心臟肥大的治療方法

2023-07-16 23:29:06 2

專利名稱：心臟肥大的治療方法
技術領域：
本發明主要涉及γ幹擾素對心臟肥大的作用。更具體地說，本發明涉及用γ幹擾素預防或治療心臟肥大及相關病症。
背景技術：
γ幹擾素(IFN-γ)幹擾素是受到病毒或某些其它物質侵襲的細胞分泌的較小的單鏈糖蛋白。目前，幹擾素主要分三類白細胞幹擾素(幹擾素-α,α幹擾素，IFN-α)，成纖維細胞幹擾素(幹擾素β,β幹擾素，IFN-β)和免疫幹擾素(幹擾素-γ,γ幹擾素，IFN-γ)。在對病毒感染的應答中，淋巴細胞主要合成α幹擾素(另有少量與之不同的一種幹擾素，一般稱之為ω幹擾素)，對成纖維細胞的感染則通常誘導產生β幹擾素。α幹擾素與β幹擾素具有約20-30％的胺基酸序列同源性。人IFN-β的基因沒有內含子，編碼的蛋白與人IFN-αⅠ具有29％的胺基酸序列同源性，這說明IFN-α與IFN-β來自同一祖先(Taniguchi等，Nature 285,547-549(1980))。相反，IFN-γ不是由病毒感染誘導而是由淋巴細胞應答促分裂原而合成的，而且在胺基酸序列上與另兩類幹擾素沒有什麼關係。已知α幹擾素與β幹擾素誘導MHCⅠ類抗原，IFN-γ則誘導MHCⅡ類抗原的表達並增強靶細胞呈遞與MHCⅠ類分子結合的病毒肽供細胞毒T細胞識別的效果。
IFN-γ是幹擾素家族中的一員，具有α和β幹擾素(IFN-α和β)抗病毒和抗增殖的特性，但與它們的不同的是對PH2不穩定。IFN-γ原本由促分裂原誘導淋巴細胞而產生。Gray,Goeddel與其同事最早報導了重組生產人IFN-γ(Gray等，Nature295,503-508),這也是美國專利4,762,791,4,929,544,4,727,138,4,925,793,4,855,238,5,582,824,5,096,705,5,574,137和5,595,888的主題。Gray和Goeddel在大腸桿菌中產生的重組人IFN-γ有146個胺基酸,該分子N末端的開始為CysTyrCys。後來發現，天然人IFN-γ(即，促分裂原誘導人外周血淋巴細胞產生並純化得到的)多肽沒有Gray等(同上)所述的CysTyrCys N末端。最近，測定了大腸桿菌產生的重組人IFN-γ(rhIFN-γ)的晶體結構(Ealick等，Science 252,698-702)，顯示該蛋白是一種相互緊密纏繞的非共價二聚體，其中的兩條多肽鏈相互反平行。
已知IFN-γ具有許多生物活性，包括抗腫瘤、抗菌和免疫調節活性。一種形式的重組人IFN-γ(rhIFN-γ-1b,Actimmune,Genentech,Inc.South San Francisco,Califonia)是市售的一種用於治療慢性肉芽腫病的免疫調節藥，該病的特徵是吞噬細胞功能失常引起的皮膚、淋巴結、肝、肺和骨嚴重、反覆感染(Baehner,R.L.,Pediatric Pathol.10,143-153(1990))。還有人提出用IFN-γ治療變應性皮炎，一種常見皮膚炎症，表現為嚴重瘙癢，病程遷延反覆，間或惡化，獨特的皮膚損傷臨床形態和分布(參見PCT申請，WO91/07984，公開於1991年6月13日)，血管狹窄，包括治療血管成形術和/或血管手術後的再狹窄(PCT申請WO90/03189，公開於1990年4月5日)，各種肺病，包括呼吸困難症候群(RDS)，例如成人呼吸困難症候群(ARDS)和新生兒型，又稱自發性RDS或肺透明膜病(PCT申請WO89/01341，公開於1989年2月23日)。此外，已有人提出用IFN-γ治療各種變態反應，例如哮喘和HIV感染的相關疾病，例如機會性感染，如卡氏肺囊蟲性肺炎和創傷性敗血症。已發現，多發性硬化症患者的IFN-γ產生受損，而且，據報導，在促分裂原刺激的AIDS患者單核細胞懸浮液中，IFN-γ產生受到嚴重抑制。有關論述可參見例如第16章「幹擾素在疾病中可能具有的致病作用」，Interferonsand Regulation Cytokines,Edward de Maeyer(1988,John Wilet and SonsPublishers)。
目前認為，IFN-γ，以及其它細胞因子，是可誘導氧化氮(iNOS)的誘導物，因此被描述成造成心力衰竭的潛在致炎機制、心臟對敗血症或移植排斥的應答、以及各種病因的擴張性心肌病發展的重要介導物。Ungureanu-Longrois等，Circ.Res.77,494-502(1995)；Pinsky等，J.Clin.Invest.95,677-685(1995)；Singh等，J.Biol.Chem.270,28471-8(1995)；Birks和Yacoub,Coronary Arterry Disease 8,389-402,(1997)；Hattori等，J.Mol.Cell.Cardiol.29,1585-92(1997)。實際上，據報導，就肌細胞iNOS誘導而言，IFN-γ是最有效的細胞因子(Watkins等，J.Mol. CellCardiol 27,2015-29(1995))。心臟肥大肥大一般指某器官或結構非正常發育的增大，但與腫瘤形成無關。器官或組織肥大或者由單個細胞體積增大引起(真性肥大)，或者由構成組織的細胞數量增多引起(增生)，或者以上兩者綜合所致。
心臟肥大指機械和激素刺激引起的心臟增大，以使心臟適應增加的心輸出或損傷。Morgan和Baker,Circulation 83,13-52(1991)。這種應答通常伴隨著許多不同的病理情況，例如高血壓、主動脈狹窄、心肌梗塞、心肌病、瓣膜返流、心臟分流、充血性心力衰竭，等。
在細胞水平上，心臟以合胞體的形式工作，所述合胞體由肌細胞和稱為非肌細胞的周圍支持細胞構成。肌細胞主要為成纖維細胞/間葉細胞，但也包括內皮細胞和平滑肌細胞。實際上，雖然成人心肌主要由肌細胞構成，但它們只佔心臟總細胞數的約30％。
胎兒心臟的增大主要是因為肌細胞數量的增多，這一過程持續到出生後不久，到心肌細胞失去增殖能力的時候。以後的發展則是單個細胞的增大。成人心室肌細胞肥大是對多種慢性血流動力超負荷的情況的應答。因此，在對激素、生理、血流動力和病理刺激的應答中，成人心室肌細胞能通過激活肥大程序而發生改變以適應增加的工作負荷。這一應答的特徵是肌細胞的增大和單個心肌細胞內可收縮蛋白含量的增多，但不伴隨細胞分化和胚胎基因(包括心房促尿鈉排洩肽(ANP)的基因)的激活。Chien等，FASEB J.5,3037-3046,(1991)；Chien等，Annu.Rev.Phvsiol.55,77-95(1993)。已有記載，在壓力過高引起的人左心室肥大中，肌細胞增大引起心肌組織增大，而肌細胞增大則與間質膠原在胞外基質內和心肌內冠狀動脈周圍的積累有關(Caspari等，Cardiovasc.Res.11,554-8(1977)；Schwarz等，Am.J.Cardiol.42,895-903(1978)；Hess等，Circulation 63,360-371(1981)；Pearlman等，Lab Invest 46,158-164(1982))。大多數心臟病結果都會造成慢性血流動力超負荷所致的心臟肥大，這也是心力衰竭的共同特徵。
已有人提出，非肌細胞的支持細胞產生的旁泌因子可能也參與心臟肥大的發展，並且，已經鑑定了許多非肌細胞產生的肥大因子，例如白細胞抑制因子(LIF)和內皮素。Metcalf,Growth Factors 7,169-173(1992)；Kurzrock等，EndocrineReviews 12,208-217(1991)；Inoue等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996年11月12日出版)。已鑑定的其它因子例如心臟肥大潛在介導物，這包括心臟營養因子-1(cardiotrophin-1,CT-1)(Pennica等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,1142-46(1995))、兒茶酚胺、腎上腺皮質類固醇、血管緊張素和前列腺素。
作為對心臟功能損傷的短期應答，減少單個肌纖維的負荷，成人肌細胞肥大最初是有益的。然而，由於嚴重的長期超負荷，肥大細胞開始退化和死亡。Katz,「心力衰竭」，Kate A.M.編的Physiology of Heart(New York,Raven Press,1992)pp.638-668。在臨床心力衰竭過程中，心臟肥大是突出的致命和致病因子。Katz,Trends Cardiovasc Med.5,37-44(1995)。
有關心臟肥大原因和病理的更多細節，參見，例如，Heart Disease,A Textbookof Cardiovascular Medicine,Braunwald,E.編，W.B.Saunders Co.,1988，第4章，心力衰竭的病理學。心臟肥大的治療目前，心臟肥大的治療方法根據所患心臟病而不同。兒茶酚胺、腎上腺皮質類固醇、血管緊張素、前列腺素、白血病抑制因子(LIF)、內皮素(包括內皮素-1、-2、-3和大內皮素)、心臟營養因子-1(CT-1)和心臟肥大因子(CHF)，這些因子都被認為屬於心臟肥大強介導物。例如，β-腎上腺素能受體抑制藥(β-抑制劑，例如普奈洛爾、噻嗎洛爾、特他洛爾、卡替洛爾、納多洛爾、倍他洛爾、噴布洛爾、acetoburolol、阿替洛爾、美託洛爾、卡維地洛，等)和維拉帕米已被廣泛用於治療肥厚性心肌病。β-抑制劑對症狀(例如胸痛)和運動耐量的改善主要是因為減慢了心率，因而延長了舒張期，增加了心室的被動輸入。Thompson等，Br.Heart J.44,488-98(1980)；Harrison等，Circulation 29,84-89(1964)。維拉帕米據說能增加心室輸入和可能減少心肌局部缺血。Bonow等，Circulation 27,853-64(1985)。有時也用硝苯地平和地爾硫治療肥厚性心肌病。Lorell等，Circulation 65,499-507(1982)；Betocchi等，Am.J.Cardiol.78,451-7(1996)。然而，因為具有強血管擴張特性，硝苯地平可能有害，尤其是在輸出受阻的患者中。曾利用丙吡胺的負性肌力作用來緩解症狀。Pollick,N.Eng.J.Med.307,997-9(1982)。然而，在許多患者中，最初的作用會隨時間減退。Wigle等，Circulation 92,1680-92(1995)。
據報導，用抗高血壓藥治療對高血壓相關性心臟肥大也有效。例如，單用或聯合用於抗高血壓療法的藥物有鈣拮抗劑，例如尼群地平；前文所述的β-腎上腺素能受體抑制藥；血管緊張素轉化酶(AIE)抑制劑，例如喹那普利、卡託普利、依那普利、雷米普利、benazepril、福辛普利、賴諾普利；利尿劑，例如氯噻嗪、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲基氯噻嗪、苄噻嗪、雙氯非那胺、乙醯唑胺、吲噠帕胺；鈣通道抑制劑，例如地爾硫、硝苯地平、維拉帕米、尼卡地平。例如，用地爾硫和卡託普利治療高血壓表現出左室心肌減小，但是舒張期作用的Doppler指數未歸一。Szlachcic等，Am.J.Cardiol.63,198-201(1989)；Shahi等，Lancet 336.458-61(1990)。以上發現被解釋成是提示過量間質膠原可能在左心室肥大緩解後留存。Rossi等，Am.Heart J.124.700-709(1992)。Rossi等(同上)在實驗大鼠中研究了卡託普利預防和逆轉細胞肥大的作用，對高壓力負荷性心臟肥大間質纖維化的作用。
因為沒有通用的治療心臟肥大的方法，鑑定能夠預防或減輕心肌細胞肥大的因子在發展新的治療方法以抑制病理性心臟生長中尤其重要。
分明概述我們意外發現，IFN-γ抑制大鼠分離細胞受前列腺素F2α(PGF2α)和苯福林誘導的心肌細胞膨大。我們還發現，IFN-γ在活體大鼠模型體內抑制PGF2α拮抗性類似物氟前列醇誘導的肥大和壓力負荷誘導的肥大。
所以，本發明涉及通過給予治療有效量IFN-γ治療各種潛在病因所致的心臟肥大。如果治療的是人患者，以重組人IFN-γ(rh IFN-γ)為佳，最好是rh IFN-γ-1b，見後文。本文中的治療採用其最廣義的概念，具體包括預防、緩解、減輕和治癒各階段的心臟肥大。
最好給予經保存具有長期穩定性的液體藥劑形式的IFN-γ。保存液體藥劑可含多次劑量的IFN-γ，並因此可以重複使用。
IFN-γ可與一種或多種其它治療心臟肥大或促進心臟肥大發展的病理狀態(例如高血壓，大動脈狹窄或心肌梗塞)的藥物聯用。
本發明還包括製造用於治療心臟肥大的藥物組合物的方法，所述組合物中含IFN-γ作為有效成分。
本發明還涉及一種藥物產品，它包括(a)含至少一份治療有效量IFN-γ的藥物組合物；(b)含所述藥物組合物的容器；和(c)容器所帶的標籤或所述藥物產品內的包裝說明書，說明所述IFN-γ在治療心臟肥大中的應用。
附圖簡述在附圖和實施例中，「IFN」或「IFN-γ」指重組鼠IFN-γ(Genentech,Inc.,SouthSan Francisco,CA或Genzyme,Cambridge,MA)。


圖1IFN-γ對前列腺素F2α(PGF2α)誘導的膨大的抑制。分離當日，肌細胞與鹽水載體或IFN-γ(500U/ml)預培養。分離後24小時，第二次加載體或IFN-γ，同時加載體或PGF2α(10-7M)。繼續培養72小時後，用戊二醛固定細胞，用黃色伊紅染色，用螢光顯微鏡觀察。A、B、C分別是以對照、PGF2α和PGF2α+IFN-γ培養4天後的心肌細胞。顯示杆狀心肌細胞最大寬度和呼吸頻率百分比的直方圖。杆狀細胞的最大寬度是用螢光顯微鏡和圖象分析軟體確定的。每組至少檢查同一實驗的200個杆狀細胞。IFN-γ單用對細胞形態沒有觀察得到的影響。所有組間比較的P＜0.001。
圖2IFN-γ(500-25U/ml)對PGF2α誘導的反應的劑量反應性抑制。分離當日，肌細胞與鹽水載體或IFN-γ預培養。分離後24小時，第二次加載體或IFN-γ，同時加載體或PGF2α(10-7M)。繼續培養72小時後，用戊二醛固定細胞，用黃色伊紅染色，用螢光顯微鏡觀察。細胞形態定量A對照，B PGF2α,C PGF2α+IFN-γ(25U/ml),D PGF2α+IFN-γ(100U/ml),E PGF2α+IFN-γ(500U/ml)。顯示杆狀心肌細胞最大寬度和呼吸頻率百分比的直方圖。杆狀細胞的最大寬度是用螢光顯微鏡和圖象分析軟體確定的。每組至少檢查同一實驗的200個杆狀細胞。IFN-γ單用對細胞形態沒有觀察得到的影響。所有組間比較的P＜0.001。
圖3IFN-γ對苯福林(PE)誘導的膨脹的抑制。分離當日，肌細胞與鹽水載體或IFN-γ(500U/ml)預培養。分離後24小時，第二次加載體或IFN-γ，同時加載體或PE(10-5M)。繼續培養72小時後，用戊二醛固定細胞，用黃色伊紅染色，用螢光顯微鏡觀察。A、B、C分別是以對照、PE和PE+IFN-γ培養4天後的心肌細胞。顯示杆狀心肌細胞最大寬度和呼吸頻率百分比的直方圖。杆狀細胞的最大寬度是用螢光顯微鏡和圖象分析軟體確定的。每組至少檢查同一實驗的200個杆狀細胞。IFN-γ單用對細胞形態沒有觀察得到的影響。所有組間比較P＜0.001。
圖4大鼠體內，IFN-γ對氟前列醇誘導的心臟肥大的作用。所示數據是平均值±SEM。括弧內是每組的動物數。與載體組相比，*P＜0.05,*P＜0.01。與Flup組相比，#P＜0.05,＃＃P＜0.01。Flup氟前列醇；IFN=IFN-γ；HW心臟重量；BW體重；VW心室重量；LVW左心室重量。
圖5Flup和/或IFN對MAP和HR的作用。所示數據是平均值±SEM。括弧內是每組的動物數。與載體組相比，*P＜0.05。與Flup組相比，#P＜0.05。與Flup+IFN組相比，+P＜0.05。Flup氟前列醇；IFN=IFN-γ；MAP平均動脈壓；HR心率。
圖6顯示氟前列醇(FLUP)和IFN-γ對以下物質表達的作用的直方圖A骨骼肌動蛋白(SKA)；B肌質網鈣ATPase(SRCA)；C膠原I(COLI)；D心房利鈉因子(ANF)。將表達水平相對戊二醛-3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)信使歸一。VEH是載體。每組有7隻動物，數據表示為平均值±SEM。對VEH組的P＜0.05。
圖7高壓力負荷大鼠體內，IFN-γ對心臟重量、心室重量和左心室重量的作用。數據表示為平均值±SEM。括弧內是每組的動物數。與假處理組相比，**P＜0.01。與結紮+載體組相比，##P＜0.01。結紮組大動脈被結紮的大鼠；IFNIFN-γ；WH心臟重量；VW心室重量；LVW左心室重量。
圖8高壓力負荷大鼠體內，IFN-γ對心臟重量、心室重量和左心室重量與體重之比的作用。數據表示為平均值±SEM。括弧內是每組的動物數。與假處理組相比，**P＜0.01。與結紮+載體組相比，##P＜0.01。結紮組大動脈被結紮的大鼠；IFNIFN-γ；WH心臟重量；VW心室重量；LVW左心室重量。
圖9壓力負荷大鼠體內，IFN-γ對動脈收縮壓、平均動脈壓和動脈舒張壓的作用。括弧內是每組的動物數。與假處理組相比，**P＜0.01。結紮組大動脈被結紮的大鼠；IFNIFN-γ；MAP平均動脈壓；DAP動脈舒張壓。
本發明的詳細描述A．定義「γ幹擾素」、「幹擾素γ」或「IFN-γ」指在任意心臟肥大試驗(例如本文所述的肥大試驗)中表現出生物活性的γ幹擾素(人的和其它動物的)的所有形式，這包括但不限於天然、化學合成或重組DNA技術產生的成熟、前、變和/或去(1-3)(又稱去CysTyrCys IFN-γ)形式。對製備重組人IFN-γ(rhu IFN-γ的全面描述(包括其cDNA和胺基酸序列)參見，例如，美國專利4,727,138,4,762,791,4,925,554,5,582,824,5,096,705,4,855,238,5,574,137和5,595,888。有關無CysTyrCys重組人IFN-γ，包括差異截斷衍生物，參見歐洲專利公布146,354。非人動物幹擾素，包括IFN-γ，參見歐洲專利公布88,622。這包括天然(野生型)幹擾素的差異糖基化形式和其它變異體(例如胺基酸序列變異體)及衍生物，這些或者已知，或者將會得到。所述變異體例如等位基因，產生殘基缺失、插入和/或被取代的定點誘變產物(參見，例如歐洲專利公布146,354)。已知IFN-γ的宿主範圍很窄，所以，必須使用與被處理動物同源的IFN-γ。治療人時，最好使用美國專利4,717,138及其同族EP77,670所示序列的去CysTyrCys變異體，而且或選的是翻譯後最後四個殘基缺失的C末端變異體。對人的治療而言，本發明的IFN-γ最好是重組人IFN-γ(rhuIFN-γ)，有或沒有N末端的胺基酸CysTyrCys。更好的是，IFN-γ是作為市售製劑Actimmune(Genentech,Inc.,South San Francisco,Califonia)中有效成分的重組人IFN-γ(重組人幹擾素γ-1b、rhu IFN-γ-1b，含140個胺基酸)。因為已知IFN-γ具有高度的種屬特異性，所以在動物實驗或對獸用來說，最好使用被處理動物的同種IFN-γ。因此，在採用大鼠動物模型的體內實驗中，使用的是鼠(小鼠)重組IFN- γ(Genentech,Inc.)。大鼠與小鼠的相關性足夠密切，可以將小鼠IFN-γ用於大鼠模型。
從藥理學上說，在本發明中，「治療有效量」的IFN-γ指在治療肥大，尤其是心臟肥大中有效果的量。
「肥大」在此指不依賴於自然發育且與腫瘤形成無關的器官或結構的增大。器官或組織的肥大可能是因為單個細胞的增大(真性肥大)，也可能是因為構成該組織或器官的細胞數量的增多(增生)，或兩者綜合所致。某些器官，例如心臟，出生後不久就失去了分裂的能力。所以，「心臟肥大」是心臟體積的增大，在成人中，表現為肌細胞增大和收縮蛋白含量增多，但不伴隨細胞分裂。可誘發肥大的應激(例如前負荷增加，後負荷增加，象心肌梗塞中那樣的肌細胞減少，或收縮抑制)的特徵似乎對反應的特徵具有重要作用。心臟肥大的早期通常表現為形態上肌原纖維和線粒體的增大，以及線粒體和細胞核的增大。此時，雖然肌細胞比正常的大，細胞組織基本保留。在心臟肥大的進一步階段，特定細胞器，例如線粒體增大或增多，而且，新的收縮元素以無規律的方式增加到局部區域。長期肥大的細胞表現出更明顯的細胞組織異常，包括明顯的核增大和膜的高度分葉，這取代了附近的肌原纖維，造成正常Z帶記錄的破壞。「心臟肥大」包括以心肌不同程度結構損傷為特徵的病情發展的各階段，與所患心臟病無關。
「心力衰竭」指一種心臟功能異常，即心臟泵送血液的速度達不到組織代謝的要求。心力衰竭可能由許多原因造成，包括缺血、充血、風溼或原發性的。
「充血性心力衰竭」是一種進行性病理狀態，心臟越來越無法提供足夠的心輸出(即單位時間內心臟泵送的血液量)為周圍組織提供含氧血。隨著充血性心力衰竭的發展，出現結構和血流動力學損傷。雖然這些損傷的表現形式不同，特徵性症狀之一是心室肥大。許多不同的心臟病最後都會造成充血性心力衰竭。
「心臟肥大」的原因通常是冠狀動脈粥樣硬化，常伴有冠狀動脈血栓形成。可將其分為兩個重要類型透壁梗死，即心肌壞死涉及心室的整個厚度；心內膜下梗死(非透壁梗死)，即壞死只涉及心內膜下膜或心室內心肌或以上兩者，但沒有穿過整個心室壁達到心外膜。已知，心肌梗塞既引起血流動力學改變又造成心臟受損和健康區域的結構改變。因此，心肌梗塞減少最大心輸出和心臟射血量。與心肌梗塞相關的還有發生在間質內的DNA合成刺激，以及心臟未受影響部位膠原形成增加。
在例如總外周阻力增加引起的長期高血壓中，作為應激或緊張度增加的結果，一直將心臟肥大與高血壓相關聯。長期壓力過高所致心室肥大的特徵之一是舒張功能不全。Fouad等，J.Am.Coll.Cardiol.4,1500-6(1984)；Smith等，J.Am.Coll.Cardiol.5,869-74(1985)。在早期原發性高血壓中已經檢測到了左心室舒張延長，但收縮功能正常或超常。Hartford等，Hypertension 6,329-338(1984)。然而，血壓水平和心臟肥大之間缺乏密切的平行關係。雖然，有報導稱，對人的抗高血壓治療可改善左心室功能，但已發現，分別用利尿劑(氫氯噻嗪)、β抑制劑(普萘洛爾)或鈣通道抑制劑(地爾硫)治療的患者左心室縮小，舒張功能卻無改善。Inouye等，Am.J.Cardiol.53,1583-7(1984)。
與心臟肥大相關的另一種複雜的心臟病是「肥厚性心肌病」。該病的特徵是形態、功能和臨床症狀具有極大的多樣性(Maron等，780-9(1987)；Spirito等，N.Eng.J.Med.320.749-55(1989)；Louie和Edwards,Prog.Cardiovasc.Dis.36,275-308(1994)；Wigle等，Circulation 92,1680-92(1995))，它可發生於各種年齡的患者，這更增加了它的多樣性(Sprito等，N.Eng.J.Med.336,775-785(1997))。肥厚性心肌病的病因也很多，而且知道的很少。最近的信息表明，β肌球蛋白重鏈突變可能是30-40％家族性肥厚性心肌病的病因(Watkins等，N.Eng.J.Med.326,1108-14(1992)；Schwartz等，Circulation 91,532-40(1995)；Marian和Roberts,Circulation 92,1336-47(1995)；Thierfelder等，Cell 77,701-12(1994)；Watkins等，Nat.Gen.11,434-7(1995))。
瓣膜上方的「主動脈狹窄」是一種遺傳性血管病，特徵為上行主動脈狹窄，但其它動脈，包括肺動脈，也可能受到影響。主動脈狹窄如果不治療會造成心內壓力升高，導致心肌肥大，最後造成心力衰竭和死亡。對該病的病因還未完全掌握，但內層平滑肌肥大和可能的增生是該病的突出特徵。據報導，彈性蛋白的變異分子與主動脈狹窄的發展和病因有關。(1997年7月22日的美國專利5,650,282)。
「瓣膜返流」是造成心瓣膜異常的心臟病所致。多種疾病，例如風溼性高燒，會造成瓣膜口收縮或拉開，其它則可能造成心內膜炎，即心內膜或房室口內膜發炎，並需要心臟手術。瓣膜狹窄之類缺陷或瓣膜閉合不全造成血液在心腔內積聚或者通過瓣膜返流。如果不加以矯正，長期的瓣膜狹窄或功能不全會造成心臟肥大相關的心肌損傷，最後可能需要替換瓣膜。
本發明的主題就是處理所有這些及其它伴有心臟肥大的心臟病。
「治療」包括以避免或減緩(緩解)肥大為目的的治療和預防。需要治療的包括已經患病的，易於患病的，或者需要避免該病的。肥大可以是多種原因的，包括自發的、心臟病的、缺血性的或缺血性發作，例如心肌梗塞。
「慢性」給藥指與急性方式相對的連續給予藥物，從而在更長的時間內保持最初的抗肥大作用。
「哺乳動物」，就治療目的而言，指歸為哺乳動物的任意動物，包括人、圈養或放養的動物、以及觀賞、運動或寵物類動物，例如狗、貓、牛、馬、羊、豬，等。最好是人。
與一種或多種其它藥物「聯用」包括同時給藥和任意次序的先後給藥。B．最佳實施方式1．心臟肥大試驗體外試驗a．成年大鼠心肌細胞膨大誘導該試驗中，分離出一個大鼠(雄性，Sprague-Dawley)的心室肌細胞，基本上按照Piper等「成年大鼠心室肌細胞」Cell Culture Techniques in Heart and VesselResearch,H.M.Piper編，Berlin:Springer-Verlag,1990,pp.36-60所述方法的修改形式。給方法能夠分離出成年心室肌細胞並長期培養杆狀表型的這些細胞。已知苯福林和前列腺素F2α(PGF2α)能在這些細胞中誘導膨大反應。Piper等，同上；Lai等，Am.J.Physiol.1996；217(Heart Circ,Physiol.40):H2197-2208。然後測定心臟肥大的不同潛在抑制劑對PGF2α或PGF2α類似物(例如氟前列醇)和苯福林誘導的肌細胞膨大的抑制。
體內試驗a．體內對氟前列醇誘導心臟肥大的抑制該藥學模型測試IFN-γ在大鼠(例如雄型，Wistar或Sprague-Dawley)體內抑制皮下注射氟前列醇(PGF2α類似物之一)誘導的心臟肥大的能力。已知，患心肌梗塞誘導的病理性心臟肥大的大鼠其心肌內已逐漸積聚了高水平的可抽提PGF2α。Lai等，Am.J.Physiol.(Heart Circ.Physiol.)271,H2197-H2208(1996)。所以，能夠在體內抑制氟前列醇對心肌生長作用的因素可能可用於治療心臟肥大。IFN-γ對心臟肥大的作用通過測定心臟、心室和左心室(相對體重歸一)的重量並與不接受IFN-γ的大鼠進行比較來確定。實施例中提供了該試驗的詳細描述。
b．壓力-超負荷心臟肥大試驗對體內測試而言，一般通過測試動物腹主動脈收縮來誘導壓力-超負荷心臟肥大。在一典型方案中，大鼠(雄型，Wistar或Sprague-Dawley)接受麻醉，將橫膈下的腹主動脈縫窄。Benznak M.,Can.J.Biochem.Physiol.33,985-94(1955)。手術切開主動脈，將鈍針放在血管旁邊。用羊毛結紮線纏繞鈍針，然後立即去除鈍針，於是主動脈腔被收窄為針的直徑。該方法參見Rossi等，Am.Heart J.124,700-709(1992)和O′Rourke和Reibel,P.S.E.M.B.,200,95-100(1992)。本發明所用方法的詳細描述參見後文實施例。
b．實驗誘導心肌梗塞(MI)對心臟肥大的影響在大鼠體內通過左冠狀動脈結紮誘導急性MI，並用心電圖檢查進行確認。同時準備一假處理組動物作為對照。早期數據顯示心臟肥大存在於MI動物組，表現為心臟重量與體重之比升高18％。Lai等，同上。用心臟肥大候選抑制劑，例如IFN-γ，處理這些動物，提供了有價值的關於測試候選抑制劑療效的信息。
2．IFN-γ的用途、治療組合物和給藥根據本發明，IFN-γ可用來治療心臟肥大，即各種病因和病理的心臟增大。當心臟(心室)承受過高的壓力或容量負荷時，心臟(心肌)肥大就會發生，作為一種基本補償機制，使得心室能夠承受它的負荷。Krayenbuehl等，Eur.Heart J.4(增刊A),29(1983)。誘發肥大的應激(例如前負荷增加，後負荷增加，象心肌梗塞中那樣的肌細胞減少，或收縮性主抑制)的特徵對肥大反應的特徵具有重要作用。Scheuer和Buttrick,Circulation 75(增刊1)，63(1987)。本發明涉及與任意病理狀況相關的心臟肥大的治療，所述狀況包括但不限於心肌梗塞後，高血壓，主動脈狹窄，心肌病，瓣膜返流，心臟分流術和充血性心力衰竭。前文已論述過這些狀況的主要特徵。
特別重要的是在心肌梗塞後用IFN-γ預防心力衰竭。在美國，每年約750,000人患急性心肌梗塞(AMI)，約四分之一因AMI而死亡。最近幾年，溶血栓劑，例如鏈激酶、尿激酶，尤其是組織血纖蛋白溶酶原(t-PA)大大提高了心肌梗塞患者的存活率。連續靜脈輸注1.5至4小時，在69-90％受治患者中，t-PA在第90分鐘造成冠狀動脈開通。Topol等，Am.J.Cardiol.61,723-8(1988)；Neuhaus等,J.Am.Coll.Cardiol.12,581-7(1988)；Neuhaus等，J.Am.Coll.Cardiol.14,1566-9(1989)。據報導，採用高劑量或加快給藥可達到最快開通速度(rate)。Topol等，Am.J.Cardiol.15,922-4(1990)。t-PA也可以作為藥丸給予，但因為其半衰期較短，所以更適合採用輸注療法。Tebbe等，Am.J.Cardiol.64,448-53(1989)。特別適合藥丸給藥的一種具有更長的半衰期和很高的血纖維蛋白特異性t-PA變異體，TNK t-PA(T103N,N117Q,KHRR(296-299)AAAA t-PA變異體，Keyt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91,3670-3674(1994))。然而，儘管已取得以上進展，存活患者的長期預後主要取決於梗塞後的監護和對患者的治療，這應當包括對心臟肥大的監測和治療。
另一重要的治療內容是治療與高血壓相關的心臟肥大。如前所述，已知長期的高血壓會導致心臟肥大。雖然已知有些高血壓藥能夠減小左心室，但治療並不一定改善舒張功能。所以，IFN-γ可聯合β腎上腺素能受體抑制劑，例如普奈洛爾、噻嗎洛爾、特他洛爾、卡替洛爾、納多洛爾、倍他洛爾、噴布洛爾、acetoburolol、阿替洛爾、美託洛爾、卡維地洛；血管緊張素轉化酶(AIE)抑制劑，例如喹那普利、卡託普利、依那普利、雷米普利、benazepril、福辛普利、賴諾普利；利尿劑，例如氯噻嗪、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲基氯噻嗪、苄噻嗪、雙氯非那胺、乙醯唑胺、吲噠帕胺；鈣通道抑制劑，例如地爾硫、硝苯地平、維拉帕米、尼卡地平。包含以上通用名所示療效藥的藥物組合物可以購買得到，並可按照生產商有關劑量、劑型、副作用、禁用症等的說明給藥(參見，Physician′s Desk Reference,MedicalEconomics Data Production Co.Montvale N.J.，第51版，1997)。
IFN-γ可以預防性地給予心臟肥大患者，用於阻止病情的發展和避免猝死，包括無症狀性猝死。這樣的預防性治療對於診斷為巨大性左心室肥大(成人的最大壁厚達35mm或以上，或者兒童的相當壁厚)的患者，或者心臟的血流動力學負擔特別重時，尤其必要。
IFN-γ還可以用於治療大多數確診為肥厚性心肌病的患者都會發生的心房纖顫。
IFN-γ以藥物組合物的形式給予，其中包含IFN-γ作為有效成分，還包括藥學上認可的載體。用於治療心臟肥大的治療性IFN-γ製劑如下製備以便保存；將純度達到要求的IFN-γ與或選性的藥學上認可的載體、賦形劑或穩定劑(Remington′sPharmaceutical Science，同上)混合，製備成凍幹塊或水溶液形式。認可的載體、賦形劑和穩定劑在使用劑量和濃度對受主無毒，包括緩衝液，例如磷酸、檸檬酸和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於10個殘基)的肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、門冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；自動生成反離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如Tween,Pluronic或聚乙二醇(PEG)。
體內給藥的IFN-γ必須是無菌的。在冷凍乾燥和再生之前或之後經滅菌濾膜過濾即可做到這一點。一般以凍幹或溶液形式保存IFN-γ。
可使用凍幹形式的IFN-γ，並與其它成分混合以便用合適的溶劑在使用時再生。因為已知IFN-γ對酸不穩定，一般在中性或弱鹼性pH下進行處理。參見，例如，美國專利4,499,014，其中描述了凍幹酸性IFN-γ溶液到達pH6-9時的重新活化。中性或弱鹼性的高濃度IFN-γ溶液一般不適於作為輸注製劑，因為會迅速形成可見沉澱。這種沉澱會在給藥時造成栓塞或降低藥效。歐洲專利公布0196,203公開了凍幹IFN-γ在pH4-6.0的再生。
1992年9月29日的美國專利5,151,265公開的穩定液體藥物組合物含有效量的非凍幹IFN-γ，能維持pH4.0-6.0的緩衝液，穩定劑和非離子去汙劑。穩定劑一般是多元糖醇，例如甘露醇，非離子去汙劑可以是表面活性劑，例如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。非離子去汙劑的含量以約0.07-0.2mg/ml為宜，最好是0.1mg/ml。合適的緩衝液是有機酸及其鹽組成的常規緩衝液，例如檸檬酸鹽緩衝液(例如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物，等)，琥珀酸鹽緩衝液(例如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物，琥珀酸-氫氧化鈉混合物，琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物，等)，酒石酸鹽緩衝液(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物，酒石酸-酒石酸鉀混合物，酒石酸-氫氧化鈉混合物，等)，延胡索酸鹽緩衝液(例如，延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物，延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物，延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物，等)，葡糖酸鹽緩衝液(例如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物，葡糖酸-氫氧化鈉混合物，葡糖酸-葡糖酸鉀混合物，等)，草酸鹽緩衝液(例如，草酸-草酸鈉混合物，草酸-氫氧化鈉混合物，草酸-草酸鉀混合物，等)，乳酸鹽緩衝液(例如，乳酸-乳酸鈉混合物，乳酸-氫氧化鈉混合物，乳酸-乳酸鉀混合物，等)，和乙酸鹽混合物(例如，乙酸-乙酸鈉混合物，乙酸-氫氧化鈉混合物，等)。
一種已知的市售IFN-γ液體製劑(Actimmune rhu IFN-γ-1b,Genentech,Inc.)是一種無菌、澄清、無色、非儲備溶液，裝在單劑量小瓶中用於皮下注射。每0.5mlActimmune含100μg(3×106單位，比活性30×106單位/mg)IFN-γ-1b，以20mg甘露醇、0.36mg琥珀酸鈉、0.05mg聚山梨醇酯20和無菌注射水配製。
適合重複使用的，按照本發明使用的儲備藥物組合物，宜包含a)非冷凍乾燥的IFN-γ；b)能維持pH約4-6(即蛋白質在溶液中穩定性最高的pH範圍)的乙酸鹽緩衝液；c)非離子去汙劑，主要用於穩定蛋白質，抵抗攪拌造成的凝聚；d)等滲調節劑；e)防腐劑，選自苯酚、苯甲醇和滷化苄乙氧銨，例如氯化苄乙氧銨；和f)水。
非離子去汙劑(表面活性劑)可以是例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯(Tween)20或80)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。用非離子表面活性劑能使製劑不致因表面剪切力而造成蛋白質變性。此外，含此類表面活性劑的製劑可用於氣霧裝置，例如肺給藥時所用的，和無針注射槍(參見，EP257,956)。
含等滲調節劑是為了確保本發明液體組合物的等滲性，它們包括多元糖醇，例如三元或更多元的糖醇，例如甘油、赤蘚醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。這些糖醇可以單用也可聯用。或者，可用氯化鈉或其它合適的無機鹽來維持溶液的等滲性。
乙酸緩衝液可以是，例如，乙酸-乙酸鈉混合物，乙酸-氫氧化鈉混合物，等等。本發明液體製劑的pH在4.0-6.0之間，pH4.5-5.5更好，pH5則最好。
防腐劑，例如苯酚、苯甲醇和滷化苄乙氧銨，例如氯化苄乙氧銨是已知的抗微生物劑。
在一優選實施例中，給予的IFN-γ是液體藥物組合物的形式，其中含IFN-γ0.1-2.0mg/ml乙酸鈉(pH5.0) 5-100mMTween 20 0.1-0.01wt％苯酚 0.05-0.4wt％甘露醇5wt％注射水，USP 補足至100％其中，百分比含量的基礎是組合物的總重。苯酚可用0.5-1.0wt％苯甲醇代替，甘露醇可用0.9wt％氯化鈉代替。
最好，組合物含IFN-γ0.1-1.0mg/ml乙酸鈉(pH5.0) 10mMTween 20 0.01wt％苯酚 0.2wt％甘露醇5wt％苯酚可用0.75wt％苯甲醇代替，甘露醇可用0.9wt％氯化鈉代替。
儲備液製劑最好含多劑次治療有效量的IFN-γ。因為該多肽的宿主範圍很窄，治療人患者，宜使用含人IFN-γ的液體製劑，含天然序列人IFN-γ的更好。作為生物反應修飾劑，IFN-γ對人和非人哺乳動物的多種類型細胞具有多種活性。當然，治療有效量取決於多種因素，例如受治(包括預防)病理狀況、患者年齡、體重、總體健康狀況、醫療史，等，開業醫師能夠對此做出決定。有效劑量一般約0.001-1.0mg/kg，約0.01-1mg/kg更好，約0.01-0.1mg/kg最好。以A549細胞進行抗腦心肌炎病毒試驗時，在這樣的製劑中，hu IFN-γ較好地表現出高於或等於約2×107U/mg蛋白質的比活性。應該知道的是，必須將內毒素汙染維持在安全水平以下，例如低於0.5ng/mg蛋白。而且，若是給予人，液體製劑必須符合FDA和生物學標準提出的無菌、熱原、總體安全性和純度要求。
IFN-γ的給藥途徑採用已知方法，例如靜脈、腹膜內、腦內、肌內、眼內、動脈內或創傷內注射或輸液，或採用後文所述的緩釋系統。一般將療效性IFN-γ組合物裝在具有無菌接口的容器內，例如靜脈輸液袋或塞子可被皮下注射針穿通的管形瓶。製劑的給予最好是多次靜脈(i.V.)、皮下(s.c.)或肌內(i.m.)注射，或是適合鼻內或肺內(有關肺內給藥，參見EP257,956)給藥的氣霧劑。
穩定的IFN-γ水性組合物最好裝在管形瓶中，含多至約30劑治療有效量的IFN-γ。首此給藥後至少14天內，至少200天更好，IFN-γ的生物活性最好能保持首此給藥使所表現活性的約80％。
IFN-γ還可以緩釋劑的形式給予。緩釋劑的合適離子包括含蛋白質的固體疏水聚合物半透過性基質，該機制具有一定形狀，例如膜或微膠囊。緩釋基質的例子包括聚酯，水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯))(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15,167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12,98-105(1982))，或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919,EP58,481),L-穀氨酸和L-穀氨酸γ乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers 22:547-556(1983))，不可降解乙烯乙酸乙酯(Langer等，同上)，可降解乳酸-乙醇酸共聚物，例如Lupron DepotTM(乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide乙酸酯構成的可注射微球)，聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。
聚合物，例如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能長達100天地釋放分子，有些水凝膠則能持續較短時間地釋放蛋白質。當被包裹蛋白在體內滯留較長時間後，它們會因為處於37℃的潮溼環境中而變性或凝聚，造成生物活性損失，並可能改變免疫原性。可根據有關機制，設計合理的給藥方案以確保蛋白質的穩定。例如，如果發現凝聚機制是通過硫-二硫化物互變形成了二硫鍵，穩定化可通過修飾巰基殘基、冷凍乾燥酸性溶液、控制溼度、採用合適的添加劑和發明特殊聚合物基質組合物。
緩釋IFN-γ組合物還包括脂質體包裹的IFN-γ。含IFN-γ的脂質體可用已知方法製備DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利公告83-118008；美國專利4,485,045和4,544,545；和EP102,324。一般採用小型(約200-800埃)單片層型的脂質體，其中的脂質含量是30mol％以上的膽固醇，所選比例根據優化療法來調節。
用於治療的有效量IFN-γ取決於，例如，治療目的、給藥途徑和患者狀況。所以，為了獲得最佳的治療效果，醫生有必要確定劑量和修改給藥途徑。給予IFN-γ治療慢性肉芽腫患者時，體表面積0.5m2以上患者的推薦給予劑量是50mcg/m2(1.5×106U/m2)，體表面積小於或等於0.5m2患者的推薦給予劑量是1.5mcg/kg/劑，皮下注射，每周3次。這對於醫師確定心臟肥大最佳有效劑量來說具有指導意義。醫生將給予IFN-γ，直到獲得治療心臟功能失調效果所需的劑量。例如，如果目的是治療充血性心力衰竭，就應是能抑制與這種狀況相關的進行性心臟肥大的量。以上療法的進展過程可方便地通過超聲心動圖來監測。同理，在肥厚性心肌病患者中，可憑經驗，根據患者對療效的主觀感受來給予IFN-γ。
IFN-γ可聯合其它用於治療(包括治療)心臟肥大的療效藥一起給藥。例如，IFN-γ治療可與已知的心臟肌細胞肥大因子抑制劑(例如α-腎上腺素能活化劑的抑制劑，例如苯福林；內皮肽-1；CT-1；LIF；血管舒張肽轉化酶和血管舒張肽Ⅱ)聯合給藥。對聯合療法來說，特別好的是聯合心臟肥大因子抑制劑(CHF,cardiotrophin或cardiotrophin-1，參見美國專利5,679,545)。
心臟肥大聯合療法中的優選候選藥物是β腎上腺素能受體抑制劑(例如普奈洛爾、噻嗎洛爾、特他洛爾、卡替洛爾、納多洛爾、倍他洛爾、噴布洛爾、acetoburolol、阿替洛爾、美託洛爾、卡維地洛)，維拉帕米，difedipine，地爾硫。治療與高血壓相關的心臟肥大可能需要採用抗高血壓療法，採用鈣通道抑制劑，例如地爾硫、硝苯地平、維拉帕米、尼卡地平；β腎上腺素能阻斷劑；利尿劑，例如氯噻嗪、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲基氯噻嗪、苄噻嗪、雙氯非那胺、乙醯唑胺、吲噠帕胺；和/或ACE抑制劑，例如喹那普利、卡託普利、依那普利、雷米普利、benazepril、福辛普利、賴諾普利。
與IFN-γ聯合給予的療效藥物的有效量由醫生或獸醫確定。為了獲得最佳效果，可進行劑量的控制與調整，最好考慮到利尿劑或洋地黃的使用以及高血壓、低血壓、腎功能不全等因素。劑量還取決於諸如所用療效藥的類型和受治患者的具體狀況等因素。通常，所用劑量與不與IFN-γ聯用時的劑量相同。
實施例實施例1
IFN-γ對PGF2α誘導的成年肌細胞膨大的抑制材料與方法成年肌細胞培養物分離成年大鼠的心室肌細胞使用的是改進型Piper等(同上)所述的方法，詳細描述可參見Lai等(同上)。為製備每一份肌細胞製劑，用戊巴比妥鈉麻醉體重約250g的雄性Sprague-Dawley大鼠，取出心臟。剔除外圍組織，將它固定到溫度控制在37℃的Langendorff系統上。用40ml Krebs緩衝液(110mM NaCl,2.6mMKCl,1.2mM MgSO4·7H2O,25mM NaHCO3和11mM葡萄糖)灌注心臟。然後用含30mg膠原酶和12.5μl 100mM CaCl2的Krebs緩衝液在心臟內循環30分鐘。從Langendorff儀上取下心臟，去除心房和結締組織。用解剖剪將心室切割成2mm的小塊，然後用新鮮的膠原酶溶液(30mg膠原酶和400mg BSA溶於含12.5μl100mM CaCl2的Krebs緩衝液)在37℃消化5分鐘。消化期間，每分鐘溫和地手工振蕩組織懸浮液。消化後，分離並保留上清液，留下的組織以新鮮膠原酶溶液再消化5分鐘。
將分離出的成年大鼠肌細胞鋪在塗有海帶氨酸的平板上，密度為3×103細胞/ml。適當刺激72小時後，用甘油醛固定細胞，用黃色曙紅染色。在螢光顯微鏡下查找杆狀細胞，以圖象分析軟體(Simple 32,Compix Imaging,Mars,PA)測定最大寬度。
結果IFN-γ抑制肥大因子PGF2α和苯福林誘導的成年心肌細胞膨大已知，PGF2α和α腎上腺素能活化劑苯福林誘導培養的成年大鼠新生肌細胞的膨大(Adams等，J.Biol.Chem.271:1179-1186(1996)；Lai等，Am.J.Physiol.(HeartCirc.Phvsiol)271:H2197-2208(1996)；Meidell等，Am.J.Physiol.251:H1076-H1084(1986)；Simpson,J.Clin.Invest.72:732-738(1983)；Simpson,Circ.Res.56:884-894(1985))。培養中的成年大鼠心室肌細胞與以上因素接觸時膨大(Lai等，同上；Piper等，「成年大鼠心室肌細胞」，Cell Culture Techniques in Heart and VesselResearch,H.M.Piper編，1990,Springer-Verlag:Berlin,p.36-60)。成年肌細胞呈杆狀。當這些細胞處於0.1μM PGF2α中時，杆狀細胞展平膨大(圖1)。量化膨大反應測定至少200個杆狀細胞的最大細胞寬度，將該值相對其在細胞群中的出現頻率做圖。PGF2α明顯改變最大細胞寬度，表現為，該值在細胞群內的分布與對照細胞相比發生漂移(p＜0.001)。用IFN-γ處理細胞明顯抑制它們對PGF2α的應答(PGF2α+=IFN-γ與PGF2α相比，p＜0.001)。在一定濃度範圍內，IFN-γ對PGF2α誘導的肌細胞膨大的抑制作用具有劑量依賴性，這符合心肌細胞和其它細胞系統內對IFN-γ的生物反應(Singh等，Biol.Chem.271:1111-1117(1996)；Pinsky等，J.Clin.Invest.95:766-685(1995)；Ungureanu-Longrois等，Circ.Res.77:494-502(1995)；Soderberg-Naucler等，J.Clin.Invest.100:3154-3163(1997)；Gou等，J.Clin.Invest.100:829-838(1997)；Marra等，Can.J.Cardiol.12:1259-1267(1996))。抑制PGF2α誘導的肌細胞膨大的能力似乎為IFN-γ所特有，因為包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-α和IFN-β在內的其它細胞因子都不抑制膨大反應。IFN-γ的抑制效果並不僅限於對PGF2α。IFN-γ也抑制苯福林誘導的膨大(圖3)。
實施例2體內抑制心臟肥大材料與方法動物整個試驗過程都符合美國生理學協會的規定，並得到Genentech研究動物看護和使用委員會的認可。試驗所用的是Sprague/Dawley(SD)大鼠(8周齡，CharlesRiver Breeding Laboratories,Inc.)。實驗前，動物在試驗室內適應至少1周，飼以丸狀鼠食，自由飲水，籠養於控光控溫的房間內。
給予氟前列醇和/或IFN-γ給大鼠皮下注射0.15mg/kg氟前列醇(Cayman Chemical,Ann Arbor,M),0.008mg/kg鼠IFN-γ(Genentech Inc.,South San Francisco,CA)，氟前列醇和鼠IFN-γ、或鹽水載體，每日2次，共14天。在IFN-γ組和氟前列醇+IFN-γ組中，動物預先進行1天的IFN-γ預處理。測定處理前後的體重。以前的研究顯示，此處所用的氟前列醇劑量是在大鼠體內造成顯著心臟肥大的最低劑量。Lai等，同上。一次小試顯示，上述劑量的IFN-γ抑制氟前列醇誘導的心臟肥大，而且對大鼠的體重幾乎沒有影響。
血流動力學評價處理後第13天，腹膜內注射氯胺酮80mg/kg(Aveco Co.Inc.,Fort Dodge,Iowa)和賽拉嗪10mg/kg(Rugby Laboratories,Inc.,Rockville Center,NY)麻醉大鼠。在腹主動脈內植入裝有肝素-鹽溶液(50U/ml)的導管(PE-10接PE-50)，通過股動脈，用於測定平均動脈壓(MAP)和心率(HR)。導管穿出固定於頸後。
插導管後1天，將動脈導管與CP10型壓力傳感器(Century TechnologyCompany,Inglewood,CA,USA)連接，傳感器與Grass 7型多種波動掃描器(GrassInstruments.Quincy,MA,USA)連接。同時測定清醒的、非克制小鼠的MAP和HR。
測定器官重量氯胺酮/賽拉嗪麻醉下，取出心臟、腎臟和脾臟，解剖，稱重。左心室保存於80℃，用於評價基因表達。
壓力超負荷動物模型通過部分結紮大鼠腹主動脈誘導壓力超負如現有技術所述。Kimura等，Am.J.Physiol.1989:256(Heart Circ.Phvsiol.25):H1006-H1011；Batra等，J.Cardiovasc.Pharmacol.17(增刊2)，S151-S153(1991)。簡而言之，如前所述用氯胺酮/賽拉嗪麻醉大鼠。在腹壁上造一3mm切口。露出隔膜與腎動脈之間的腹主動脈，用5-0號絲縫線結紮。將縫線繞一根23號針紮緊，然後抽出針。假處理組動物也接受手術，但不用縫線進行結紮。
壓力超負荷大鼠內的試驗方案主動脈被結紮的大鼠隨機地，術前1天，2次皮下注射0.08mg/kg IFN-γ，術後注射14天。假處理組動物不接受處理。處理後第13天，如前所述在隔膜下右頸動脈內植入一根導管。植入後1天，測定清醒大鼠的動脈壓和HR。取出心臟和肝臟、腎臟及脾臟等其它器官，稱重，用10％經緩衝的福馬林固定，以備病理學研究之用。迅速切取部分動物的左心室，用液氮冷凍，保存於-80℃，以備基因表達研究之用。
統計學分析將結果表示為平均值±SEM。進行單向方差分析(ANOVA)，測定參數的組間差異。然後用Newman-Keuls法對明顯差異進行post-hoc分析；p＜0.05被認為明顯。
RNA製備用RNeasy Maxi柱(Qiagen)，按照生產商的說明，分離總RNA。
RT-PCR用實時RT-PCR(TaqMan)技術比較不同處理組之間的基因表達差異。設計一寡核苷酸探針，3′端含螢光染料6-羧基四甲基-羅丹明(TAMRA)，用它與兩PCR引物界定的擴增子雜交。3′封端磷酸酯避免了探針的延長。在PCR反應的延長階段，報導染料因Taq聚合酶的5′外切活性從探針上釋放。不再進一步處理，就在反應試管中用測序儀監測產生的螢光，並定量，因此稱之為「實時」。閾值循環數(Ct)，即報導劑螢光超過基線標準偏差10倍以上的時候，與樣品產生的複製子量成正比。因為螢光是在擴增反應對數期測定的，所有反應組分都不成為限制。在各試驗中，分析一個沒有RNA模板的對照以監測汙染，並包括另一個省略了RT步驟的對照以消除可能成為信號源的汙染性DNA擴增。通過調節鎂離子和引物濃度優化反應，以做到螢光信號最強，Ct最小。產物在瓊脂糖凝膠上電泳，確認在預計分子量處只有一條帶。此外，在基因庫中篩選擴增子的序列，消除與密切相關基因重疊的可能性。
對每份樣品來說，如後文所述，用標準曲線測定每個靶基因的mRNA，並相對樣品內的甘油醛-3-磷酸酯-脫氫酶(GAPDH)含量進行歸一(有關具體計算，參見後文)。然後，可比較處理組之間各靶基因相對GAPDH的相對豐度。
RT-PCR每份反應取1ng總RNA，用TaqMan 7700型測序儀(ABI-Perkin Elmer)進行RT-PCR(Gibson等，Genome Res.6,995-1001(1996))。(50μl)擴增反應的條件為1X TaqMan緩衝液A,200μM dATP,dCTP,dGTP和400μM dUTP,10％甘油，6.5mM MgCl2,50U MuLV逆轉錄酶，20U Rnase抑制劑，1.25U AmpliTaq Gold,100nM正向引物和反向引物，100nM螢光探針。RT-PCR試劑和甘油分別購自Perkin Elmer和Sigma。在MicoAmp光學管和蓋子(ABI-Perkin Elmer)中進行反應。根據Perkin Elmer確定的方針設計TaqMan引物，在Genentech Inc.合成，鼠GAPDH的探針則是Perkin Elmer贈送的。逆轉錄在48℃進行30分鐘，然後在95℃進行10分鐘的AmpliTaq金的活化。熱循環為95℃30秒，60℃1.5分鐘，共40輪。
如Heid等，Genome Res.6:986-994(1996)所述，修改後進行TaqMan結果的定量。簡而言之，對各感興趣基因的標準曲線(1:5連續稀釋)測定2次。以Ct為Y軸，以總RNA濃度的Log值為X軸，確定描述該曲線的方程。根據相應的標準曲線，代入Ct(Y值)，求mRNA(X)，測定各靶基因的mRNA。然後，用以下方程將各靶基因的值相對GAPDH歸一10X1/10X2，其中，X1是靶基因，X2是GAPDH。
結果IFN-γ在體內抑制心臟肥大已知，長期給予PGF2α的活化劑類似物氟前列醇在體內誘導心臟肥大，而且，患心肌梗塞所致病理性心肌肥大的大鼠其心肌內可抽提PGF2α水平已被逐步提高(Lai等，同上)。因此，能在體內抑制PGF2α對心肌生長作用的因子也許可用於治療心肌肥大。給予或不給予IFN-γ的情況下給予氟前列醇，持續2周，測定對心臟肥大的影響。與載體對照相比，在氟前列醇處理的大鼠中，心臟、心室和左心室的絕對重量傾向於增加，但與氟前列醇處理的大鼠相比，用氟前列醇+IFN-γ處理的大鼠體內，以上重量明顯減小(表1)。氟前列醇處理造成心臟、心室和左心室重量與體重(BW)之比明顯增大，說明氟前列醇誘導心臟肥大(圖4)。IFN-γ抑制氟前列醇誘導的肥大。與氟前列醇組相比，接受氟前列醇+IFN-γ的大鼠其心臟、心室和左心室比BW的相對重量明顯減輕(圖4)。IFN-γ組與載體組的比較顯示，單用IFN-γ對心臟、心室或左心室的絕對重量或BW相對重量沒有明顯改變(表1，圖4)。
長期給予氟前列醇與平均動脈壓(MAP)相比載體處理組的顯著降低相關(圖5)。與載體相比，IFN-γ對MAP沒有作用，而且對氟前列醇處理動物的MAP也沒有影響。4個處理組的心率有明顯改變(圖5)。以上結果說明，IFN-γ並不通過抵消氟前列醇的血流動力學作用來抑制其誘導的心臟肥大。
IFN-γ不僅抑制與使用氟前列醇相關的心臟重大，而且改變與氟前列醇誘導的肥大相關的心內基因表達(圖6)。與載體相比，氟前列醇處理大鼠心臟內，α-骨骼肌動蛋白、膠原1和利鈉因子的mRNA豐度增加。這些大鼠中的肌質網鈣ATPase顯著減少。IFN-γ抑制除利鈉因子反應之外的全部反應。
還在一腹主動脈結紮造成壓力超負荷導致心臟肥大的鼠模型中進行了IFN-γ試驗。主動脈狹窄造成心臟肥大表現為心臟、心房、心室和左心室絕對重量以及與BW的相對重量的明顯增加。IFN-γ處理顯著減輕了該模型中的心臟肥大(表2，圖7和8)。
還檢查了IFN-γ對其它器官的作用(表2)。主動脈結紮和IFN-γ處理都不改變腎臟的重量及其與BW之比。與假手術動物相比，載體處理並結紮主動脈的大鼠的肝臟重量及其與BW之比傾向於減小，用IFN-γ處理的則不減小。主動脈結紮造成脾臟絕對重量和BW歸一化重量的顯著升高，IFN-γ處理更加劇這種升高。因此，IFN-γ對心臟肥大的作用並不是因為對器官重量的普遍作用。
主動脈結紮大鼠的平均動脈壓、心收縮壓和舒張壓明顯高於假手術對照，而且，IFN-γ處理與載體處理的結紮大鼠之間，動脈壓的增加沒有區別(圖9)。該結果說明，接受IFN-γ的結紮大鼠的心臟肥大緩解與後負荷改變無關。
主動脈結紮造成部分心內基因表達的改變。與假手術對照相比，結紮大鼠內，β-肌球蛋白重鏈、α-平滑肌肌動蛋白、α-骨骼肌動蛋白、心房利鈉因子、膠原1和Ⅲ和纖連蛋白的mRNA相對豐度都上升。3個基因中的2個α-平滑肌肌動蛋白和膠原1被IFN-γ抑制(表3)。
綜上所述，實施例1和2的結果顯示，IFN-γ能夠抑制心臟肥大。IFN-γ的作用不僅僅在於抑制肥大刺激誘導的心臟增大，它還在基因表達水平抑制肥大心臟中發生的某些分子改變。特別值得指出的是，在對氟前列醇長期刺激的反應中，和在壓力超負荷誘導的肥大模型中，IFN-γ都體內抑制膠原1基因的表達。心肌膠原中約75％為膠原1(Ju等，Can.J.Caridol.12:1259-1267(1996))。伴隨心臟肥大的胞外基質沉澱增加和間質纖維化可能是因為心力衰竭的病理生理學。通過抑制膠原1的產生，IFN-γ能減輕心力衰竭中的間質纖維化。
表1．Flup和/或IFN處理的大鼠的體重和器官重量
所給的數據是平均值±SEM，載體、Flup、Flup+IFN和IFN組的動物數量分別是14、14、14和9。載體鹽水；Flup氟前列醇；IFN幹擾素γ；BWO基礎體重；BW處理後體重；ΔBWBW-BWO；HW心臟重量；VW心室重量；LVW左心室重量；KW腎臟重量；SW脾臟重量。*p＜0.05，**p＜0.01，與載體組相比；#p＜0.05，##p＜0.01，與Flup組相比。
表2．壓力超負荷大鼠的體重、器官重量和HR
所給的數據是平均值±SEM，測定所有參數時，假手術、PO+載體和PO+IFN組的動物數量分別是16、22和21，測定HR時的動物數量為7、8和7。PO壓力超負荷；IFN幹擾素γ；BWO基礎體重；BW處理後體重；ΔBWBW-BWO；AW心房重量；KW腎臟重量；LW肝臟重量；SW脾臟重量；HR效率。*p＜0.05，**p＜0.01，與假手術組相比；#p＜0.05，##p＜0.01，與PO+載體組相比。
表3．IFN對基因表達的影響
PO壓力超負荷；IFN幹擾素γ；ANF心房利鈉因子；βMHCβ肌球蛋白重鏈；SKAα骨骼肌動蛋白；SMAα平滑肌肌動蛋白；COLⅠ膠原Ⅰ；COLⅢ膠原Ⅲ；FIB纖連蛋白。表達水平計算為與甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶之比。每組的n=6。數據是平均值±SEM。*與假手術+載體組相比的p＜0.05。
權利要求
1．一種治療心臟肥大的方法，包括給予心臟肥大患者治療有效量的γ幹擾素。
2．根據權利要求1所述的方法，其中所述的患者是人。
3．根據權利要求2所述的方法，其中所述的IFN-γ是重組人IFN-γ(rh-IFN-γ)。
4．根據權利要求3所述的方法，其中所述的IFN-γ是rh-IFN-γ-1b。
5．根據權利要求3所述的方法，其中所述的心臟肥大的特徵是PGF2α水平提高。
6．根據權利要求2所述的方法，其中所述心臟肥大是心肌梗塞誘導的。
7．根據權利要求6所述的方法，其中所述的IFN-γ給予於心肌梗塞後48小時內開始。
8．根據權利要求7所述的方法，其中所述的IFN-γ給予於心肌梗塞後24小時內開始。
9．根據權利要求2所述的方法，其中所述的患者具有患心臟肥大的危險性。
10．根據權利要求9所述的方法，其中所述的患者發生過心肌梗塞。
11．根據權利要求10所述的方法，其中所述的IFN-γ給予於心肌梗塞後48小時內開始。
12．根據權利要求11所述的方法，其中所述的IFN-γ給予於心肌梗塞後24小時內開始。
13．根據權利要求2所述的方法，其中所述的IFN-γ與至少一種其它治療心臟肥大或造成心臟肥大的心臟病的藥物聯用。
14．根據權利要求13所述的方法，其中所述的其它藥物選自β-腎上腺素 能阻斷劑、維拉帕米、difedipine和地爾硫。
15．根據權利要求14所述的方法，其中所述的β-腎上腺素能阻斷劑是卡維地洛、普奈洛爾、美託洛爾、噻嗎洛爾、氧烯洛爾或特他洛爾。
16．根據權利要求13所述的方法，其中所述的IFN-γ與抗高血壓藥聯用。
17．根據權利要求13所述的方法，其中所述的IFN-γ與ACE抑制劑聯用。
18．根據權利要求13所述的方法，其中所述的IFN-γ與內皮肽受體拮抗劑聯用。
19．根據權利要求13所述的方法，其中所述的IFN-γ在溶血栓藥之後使用。
20．根據權利要求18所述的方法，其中所述的溶血栓藥是重組人組織血纖蛋白溶酶原活化劑(rht-PA)。
21．根據權利要求13所述的方法，其中所述的IFN-γ在進行主血管成形術治療急性心肌梗塞後使用。
22．一種製造治療心臟肥大的藥物組合物的方法，包括將治療有效量的IFN-γ與藥學上認可的載體混合。
23．根據權利要求21所述的方法，其中所述的藥物組合物是液體。
24．根據權利要求22所述的方法，其中所述的藥物組合物含防腐劑。
25．根據權利要求23所述的方法，其中所述的藥物組合物是注射劑。
26．一種藥物產品，它包含(a)含至少一種治療有效量的IFN-γ的藥物組合物；(b)裝所述藥物組合物的容器；(c)貼在所述容器上的標籤，或包含在所述藥物產品中的包裝說明，說明所述IFN-γ在治療心臟肥大中的使用。
27．根據權利要求25所述的藥物產品，其中所述的容器具有無菌接口。
28．根據權利要求26所述的藥物產品，其中所述的容器是靜脈輸液袋或塞子可被皮下注射針穿通的管形瓶。
全文摘要
本發明涉及用γ幹擾素(IFN－γ)治療心臟肥大的方法。許多病理情況,包括心肌梗塞、高血壓、肥厚性心肌病和瓣膜返流,會導致心臟肥大。本發明治療方法覆蓋對心肌或有或沒有結構損傷的心臟肥大的各個發展階段,不論潛在的是何心臟疾病。
文檔編號A61K31/135GK1300221SQ99804881
公開日2001年6月20日 申請日期1999年3月19日 優先權日1998年4月2日
發明者金鴻奎, 盧賢維, N·J·保尼, 楊仁蕙 申請人:基因技術股份有限公司