一種在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Pera9的方法

2023-07-17 01:05:41 2

專利名稱：一種在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，尤其 是一種在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
過敏性疾病是人類重大疾病之一。其發病率目前估計約佔世界 人口的30~40%，而且正以每年大於1°/。的速度增加，以兒童患者的 發病率上升最為明顯。我國近年來對全國的大規4莫調查顯示，兒童 哮喘發病率比10年前明顯增加，僅小兒哮喘患者達1000萬之多， 其中過敏為主要誘因(全國哮喘兒童防治協作組2003)。此外，與癌 症和心腦血管疾病不同，哮喘對人類社會和經濟的影響是不能簡單 地以其死亡率來衡量的，而要從這種疾病的發作頻度來衡量其給人 類造成的經濟負擔。由於哞喘多發生在年輕人群，其對人類社會和 經濟的影響就更嚴重。早在上世紀60年代，就有蟑螂引起哮喘的報 道。但直到近年來，蟑螂在哞喘發病中的作用才逐漸受到人們的關 注。資料顯示，美國哮喘患者中蟑螂過敏的發生率達到27. 5 ~ 42%， 歐洲為3.9-24.5%,非洲為30~44.6%，在我國，北京、上海等 大城市中兒童哮喘患者的蟑螂過敏率也高達27. 8 ~ 43. 8 % 。哮喘發 病率的不斷升高，在很大程度上與蟑螂汙染加劇有關，蟑螂已經成 為僅次於塵蟎的第二大過敏源。目前常見的美洲大蠊和德國小蠊過 敏原已經被鑑定出來，包括3種美洲大蠊過敏原和7種德國小蠊過 敏原被鑑定出來。目前，治療過敏性疾病的方法主要體現在減輕症 狀。有以下方法1.利用抗組胺類以及類固醇藥物以緩解症狀，但是這些藥物並不能抑制IgE抗體的產生並經常帶來副作用。2.採用 特異性免疫治療(脫敏治療)在過敏性疾病中的作用得到了肯定，其 原理是通過反覆給藥誘導患者對此過敏原產生耐受性，當患者再 次接觸此類過敏原時，過敏反應就會減輕或是不產生反應。然而， 用於治療的過敏反應提取物是從天然來源分離得到的蛋白質和非蛋 白質成分的粗混合物，這些資源含有大量與過^:原無關的成分，或 者幾乎不含有造成患者高敏感性的過敏原，因此療效不佳。3.利用 基於單克隆抗體的免疫試驗對主要過敏原含量進行鑑定，在過敏反 應提取物的標準化方面取得了重要進展，其不利因素是對一種特 定的過敏反應提取物敏感的患者都必須接受含全部提取物成分的相 同的複雜混合物的治療，會導致副作用的產生，就過敏診斷而言， 這種使用整個過敏反應提取物來進行皮膚測試的方法妨礙了導致患 者敏感的特殊過敏原的檢測。4.採用生物化學分離和純化技術的方 法得到單獨的過^:原。儘管這個方法對於過敏原的鑑定可能有效， 但卻不足以製備工業規模上的過敏原。因為純化工藝複雜，其過程 極其耗費人力，並且在通常情況下，從昂貴的自然資源中純化出過 敏原產量都很低。基於上述原因，用於合成過敏原蛋白質的重組DNA 技術引起了人們的注意。利用可生長在大發酵罐的微生物表達系統 可以大規模獲得重組過敏原，這些技術使得重組過敏原以一致純度 大量生產。除此以外，使用重組DM技術可以表達抗原表位片斷或 修飾的過敏原以方便應用於過敏性疾病的診斷或處理。目前，利用 重組DNA技術生產過敏原Per a 9蛋白只是在大腸桿菌中被表達， 並沒有在其他系統表達的報導，且在大腸桿菌中被表達的Per a 9 蛋白的特異性IgE結合活性不高。

發明內容
本發明的目的是針對以上現有技術存在的缺點，提出一種在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白的方法，解決天然過
敏原Per a 9蛋白純化工藝複雜、特異性IgE結合活性不高的問題。 本發明的目的通過以下技術方案實現 一種在杆狀病毒-昆蟲表 達系統中生產美洲大蠊過^:原蛋白Per a 9的方法，其步驟包括
(1) 從美洲大蠊組織中提取總RNA;
(2) 將總RNA反轉錄為cDNA,以cDNA為模板，用引物
獲得美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白的編碼基因；
(3) 將Per a 9蛋白的編碼基因克隆到杆狀病毒載體中，轉染 昆蟲細胞誘導表達Per a 9蛋白；
(4) 釆用親和層析方法對Per a 9蛋白進行純化，從而得到美 洲大蠊過敏原Per a 9蛋白。
在上述生產方法中，所述步驟(2)中PCR反應條件為94。C預變 性10分鐘後，94。C30秒變性、50。C45秒退火、72。Cl分鐘延伸，進 4亍35個循環。
所述Per a 9蛋白的編碼基因如SEQ ID No: 1所示。
所述Per a 9蛋白的編碼基因所編碼的胺基酸序列如SEQ ID No: 2所示。與基因資料庫(Genbank)中收錄的美洲大蠊過敏原精氨酸酯 酶序列有5個位點胺基酸差異，分別是第76位為Gly (資料庫為 Ala )，第161為Gly (資料庫的Ala )，第163為Leu (資料庫為Phe )， 第169為Phe (資料庫為Leu)，第258為Ser (資料庫為Phe )。
所述步驟(3)中，杆狀病毒載體為pFastBacHTA。
所述步驟(3)中，昆蟲細胞為sf-9細胞。
所述步驟(4)中，親和層析的方法為Nickel親和層析法，具 體步驟是將PO病毒以感染複數為1感染sf9細胞，待細胞出現 腫脹時收集細胞，經超聲裂解細胞，離心得到上清液，上Nickel親和柱，用Tris-HC1緩衝液進行洗脫，第一次洗脫去非特異性結合蛋 白，第二次洗脫下的蛋白即為Per a 9蛋白。其中，在第一次洗脫 步驟中，Tris-HCl緩衝液含300mM NaCl和5%甘油；第二次洗脫步 驟中，Tris-HC1緩衝液含300mM NaCl、 250mM咪哇和5%甘油。
杆狀病毒具有高度的種屬特異性，不感染脊推動物，相對於其 他病毒載體，如&泉病毒、痘病毒等載體而言，其安全性好。Per a 9 是來源於昆蟲(蟑螂)的蛋白，在昆蟲細胞中表達能保證表達產物 具有活性，蛋白質表達後修飾加工，信號肽的切除及磷酸化、糖基 化等反應，抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似。杆狀病毒-昆蟲 細胞表達系統，其表達產物的生物學特性與天然產物相似，具有可糖 基化、磷酸化、醯胺化、信號肽和蛋白切割等後加工修飾功能，而 且具有很高的克隆容量，表達產量高，細胞培養筒單，適合大規模 生產。其特異性IgE結合活性比其它系統要高。基於上述原理，本發 明通過杆狀病毒-昆蟲表達系統生產美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白， 從而避免在不同的表達系統中(例如細菌和酵母菌)對Per a 9過 敏原結構造成影響的問題，並提供一種親和層析的方法，解決天然 Per a 9過敏原純化工藝複雜的問題。使用杆狀病毒-昆蟲表達系統 得到的Per a 9蛋白的活性是使用大腸桿菌得到的Per a 9蛋白活 性的2. 1倍。


圖1為重組Bacmid的PCR鑑定圖。其中，l.鑑定陽性的重組 Bacmid。
圖2為重組Bacmid誘導表達及其純化的SDS-PAGE圖語。其中 1.重組質粒感染的sf-9全細胞裂解物；2.上清上Nickel柱後穿 透峰；3.用2OmM Tris-HCl (含有300mM NaCl， 5%甘油，pH8. 0) 洗下的蛋白；4-5.用2OmM Tris-HCl (含有300mM NaCl 5%甘油，20mM咪哇，pH8. O)洗脫後的蛋白；6.用20rnM Tris-HCl (含有300mM NaCl 5°/ 甘油，250mM咪唑，pH8. 0)洗脫下的蛋白。
圖3為純化後的蛋白(Per a 9)免疫印跡(Western blot) 鑑定圖。
具體實施方式
實施例一
l.本實施例的步驟如下
(1)從美洲大蠊組織中提取總RNA;取人工伺養的凍存美洲大蠊 (來自江蘇省疾病控制中心)，液氮研磨，^t安照lOOmg組織/mL Trizol 試劑加入Trizol試劑。靜置10min,而後按照300ul/mL加入氯仿， 混勻，靜置lOmin, 12000g離心10min，棄上清，按500ul/mL加入 異丙醇。混勻，靜置10min， 12000g離心lOmin,棄上清，管底沉澱 即為美洲大蠊總RNA。加入75°/。乙醇懸浮沉澱，12000g離心lOmin, 棄上清。室溫乾燥5min,加入無核糖核酸酶的雙蒸水溶解。
(2 )以提取的美洲大蠊總RNA為模板，採用TakaRa公司反轉錄 試劑盒，以多聚脫氧胸腺嘧。定(10 pmol/ul)為引物進行反轉錄試驗產 生cDNA。以基因悽t據庫(genbank)美洲大蠊過每文原Per a 9基因序 列設計引物 5 ， -ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA-3 ， 和 5 ， -TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT-3',用PCR方法(94。C預變性10分鐘後， 94。C30秒變性、5(TC45秒退火、72°C1分鐘延伸，進4亍35個循環。) 擴增出Per a 9基因，用TakaRa公司PCR產物純化試劑盒純化PCR 產物。與pMD18-T載體16。C連接過夜，轉化到大腸桿菌JM109感受 態細胞中。塗板過夜培養。篩選陽性菌，用TakaRa公司質粒抽提試 劑盒抽提質粒並PCR鑑定正確。送到南京金思特公司測序，確定美洲 大蠊過敏原Per a 9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
(3)將Per a 9蛋白的編碼基因克隆到杆狀病毒載體中，轉染昆蟲細胞誘導表達Per a 9蛋白；首先構建美洲大蠊過壽丈原Per a 9 杆狀病毒載體pFastBacHTA:將得到的Per a 9基因通過EcoR I and Sal I酶切位點克隆到質粒pFastBacHTA中，轉化感受態JM109。 PCR 鑑定篩選出陽性克隆。以含有Per a 9基因的pFastBacHTA質粒轉 化感受態DH10Bac，在DH10Bac菌內質粒助手的幫助下，Per a 9基 因可轉座到含杆狀病毒基因組的Bacmid大質粒上。得到重組 Bacmid。抽提重組Bacmid， PCR鑑定。結果見圖1,能擴增出目的條 帶，說明Per a 9基因已經重組到Bacmid。將PCR鑑定陽性的重組 Bacmid，用Cellfectin試劑盒轉染昆蟲細胞Sf9。在HyQ液體培養 基中27。C培養7天後。收集上清得到PO病毒。
(4)採用親和層析方法對Per a 9蛋白進行純化，從而得到美 洲大蠊過敏原Per a 9蛋白。首先進行PI病毒擴增PO代病毒以 感染複數0. 1感染lOOmL sf9細胞(2 x 106/ml ) ， 4天收集上清得 到P1代病毒(4 dpi)。再進行大規模感染和純化
PI代病毒以感染複數為1感染500mL sf 9細胞(2 x l06/ml )， 到細胞出現腫脹的時候收集細胞。超聲裂解細胞離心得到上清。上 Nickel親和柱，用20mM Tris-HCl (含有300mM NaCl， 5%甘油)洗 去非特異性結合蛋白後，改用20mM Tris-HC1 (含有300mM NaCl, 250mM咪唑，5%甘油)洗脫，洗脫下的蛋白即為Per a 5蛋白。釆用 SDS-PAGE進行表達鑑定(圖2中lane 6中25-35kDa之間為Per a 9蛋白)。用His單抗估夂western blot,發J見在25—35kDa之間有反 應條帶(圖3),表明Per a 9蛋白被誘導表達並純化。 2.對表達出的Per a 9蛋白的特異性IgE結合活性進行測定
採用間接ELISA方法分別測定杆狀病毒-昆蟲表達系統和大腸 桿菌生產的Per a 9蛋白的特異性IgE結合活性。
杆狀病毒-昆蟲表達系統生產的Per a 9蛋白，即由實施例一步驟(4 )之後所純化的Per a 9蛋白；大腸桿菌生產的Per a 9蛋 白為本試驗製備，是將實施例一步驟(2 )之後所得的如SEQ ID No: 1所示的美洲大蠊過敏原Per a 9基因，克隆到pET15b質粒中，轉化 的大腸桿菌ArcticExpressTM (DE3) RP，用0.5 mMIPTG誘導表達過 夜，收集菌體，超聲破碎後離心收集上清，用Nickel親和柱純化得 到。
將杆狀病毒-昆蟲表達系統和大腸桿菌生產的Per a 9蛋白(為 本試驗室製備)稀釋成lug/ml,高親和板每孔加入Per a 9蛋白50 ul, 37度保溫1小時，洗滌3遍。用1%小牛血清蛋白溶液封閉2h 後，洗滌3遍。加入稀釋10倍後的6個美洲大蠊過敏陽性混合血清 和3個蟑螂過敏陰性混合血清50ul,保溫lh，洗滌3遍。每孔加1: 150000的偶聯辣根過氧化物酶的羊抗人IgE 50ul， 37度保溫40分 鍾，洗板5遍。加入50ul四曱基聯苯胺(TMB)和過氧化氫。閉光反 應5分鐘，加入50ullM ^e克酸終止反應。在450nm處測定OD值。美 洲大蠊過敏陽性混合血清和美洲大蠊過敏陰性混合血清450nm處測 定OD值得差值可表示為Per a 9蛋白的特異性IgE結合活性。測定 的OD值分別為1. 5和0. 7。結果表明杆狀病毒-昆蟲表達系統生產 的Per a 9蛋白的特異性IgE結合活性是大腸桿菌生產的Per a 5 蛋白的2.1倍。說明杆狀病毒-昆蟲表達系統生產的Per a 9蛋白 優於大腸桿菌生產的Per a 9蛋白。
除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替 換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護範圍。SEQUENCE LISTING
〈110〉江蘇省人民醫院
〈120〉 一種在杆狀病毒一昆蟲表達系統生產美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白的方 法
4
Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1068
〈212〉 DNA
<213〉 美洲大蠊(American cockroach) 〈220〉
〈221> CDS
〈222> (l).. (1068)
〈400〉 1
ATGGTGGACG CCGCAGTTCT GGAGAAGCTG GAGGCCGGCT TCGCCAAATT GGCCGCCTCC 60 GACAGCAAGT CCCTGCTCAA GAAGTATCTG ACCAAGGAAG TGTTCGACAA TCTCAAGACC 120 AAGAAGACTC CTTCATTTGG CTCTACACTT CTTGATGTAA TCCAGTCTGG TCTCGAGAAC 180 CACGACTCCG GCGTGGGCAT CTACGCCCCA GACGCTGAAG CTTATGGCGT GTTCGCTGAC 240 CTGTTCGACC CCATCATTGA GGACTACCAT GGTGGCTTCA AGAAGACCGA CAAGCACCCT 300 CCCAAGGACT GGGGTGATGT GGACACCCTG GGCAACCTGG ACCCTGCTGG CGAGTACATC 360ATCTCCACAC GAGTGAGGTG CGGTCGCTCC ATGCAGGGCT ACCCCTTCAA CCCCTGCTTG 420 ACTGAAGCCC AGTACAAGGA GATGGAGGAC AAGGTGTCCA GCACGCTGTC CGGCCTGGAG 480 GGCGAGCTGA AGGGCCAGTT CTACCCCCTC ACCGGCATGA CCAAGGAGGT CCAGCAGAAG 540 CTCATTGATG ACCACTTCCT CTTCAAGGAG GGCGATCGCT TCTTGCAGGC TGCCAACGCA 600 TGCCGCTTCT GGCCCACTGG ACGAGGCATC TACCACAACG ACGCCAAGAC GTTCCTGGTC 660
CAGGTGTACC GCCGTCTGGT GACGGCTGTG AATGACATCG AGAAGCGCAT CTCCTTCTCG 780 CACGACGACC GTCTGGGCTT CCTCACCTTC TGCCCCACCA ACCTGGGCAC CACCGTGCGT 840 GCGTCTGTGC ACATCAAGGT GCCCAAGCTG GCTGCCGACA AGGCCAAGCT GGAGGAGGTT 900
960
GAGMGAACG ACGGCATCGC CGAGCTGATC AAGCTGGAGA GCTCGCTC 1068
〈210〉 2
〈211〉 356
<212〉 PRT
美洲大蠊(American cockroach)
2
MVDAAVLEKLEAGFAKLAASDSKSLLKKYLTKEVFDNLKTKKTPSFGSTLLDVIQSGLEN HDSGVGIYAPDAEAYGVFADLFDPIIEDYHGGFKKTDKHPPKDWGDVDTLGNLDPAGEYI ISTRVRCGRSMQGYPFNPCLTEAQYKEMEDKVSSTLSGLEGELKGQFYPLTGMTKEVQQK LIDDHFLFKEGDRFLQAAMCRFWPTGRGIYHNDAKTFLVWCNEEDHLRIISMQMGGDLG QVYRRLVTAVNDIEKRISFSHDDRLGFLTFCPTNLGTTVRASVHIKVPKLAADKAKLEEV AGKYNLQVRGTRGEHTEAEGGVYDISNKRRMGLTEYDAVKEMNDGIAELIKLESSL
〈210〉 3
23
腿〈213〉 Artificial <220〉
<223〉根據基因資料庫美洲大蠊過敏原Pera 9基因序列設計引物
3
ATGGTGGACG CCGCAGTTCT GGA 23
〈210〉 4
〈211〉 20
<212〉 DNA
Artificial

根據基因資料庫美洲大蠊過敏原Pera9基因序列設計引物
4
TTAGAGCGAG CTCTCCAGCT 20
權利要求
1.一種在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，其步驟包括(1)從美洲大蠊組織中提取總RNA；(2)將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，用引物ATGGTGGACGCCGCAGTTCTGGA和TTAGAGCGAGCTCTCCAGCT進行PCR反應，獲得美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白的編碼基因；(3)將Per a 9蛋白的編碼基因克隆到杆狀病毒載體中，轉染昆蟲細胞誘導表達Per a 9蛋白；(4)採用親和層析方法對Per a 9蛋白進行純化，從而得到美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白。
2. 根據權利要求1所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於所述步驟(2)中PCR反應條件為94。C預變性10分鐘後，94。C30秒變性、5(TC45秒退火、72°C1分鐘延伸，進行35個循環。
3. 根據權利要求1所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過壽l原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於所述Per a 9蛋白的編碼基因如SEQ ID No: 1所示。
4. 根據權利要求1所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過彰:原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於所述Per a 9蛋白的編碼基因所編碼的胺基酸序列如SEQ ID No: 2所示。
5. 根據權利要求1所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於所述步驟(3)中，杆狀病毒載體為pFastBacHTA。
6. 根據權利要求1所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於所述步驟(3)中，昆蟲細胞為sf-9細胞。
7. 根據權利要求1所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於所述步驟(4)中，親和層析的方法為Nickel親和層析法，具體步驟是將P0代病毒以感染複數為l感染sf9細胞，待細胞出現腫脹時收集細胞，經超聲裂解細胞，離心得到上清液，上Nickel親和柱，用Tris-HCl緩衝液進行洗脫，第一次洗脫去非特異性結合蛋白，第二次洗脫下的蛋白即為Per a 9蛋白。
8. 根據權利要求7所述在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，其特徵在於第一次洗脫步驟中，Tris-HC1緩沖液含300mM NaCl和5%甘油(體積比)；第二次洗脫步驟中，Tris-HC1緩沖液含300mMNaCl、 250mM咪哇和5%甘油(體積比)。
全文摘要
本發明涉及一種生產美洲大蠊過敏原蛋白Per a 9的方法，尤其是一種在杆狀病毒-昆蟲表達系統中生產美洲大蠊過敏原蛋白Pera 9的方法，屬於基因工程技術領域。本發明通過杆狀病毒-昆蟲表達系統生產美洲大蠊過敏原Per a 9蛋白，從而避免在不同的表達系統中(例如細菌和酵母菌)對Per a 9過敏原結構造成影響的問題，並提供一種親和層析的方法，解決天然Per a 9過敏原純化工藝複雜的問題。使用杆狀病毒-昆蟲表達系統得到的Per a 9蛋白的活性是使用大腸桿菌得到的Per a 9蛋白活性的2.1倍。
文檔編號C12P21/02GK101591674SQ20091003190
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月2日 優先權日2009年7月2日
發明者何韶衡, 魏繼福 申請人:江蘇省人民醫院