油三酸酯以及適於進行涉及短鏈脂肪酸的轉酯反應。II.定義在詳細描述本發明組合物和方法之前，為清楚起見定義了以下術語。未定義的術語和縮寫應符合其本領域所使用的通常含義如本文所用，「羧酸酯水解酶」(E. C. 3. I. I)是指作用於羧酸酯的酶。如本文所用，「脂肪酶」、「脂酶」、「脂肪分解酶」、「脂肪分解多肽」或「脂肪分解蛋白」是指展現具有降解脂質的能力(如降解甘油三酸酯或磷脂的能力)的酶、多肽或蛋白質。脂肪分解酶可為例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角質酶。如本文所用，脂肪分解活性可根據本領域中已知的任何程序確定(例如參見古樸塔(Gupta)等人，生物技術與應用生物化學(Biotechnol Appl Biochem)，37 :63-71,2003 ;美國專利號 5，990，069 ;和國際公布號WO96/18729A1)。如本文所用，術語「脂肪酸」是指源自動物或植物脂肪或油或含於動物或植物脂肪或油中的羧酸。脂肪酸由通常含有4-22個碳原子的烷基的鏈構成，並以末端羧基(-C00H)為特徵。脂肪酸可為飽和的或不飽和的，以及為固體、半固體或液體。如本文所用，術語「甘油三酸酯」是指脂肪酸與甘油形成的任何天然存在的酯。甘油三酸酯是脂肪和油的主要組分。其具有通式CH2 (OOCR1) CH(OOCR2) CH2 (OOCR3)，其中R1' R2和R3可具有不同鏈長度。如本文所用，「醯基」是有機酸基團(RC0-)的通用名，通常是通過移除羧酸的-OH基團獲得。如本文所用，術語「醯化」是指通常在-OH基團側將醯基置換/添加到分子中的化
學轉化。如本文所用，「醯基鏈底物」是羧酸酯水解 酶(例如角質酶、脂肪酶、醯基轉移酶、轉酯酶等)的供體分子。這種底物可就其碳鏈長度進行描述。例如，C4底物/供體具有4個碳的鏈長度，CS底物/供體具有8個碳的鏈長度等等。如本文所用，術語「轉移酶」是指催化分子或基團(例如醯基)轉移至底物的酶。如本文所用，「離去基團」是指通過另一親核物質取代時從醯基供體裂解的親核物質。如本文所用，短語「洗滌劑穩定性」是指洗滌劑組合物混合物中指定洗滌劑組合物組分(如水解酶)的穩定性。如本文所用，「過水解酶」是能夠催化會導致形成適於諸如清潔、漂白和消毒之類的應用的過酸的反應的酶。如本文所用，在短語「水性組合物」和「水性環境」中使用的術語「水性」是指由至少50 %的水構成的組合物。水性組合物可含有至少50 %的水、至少60 %的水、至少70 %的水、至少80%的水、至少90%的水、至少95%的水、至少97%的水、至少99%的水或甚至至少99%的水。如本文所用，術語「表面活性劑」是指本領域通常認識到的具有表面活性性質的任何化合物。表面活性劑一般包括陰離子型、陽離子型、非離子型和兩性離子型化合物，本文中將進一步進行描述。如本文所用，「表面性質」用於指靜電荷，以及蛋白質表面所展現的諸如疏水性和親水性之類的性質。術語「氧化穩定性」是指本發明脂肪酶在本文中公開的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間(例如當暴露於漂白劑或氧化劑或者與漂白劑或氧化劑接觸時)常見的條件下，在給定時間段內保留規定量的酶活性。在一些實施方案中，脂肪酶在與漂白劑或氧化劑接觸指定時間段(例如至少約I分鐘、約3分鐘、約5分鐘、約8分鐘、約12分鐘、約16分鐘、約20分鐘等)後保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約92 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的脂肪分解活性。術語「螯合劑穩定性」是指本發明脂肪酶在本文中公開的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間(例如當暴露於螯合劑或與螯合劑接觸時)常見的條件下，在指定時間段內保留指定量的酶活性。在一些實施方案中，脂肪酶在與螯合劑接觸指定時間段(例如至少約10分鐘、約20分鐘、約40分鐘、約60分鐘、約100分鐘等)後保留至少約50%、約60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%或約99%的脂肪分解活性。術語「熱穩定性」和「熱穩定度」是指本發明脂肪酶在本文中公開的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間(例如當暴露於改變的溫度時)常見的條件下暴露於標識溫度指定時間段後保留指定量的酶活性。變化的溫度包括增加或降低的溫度。在一些實施方案中，脂肪酶在暴露於改變的溫度指定時間段(例如至少約60分鐘、約120分鐘、約180分鐘、約240分鐘、約300分鐘等)後保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約92 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的脂肪分解活性。術語「清潔活性」是指在本文中公開的脂肪水解、水解、清潔或其它處理期間的常見條件下由脂肪酶實現的清潔性能。在一些實施方案中，清潔性能是通過應用針對酶敏感性汙潰(例如草、血、奶或蛋蛋白)的多種清潔測定法，在汙潰經歷標準洗滌條件後通過多種色譜法、分光光度法或其它定量方法測定。示例性的測定法包括(但不限於)WO99/34011和美國專利6，605，458 (將二者以引用的方式併入本文)中所述的測定法，以及實例中所包括的那些方法。術語脂肪酶的「清潔有效量」是指特定清潔組合物中實現所需水平酶活性的前文所述脂肪酶的量。這種有效量易於由本領域普通技術人員確定並且依據許多因素，如所用的特定脂肪酶、清潔應用、清潔組合物的具體組成以及需要液體組合物還是乾燥(例如顆粒狀、條狀)組合物等。如本文所用，術語「清潔輔助材料」意指針對所需清潔組合物的特定類型和產品的形式(例如液體、顆粒、粉末、條、糊狀物、噴霧、片、凝膠；或泡沫組合物)選擇的任何液體、固體或氣體材料，這些材料還優選與組合物中使用的脂肪酶相容。在一些實施方案中，顆粒狀組合物為「緊湊(compact) 」形式，而在其它實施方案中，液體組合物為「濃縮」形式。如本文所用，「清潔組合物」和「清潔製劑」是指可用於從待清潔物品如織物、器皿、隱形眼鏡、其它固體表面、毛髮、皮膚、牙齒等去除不期望的化合物(例如汙垢或汙潰)的化學成分的混合物。所述組合物或配方可視待清潔的表面、物品或織物以及組合物或製劑的所需形式而呈液體、凝膠、顆粒、粉末或噴霧形式。如本文所用，術語「洗滌劑組合物」和「洗滌劑製劑」是指擬用於供清潔染汙物體的洗滌介質中的化學成分的混合物。洗滌劑組合物/製劑一般包含至少一種表面活性劑，並且可任選包含水解酶、氧化-還原酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍劑和螢光染料、抗結塊劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和增溶劑。如本文所用，「餐具洗滌組合物」是指用於清潔餐具(包括刀叉餐具)的組合物的所有形式，包括(但不限於)顆粒和液體形式。在一些實施方案中，餐具洗滌組合物是可用於自動洗碗碟機中的「自動餐具洗滌」組合物。無意於使本發明局限於任何特定類型或餐具 洗滌組合物。實際上，本發明可用於清潔任何材料(包括(但不限於)陶瓷、塑料、金屬、瓷器、玻璃、丙烯酸樹脂等)的餐具(例如器皿，包括(但不限於)盤子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀具(例如刀叉餐具，包括(但不限於)匙、刀、叉、服務用具等)。術語「餐具」在本文中用於指器皿和刀叉餐具二者。 如本文所用，術語「漂白」是指在適宜的pH和溫度條件下處理材料(例如織物、衣物、漿料等)或表面足夠長的時間以實現材料變亮(即，變白)和/或清潔。適於漂白的化學品的實例包括(但不限於)C102、H2O2、過酸、NO2等。如本文所用，變體脂肪酶的「洗滌性能」是指變體脂肪酶對洗滌的貢獻，其為組合物中未添加變體脂肪酶的洗滌劑提供附加的清潔性能。洗滌性能是在相關的洗滌條件下比較。術語「相關的洗滌條件」在本文中用於指在家居中實際用於器皿或衣物洗滌劑市場部分中的條件，尤其是洗滌溫度、時間、洗滌力學、泡沫濃度、洗滌劑類型和水硬度。如本文所用，術語「消毒」是指去除表面的汙染物以及抑制或殺死物品表面上的微生物。無意於本發明局限於任何特定的表面、物品或待去除的汙染物或微生物。本文的清潔組合物的「緊湊」形式最佳由密度反映，就組成來說，由無機填料鹽的量反映。無機填料鹽是呈粉末形式的洗滌劑組合物的常規成分。在常規洗滌劑組合物中，填料鹽是大量存在，通常為總組合物的約17重量％到約35重量％。相比之下，在緊湊組合物中，填料鹽以不超過總組合物的約15%的量存在。在一些實施方案中，填料鹽以不超過所述組合物的約10重量％，或更優選不超過約5重量％的量存在。在一些實施方案中，無機填料鹽選自鹼金屬和鹼土金屬硫酸鹽和氯化物。在一些實施方案中，優選填料鹽為硫酸鈉。如本文所用，術語「紡織物」或「紡織材料」是指織造物，以及適於轉變成或用作紗線、機織材料、針織材料和非織造物的人造短纖維和細絲。該術語涵蓋由天然以及合成(例如製造的)纖維製成的紗線。如本文所用，術語「純化」和「分離」是指以物理方式使對象分子(如LipA多肽)與其它分子(如蛋白質、核酸、脂質、培養基組分等)分離。一旦純化或分離，對象分子可佔樣 品中材料總量的至少50 %，且甚至至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%或更高(重量比)。如本文所用，「多肽」是指包含多個通過肽鍵連接的胺基酸的分子。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」可互換使用。蛋白質可任選經過修飾(例如糖基化、磷酸化、醯化、法尼基化、異戊烯化、磺酸化等)以增加功能性。當這些胺基酸序列展現活性時，其可稱為「酶」。使用胺基酸殘基的常規單字母或三字母代碼，其中胺基酸序列是以標準的氨基至羧基末端取向(即N — C)給出。術語「多核苷酸」涵蓋DNA、RNA、異源雙鏈體和能編碼多肽的合成分子。核酸可為單鏈或雙鏈的，而且可為化學修飾物。術語「核酸」與「多核苷酸」可互換使用。由於遺傳密碼具有簡併性，故可以使用不止一個密碼子來編碼特定胺基酸，並且本發明組合物和方法涵蓋編碼特定胺基酸序列的核苷酸序列。除非另作說明，否則核酸序列是以5'至3'取向提供。如本文所用，術語「野生型」和「天然的」是指自然界中存在的多肽或多核苷酸。關於多肽的術語「野生型」、「親本」或「參考」是指不在一個或多個胺基酸位置處包括人為製造的置換、插入或缺失的天然存在的多肽。類似地，關於多核苷酸的術語「野生型」、「親本」或「參考」是指不包括人為製造的核苷改變的天然存在的多核苷酸。然而，應注意，編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多核苷酸不局限於天然存在的多核苷酸，而涵蓋編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的任何多核苷酸。如本文所用，「變體多肽」是指通常利用重組DNA技術，通過一個或多個胺基酸的置換、添加或缺失而源於親本(或參考)多肽的多肽。變體多肽與親本多肽可能有少數胺基酸殘基不同，並且可通過其與親本多肽一級胺基酸序列的同源性/同一性水平來限定。優選地，變體多肽與親本多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的胺基酸序列同一性。序列同一性可使用諸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類的已知程序，使用標準參數測定。(參見例如沃茲查(Altschul)等人，(1990)分子生物學雜誌(J. Mol. Biol. 215 403-410);赫尼科夫(Henikoff)等人，(1989)美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad.Sci.USA)89 :10915 ;卡林(Karin)等人，(1993)美國國家科學院院刊，90 :5873 ;和海金斯(Higgins)等人(1988)基因(Gene) 73 :237-244)。執行BLAST分析的軟體可通過美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開可用。還可使用FASTA(皮爾森(Pearson)等人(1988)美國國家科學院院刊，85 =2444-2448)搜索資料庫。兩個多肽實質上一致的一個指示是第一多肽與第二多肽在免疫上交叉反應。通常，因保守胺基酸置換而不同的多肽具有免疫交叉反應性。因此，一種多肽與第二多肽實質上一致，例如，在此情況下兩個多肽僅因保守置換而不同。如本文所用，「變體多核苷酸」編碼變體多肽；與親本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性；或在嚴格條件下與親本多核苷酸或其互補序列雜交。優選地，變體多核苷酸與親本多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或甚至至少99 %的核苷酸序列同一性。測定同一性百分比的方法是本領域已知的並且上文剛進行描述。術語「源自」涵蓋術語「來源於」、「從獲得」、「可由獲得」、 「分離自」和「由產生」，並且通常是指一種指定材料來源於另一指定材料或者具有可參照另一指定材料描述的特徵。如本文所用，術語「雜交」是指用於使一條核酸鏈通過本領域已知的鹼基配對與互補連結合的方法。如本文所用，短語「雜交條件」是指進行雜交反應的條件。這些條件通常根據測量雜交的條件的「嚴格性」程度來分類。嚴格性程度可例如基於核酸結合複合物或探針的解鏈溫度(Tm)。例如，「最高嚴格性」通常在約Tm-5°C (比探針的Tm低5°C )下發生；「高嚴格性」通常在比Tm低約5至10°下發生；「中等嚴格性」通常在比探針Tm低約10到20°下發生；且「低嚴格性」通常在比Tm低約20到25°下發生。作為另一種選擇，或除此之外，雜交條件可基於雜交和/或一次或多次嚴格性洗滌的鹽或離子強度條件，例如6XSSC =極低嚴格性；3XSSC =低至中等嚴格性；1XSSC =中等嚴格性；且0. 5XSSC =高嚴格性。在功能上，可以使用最高嚴格性條件來鑑別與雜交探針具有嚴格的同一性或接近嚴格的同一性的核酸序列；而高嚴格性條件用於鑑別與探針具有約80%或更高序列同一性的核酸序列。對於需要高選擇性的應用，通常需要使用相對嚴格的條件來形成雜交物(例如，使用相對較低的鹽和/或高溫條件)。如本文所用，嚴格條件定義為50°C和0. 2 X SSC (I X SSC =0. 15M NaCUO. 015M 檸檬酸鈉，pH7. 0)。在關於至少兩條核酸或多肽的上下文中，短語「實質上相似和實質上相同」意指，多核苷酸或多肽包含與親本或參考序列具有至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或甚至至少約99%的同一性，或者不包括在不增加功能性的情況下僅為避開本描述所作的胺基酸置換、插入、缺失或修飾的序列。如本文所用，「表達載體」是指DNA構建體，其含有編碼指定多肽且有效連接至能夠實現該多肽在合適的宿主中表達的合適控制序列的DNA序列。這種控制序列包括實現轉錄的啟動子、控制這種轉錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列和控制轉錄和翻譯終止的序列。載體可以是質粒、噬菌體顆粒或僅僅是潛在基因組插入物。一旦轉化進適合宿主中，載體就可獨立於宿主基因組複製和發揮作用，或者在一些情況下可整合進基因組本身中。
術語「重組」是指例如通過使編碼序列突變以產生該變的多肽、將編碼序列與另一基因的編碼序列融合、使基因處於不同啟動子控制下、在異源生物體中表達基因、以降低或升高的水平表達基因、以不同於基因的天然表達譜的方式有條件地或組成地表達基因等，對遺傳物質(即，核酸、核酸編碼的多肽以及包含這些多核苷酸的載體和細胞)進行修飾以改變其序列或表達特徵。一般說來，重組核酸、多肽和基於它們的細胞已通過人進行操縱使得其與自然界中存在的相關核酸、多肽和細胞不相同。「信號序列」是指結合至多肽的N端部分，並且促進成熟形式的蛋白質從細胞分泌的胺基酸序列。細胞外蛋白質的成熟形式沒有信號序列，其在分泌過程期間被切除。術語「選擇標記」或「可選標記」是指能夠在宿主細胞中表達使得易於選擇含有所引入的核酸或載體的宿主的基因。可選標記的實例包括(但不限於)抗微生物物質(例如潮黴素、博來黴素或氯黴素)和/或賦予宿主細胞代謝益處(如營養益處)的基因。如本文所用，術語「調控元件」是指控制核酸序列表達的某一方面的遺傳元件。舉例來說，啟動子是促進有效連接的編碼區的轉錄起始的調控元件。另外的調控元件包括剪 接信號、聚腺苷酸化信號和終止信號。如本文所用，「宿主細胞」一般為以使用本領域已知的重組DNA技術構建的載體轉化或轉染的原核或真核宿主。轉化的宿主細胞能夠複製編碼蛋白質變體的載體或者表達所需的蛋白質變體。在載體編碼蛋白質變體的前體蛋白或前原蛋白形式的情況下，這些變體在表達時通常由宿主細胞分泌到宿主細胞培養基中。在將核酸序列插入細胞的語境中，術語「引入」意指轉化、轉導或轉染。轉化的手段包括本領域已知的原生質體轉化法、氯化鈣沉澱法、電穿孔法、裸DNA法等等。(參見常(Chang)和克汗(Cohen) (1979)分子遺傳學與普通遺傳學(Mol. Gen. Genet.), 168 111-115 ;史密斯(Smith)等人(1986)應用與環境微生物學(Appl. Env. Microbiol. )，51 634 ;和法拉利(Ferrari)等人所著的綜述文章,載於Harwood, Bacillus,派拉蒙出版公司(Plenum Publishing Corporation)，第 57-72 頁，1989)。如本文所用，術語「可選標記」或「可選擇基因產物」是指編碼酶活性的基因的使用，該酶活性給表達該可選標記的細胞賦予抗生素或藥物抗性。其它科技術語的含義與本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同(例如參見辛格立頓(Singleton)和薩斯布雷(Sainsbury),微生物學與分子生物學詞典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),第 2 版，約翰威立出版公司(John Wiley and Sons),紐約(1994);以及哈利(Hale)和馬哈姆(Marham),哈普柯林斯生物學詞典(The Harper Collins Dictionary of Biology),哈普派尼爾(HarperPerennial),紐約(1991))。除非文中另外明確說明，否則單數形式「一個」、「一種」和「所述」包括多個指示物。提供的小標題是出於便利的目的，不應解釋為限制。在一個小標題下包括的描述可適用於本說明書整體。III. LiDA多肽和多核苷酸A. LipA 多肽在一個方面，本發明組合物和方法提供了重組LipA多肽或其變體。示例性的LipA多肽是從枯草芽孢桿菌168分離的(GENBANK登錄號P37957)。成熟LipA多肽具有SEQ IDNO 3的胺基酸序列。類似地，實質上一致的LipA多肽可存在於自然界中，例如存在於枯草芽孢桿菌的其它菌株或分離株中。所公開的LipA多肽也可與細菌纖維素酶催化結構域的羧基末端融合。例如，細菌纖維素酶可源自在位於荷蘭巴倫的皇家荷蘭生物科技研究所培養物保藏中心以CBS 670.93(稱作此￡103)保藏的芽孢桿菌屬菌株。LipA多肽還可通過可裂解的連接物連接至BCE103纖維素酶。本發明組合物和方法涵蓋這些和其它重組LipA多肽。在一些實施方案中，重組LipA多肽是與實例性LipA多肽具有指定程度的胺基酸序列同源性，例如與SEQ ID NO :3的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同源性的變體LipA多肽。同源性可例如使用諸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之類的程序(如本文中所述)，通過胺基酸序列比對來測定。在一些實施方案中，重組LipA多肽包括不會實質上影響多肽的結構和/或功能的置換。示例性的置換是保守置換，如表I中所概述的。
_5] 表I.胺基酸置換
初始殘基代可接受的置換碼
丙氨酸 A D-Ala, Giy, P-AlaTL-Cys, D-Cys
權利要求
1.一種洗滌劑組合物，其包含 來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶,和 表面活性劑， 其中所述洗滌劑組合物在去除待清潔表面的油潰方面比不存在所述脂肪酶的洗滌劑組合物更有效。
2.根據權利要求I所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶為LipA。
3.根據權利要求2所述的洗滌劑組合物，其中所述LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。
4.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶包含與SEQIDNO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
5.根據權利要求4所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶包含與SEQIDNO :3或SEQID NO :4具有至少95%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
6.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶是重組脂肪酶。
7.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶是在枯草芽孢桿菌中表達的重組脂肪酶。
8.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑是離子型或非離子型表面活性劑。
9.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑是一種或多種選自陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑。
10.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑包含一種或多種選自如下的表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚硫酸鈉和C14-15鏈烷醇聚醚-4。
11.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其是在約8.0至約10. 0的pH下配製。
12.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其是在約8.2至約10. 0的pH下配製。
13.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質表面清洗劑。
14.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述組合物的形式選自液體、粉末、顆粒狀固體和片。
15.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物在約30°C至約40°C的溫度下有效水解脂質。
16.根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物在水解C4至C16底物方面比包含代替枯草芽孢桿菌脂肪酶的類產鹼假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)脂肪酶變體M21L (LIP0MAX )的等同洗滌劑組合物更有效。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的洗滌劑組合物，其還包含蛋白酶。
18.根據權利要求17所述的洗滌劑組合物，其還包含枯草桿菌蛋白酶。
19.一種用於水解表面上的汙垢或汙潰中存在的脂質的方法，其包括使所述表面與根據前述權利要求中任一項所述的洗滌劑組合物接觸。
20.一種用於進行轉酯反應的方法，其包括使供體分子與根據權利要求1-18中任一項所述的洗漆劑組合物接觸。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述供體分子包含C4-C16碳鏈。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述供體分子包含CS碳鏈。
全文摘要
本發明的組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶、編碼所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。所述組合物和方法特別適用於洗滌劑清潔組合物和方法中。
文檔編號C11D3/386GK102712878SQ201080058419
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月16日 優先權日2009年12月21日
發明者B·施密特, C·亞當斯 申請人:丹尼斯科美國公司