抗口蹄疫病毒血清型共享單克隆抗體及其識別的抗原表位的製作方法

2023-07-14 08:17:41 2

專利名稱：：抗口蹄疫病毒血清型共享單克隆抗體及其識別的抗原表位的製作方法
技術領域：
：本發明涉及單克隆抗體，尤其涉及兩林抗口蹄疫病毒(FMDV)的血清型共享性單克隆抗體以及其中一抹單克隆抗體所識別的抗原表位，本發明上述單克隆抗體及其識別的抗原表位在口蹄疫診斷或防治中的應用，屬於口蹄疫的防制領域。
背景技術：
：口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)屬於小RM病毒科口蹄疫病毒屬的成員，其基因組為單股正鏈RNA，全長約8.5kb。口蹄疫是嚴重危害偶蹄動物的重要傳染病之一，該病可引起幼畜死亡、產奶量下降、肉食減少、肉品下降、動物的生產性能降低，導致巨大的經濟損失。此外，由於貿易的限制和禁止而引起的損失更大，全世界每年由此造成的直接經濟損失可達數百億美元。2005年以來在我國江蘇、山東、甘肅、北京、河北等地爆發了Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登錄號EF149009)，由於在我國江蘇省首先分離，被稱作Asial型江蘇譜系。該語系口蹄疫病毒在我國牛群中一經流行，傳播趨勢迅猛，造成的損失極為嚴重。本世紀初0型口蹄疫病毒泛亞語系在中國(0/Tibet/CHA/99，GenBank登錄號AJ539138)及周邊國家甚至歐洲(MasonPWetal.JGenVirol.2003,84(Pt6):1583-93)均有流行，給許多國家造成巨大損失。因此，積極開展Asia1型和0型口蹄疫(FMD)的研究，對我國FMD的防控具有重要的意義。口蹄疫病毒的抗原結構十分複雜，不同血清型、基因型和分離林的口蹄疫病毒其抗原表位和抗原位點都不盡相同，存在廣泛的抗原變異。利用單抗逃逸突變株序列分析和交叉中和試驗，已鑑定了一些不同血清型FMDV的抗原位點，相關的研究主要來自0、A、C和Asial型FMDV。中和性單抗在保護易感動物抵抗口蹄疫病毒感染過程中起主導作用，而某些相對保守的免疫顯性表位可誘導機體產生血清型共享型單抗，對於FMDV感染的診斷具有重要價值。近年來，對於相對保守的VP2蛋白N-末端區域的抗原性研究已有才艮道，Yang才艮道的針對FMDVVP2N-末端的單克隆抗體中，9B4、15F7和F1412SA表位均為胰蛋白S^t感型，用胰蛋白酶處理表位肽後，表位對單抗的活性消失，表明其表位屬於構象型，並包含Lys2(K2)-Lys3(K3)或Arg13(R13)殘基;可是Freiberg報導的單抗13A6和本發明中單克隆抗體4B2情況類似，識別肽段相同且都是非胰蛋白酶敏感型單抗，表明兩者表位區域相同或相似，因此將兩單抗重鏈可變區序列進行比對，結果證明二者有相近之處但並非相同的單抗；2007年Wang等對Asial型毒林YNBS/58的VP1和VP2上主要的抗原區段進行了免疫原性分析，結果發現，D7(VP1的133-163aa)和Bl(VP2的l-33aa)兩個區段,都能夠誘導豚鼠淋巴組織增生，但D7有中和活性而B1無中和活性。當用D7和B1共同免疫豚鼠時，能夠誘導出很高水平的中和抗體反應，說明B1(VP2N-末端)對D7(VP1133-163aa)的免疫原性有促進作用。在VP2的l-33aa區域，存在免疫活性位點，儘管不屬於中和性位點，但是該區段內的位點對於主要中和活性位點的免疫反應具有增強和促進作用。對於表位的定位和定性，國外這些研究是用單克隆抗體壓力篩選或用合成肽掃描技術，只能確定表位相關的胺基酸或肽段，不能精確地確定表位的位置和性質。我國雖有Asial型和O型FMDV單克隆抗體的文章發表，然而尚未見到共享表位單克隆抗體的報導;有關FMDV共享表位的精確定位和定性，國內外尚無研究報導。
發明內容本發明目的之一是提供兩抹能分別分泌抗FMDV血清型非依賴性的單克隆抗體4B2和3D9的雜交瘤細胞系；本發明目的之二是提供由上述單克隆抗體4B2所識別的所有血清型FMDV共有表位胺基酸序列；本發明目的之三是將上述單克隆抗體或共享性表位用於診斷或預防口蹄疫。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的一株能分泌抗FMDV非血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系4B2，其^f敖生物保藏號是CGMCCNo.3103;分類命名單克隆抗體雜交瘤細胞；保藏時間是2009年5月18日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所。上述雜交瘤細胞系4B2所分泌的單克隆抗體。本發明進一步確定了由該單克隆抗體所識別的FMDV非血清型依賴性線性表位，該線性表位基序的胺基酸殘基是FMDV-VP2蛋白的Glu6-Thr7-Thr8-X-Leu"-Glu11(SEQIDN0:1),其中，X選自任意一種胺基酸殘基，關鍵性胺基酸殘基為Glu6、Thr7、Thr8、Leu"和Glu11，決定性胺基酸為Glu";該表位最佳活性單位為十二肽2KKTEETTLLEDR13(SEQIDNO:2),其中，2KKTE5和12DR13對於表位基本活性單元Glu6-Thr7-Thr8-X-Leu"-Glu"具有增效作用。一林能分泌抗FMDV非血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系3D9,其微生物保藏號是CGMCCNo.3104;分類命名單克隆抗體雜交瘤細胞；保藏時間是2009年5月18日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所。由該雜交瘤細胞系3D9所分泌的抗FMDV的非血清型依賴性單克隆抗體。以雜交瘤細胞系3D9分泌的單克隆抗體3D9為捕獲抗體，以生物素標記的雜交瘤細胞系4B2分泌的單克隆抗體作為檢測抗體，採用抗原捕獲ELISA方法，可應用於4全測FMDV。本發明整體4支術方案的詳細描述本發明用純化的全病毒免疫BALB/c鼠製備抗Asial型江蘇鐠系FMDVAsial/YS/CHA/05和0型FMDV泛亞譜系O/YS/CHA/05才朱的單克隆抗體，分別獲得兩抹具有強反應活性的單克隆抗體4B2和3D9。ELISA及間接免疫螢光檢測表明，該兩抹單克隆抗體均屬於FMDV共享性單克隆抗體；間接免疫螢光和Westernblot檢測表明，4B2識別FMDV—個線性表位，3D9識別FMDV—個構象型表位。本發明進一步利用噬菌體展示隨機12肽庫篩選上述單抗4B2識別的模擬表位，發現一個表位基序ETTXLE(X代表20種胺基酸殘基任意一種)與單抗4B2具有結合活性。鑑於單抗4B2才莫擬表位基序ETTXLE與GenBank中7>布的所有7個血清型FMDV的VP2蛋白N-末端的6~11位胺基酸序列存在高度同源，用大腸桿菌融合表達一系列N-末端區域表位相關短肽，並進行Westernblot分析，確定ETTLLE六肽為單抗4B2表位的基本活性單元。進而確定該表位的最佳活性單位是2KKTEETTLLEDR^對單抗4B2識別表位的基本活性單元6個胺基酸殘基逐一進行胺基酸替換分析確定,其中5個胺基酸對於表位活性均是重要的，從而確定該表位的關鍵性胺基酸殘基為Glu6、Thr7、Thr8、Leu'。和Glu11,其中胺基酸殘基Glu"對於該表位活性起決定性作用；2KKTEs和uDRu對於表位基本活性單元ETTLLE均有增效作用。鑑於上述兩個單抗具有非血清型依賴性，而且在體外FMDV診斷方面具有糹艮高的特異性，本發明進而以單克隆抗體3D9為捕獲抗體、生物素標記的單克隆抗體4B2作為檢測抗體，建立了4企測FMDV的抗原捕獲ELISA方法。確定捕獲單克隆抗體3D9的最佳包被濃度為2.5ng/mL,檢測單克隆抗體4B2的最佳使用濃度為0.9pg/ml。敏感性試驗表明，該方法對AsialFMDV細胞毒的最低檢出量為1.8x104TCID5。，對0型FMDV細胞毒的最低檢出量為7.9x103TCID5。。符合性試驗表明，該方法對細胞毒的檢出率為100%，組織毒的4全出率為73.3%。對牛結核病、牛肺疫、牛流熱、赤羽病、牛傳染性鼻炎等病毒進行檢測，均為陰性，無交叉反應發生。本研究建立的FMDV抗原捕獲ELISA方法，具有敏感性高、特異性強和重複性好的特點，可用於FMDV的特異性^r測。本發明中的兩抹單克隆抗體及其表位對於FMDV的診斷試劑開發均有重要意義，對於表位疫苗研究也具有潛在的應用價值。圖l單抗4A8、4B2和lF6的細胞上清針對0型和Asial型抗原的IFA鬥全測；A-E:0型FMDV感染的BHK21細胞抗原;F-J:Asial型FMDV感染的BHK21細胞抗原；A-C、F-H:分別為4B2、1F6和4A8;D、I:陰性血清對照；E、J:陽性血清對照。圖2單抗3D9、4B2的特異性IFA鑑定。圖3SDS-PAGE鑑定純化的單克隆抗體3D9、4B2;M:蛋白分子量標記，1:純化單抗3D9，2:純化單抗4B2。圖4ELISA檢測與單抗4B2特異結合的24個噬菌體克隆；ELISA方法篩選單抗4B2特異性親和的噬菌體；用相同蝕斑數的各噬菌體克隆加入用單抗4B2包被的微孔板中，並設同種抗體亞型的單抗1F6、含1仰SA的封閉液和原始肽庫(PhageLibrary,PL)作為對照。圖5七個陽性噬菌體克隆的ELISA才企測；ELISA方法篩選單抗4B2特異性親和的噬菌體；用相同蝕斑數的各噬菌體克隆加入用單抗4B2包被的微孔板中，並設同種抗體亞型的單抗1F6、含1。/。BSA的封閉液和原始肽庫作為對照。圖67個陽性噬菌體克隆12肽的胺基酸序列比對。圖712肽與GenBank中所有VP2胺基酸序列比對結果。圖8載體pGEX-6p-l經BamHI和Xhol酶切鑑定；1:Marker;2:載體pGEX-6p-l。圖95條短肽插入載體pGEX-6p-l的PCR鑑定；M:Marker;1:Y15-l;2:Y15-2;3:六肽；4:5肽；5:四肽；6:H20對照。圖109條短肽插入載體pGEX-6p-l的PCR鑑定；M:Marker;1-9:L5dDKKTEETTLLEu)，L4GKKTEETTLLEu)，L3GKTEETTLLEu)，L2GXPTTLLEn),LI(5pTTLLEu)，Rl(6ETTLLE^12),R2(6ETTLLE^13),R3(6ETTLLEDRI14)和R4(6ETTLLEDRIL15)。圖117條短肽插入載體pGEX-6p-1的PCR鑑定；M:Marker;1-7:Y12(2KKTEETTLLEDR13),S—1(2KKTEATTLLEDR13),S-2(2KKTEEATLLEDR13)，S-3(2KKTEETALLEDRu)，S-4(2KKTEETTALEDR13)，S-5(2KKTEETTLAEDR13)和S-6(2KKTEETTLLADR13)。圖12SDS-PAGE(A)和Westernblot(B)分析，確定表位基本活性單元為6ETTLLEU。A,B:1.蛋白Marker;2:誘導前PGEX-6P-1;3:i秀導後PGEX-6P-1;4-8:表達的Y15-1，Y15-2，P6，P5和P4。圖13設計融合表位蛋白的SDS-PAGE(A)和Westernblot(B)分析，結果確定了明顯增強表位活性的胺基酸殘基為2KL和R13。已標出蛋白Marker;L5dDKKTEETTLLE。，L4(2KKTEETTLLEU),L3GKTEETTLLEn),L2(4TEETTLLE),LI(5|ETTLLE)，Rl(6ETTLLE^2)，R2(6ETTLLE^13)，R3(6ETTLLEDRI14)和R4(6ETTLLEDRIL15)。10圖14設計融合表位蛋白的SDS-PAGE(左)和WesternMot分析(右)鑑定表位最佳活性單位為2KKTEETTLLEDR13。1:蛋白Marker;2:Y15-1;3:Y12;4:L4;5:R2;5:Y15-2。圖15設計融合表位蛋白的SDS-PAGE(A)和Westernblot(B)分析。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。一、材料和方法1.病毒、細胞、菌4朱和實驗動物口蹄疫病毒抹Asial/YS/CHA/05屬於Asial型FMDV江蘇譜系，該譜系毒林2005年以來在我國江蘇、山東、甘肅、北京、河北等地爆發流行(Asial/JS/CHA/05,GenBank登錄號:EF149009);O/YS/CHA/05林屬於O型泛亞譜系，該語系毒4朱上世紀末本世紀初在中國(O/Tibet/CHA-/99，GenBank登錄號:AJ539138)及周邊國家甚至歐洲(MasonPWetal.JGenVirol.2003，84(Pt6):1583-93)均有流行，給許多國家造成巨大損失。乳倉鼠腎細胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤細胞為本實驗室保存；質粒pGEX-6p-l和受體菌BL21由本實驗室保存；清潔級雌性BALB/c小鼠、SPFli級BALB/c乳鼠購於中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。2.主要試劑融合劑PEG/DMS0(Mw，1450)、HAT鹽(50x)、HT鹽(50x)、HRP或FITC標記的羊抗鼠IgG、購自Sigma公司;法國白油佐劑MONTANIDEISA206VG購自SEPPIC公司；單克隆抗體亞類鑑定試劑盒購自SouthernBiotech公司；L-穀氨醯胺(glutamine)、甘氨酸購自Amresco/^司；二甲基亞石風(DMSO)、鄰苯二胺(OPD)、PEG6000購自Solarbio公司;Ph.D.-12'，庫試劑盒購自NewEnglandBiolabs/^司；HRP標記抗的M13噬菌體抗體購自於GEHealthcare公司;限制性內切酶5細HI、為I購自TaKaRa公司;T4DNA連接酶購自NewEnglandBiolabs公司；高糖DMEM乾粉購自GIBCO公司；進口優級胎牛血清(PAA)購自西班牙Nalgene公司；96孔細胞培養板購自加拿大JETBiochemical公司。3.鼠免疫與單克隆抗體的製備(1)將0型FMDV細胞適應泰接種於長滿單層的BHK-21細胞，待75°/。以上細胞出現病變後收毒。將收穫的細胞培養液反覆凍融三次，初步裂解細胞，釋》文病毒。凍融後的病毒液以l:1OOO加入TritonX-100和4:10000加入甲醛裂解與滅活48h以上，取滅活過的病毒液lmL上BHK-21細胞盲傳三代，檢測是否滅活徹底。將經凍融裂解後的培養液作9OOOrpm(Beckman高速離心機，JA-10轉子)、4。C離心90min，回收病毒液上清，棄去細胞沉澱。按病毒液上清的體積加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室溫攪拌2h至完全溶解，4。C過夜沉澱。次日將上清9OOOrpm、4'C離心90min，棄上清，回收沉澱。用NET緩沖液於低溫下將沉澱輕輕重懸。將重懸的上清2912OOOrpm、4。C離心2h，回收沉澱，於低溫下用適量的NET緩衝液輕輕重懸沉澱，充分混勻後分裝，-70。C凍存備用。將提純抗原用NET緩衝液進行IO倍、IOO倍、IOOO倍稀釋，用分光光度計測量蛋白質的濃度。(2)用純化的0型FMDV抗原200ng/200piL加等體積法國白油佐劑206VG,充分乳化後經背部皮下注射6周齡雌性BALB/c小鼠；2周後進行第2次免疫；間隔2周後，以不加佐劑的等量抗原進^f於第3次免疫。為刺激小鼠快速產生強烈免疫反應，於融合前3d採用尾靜脈和脾臟注射相結合的免疫方式進行加強免疫，注射二倍量抗原。(3)細胞融合a)飼養層細胞的製備細胞融合前一天進行飼養層細胞的製備，眼科剪刀、眼科鑷子、平皿等試驗用具用前高溫乾熱滅菌，HAT完全培養液做無菌檢驗。取2隻BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常規方法分離陰性血清。拉頸脫臼處死小鼠，將其浸泡於75%酒精中，10min後移入超淨工作檯。將小鼠腹部向上固定在鼠架上，用鑷子提起腹正中部皮膚，眼科剪刀橫向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和鑷子上下撕開皮膚，充分暴露腹膜。用鑷子輕輕^腹膜，將10ml注射器內吸取的8-10mlHAT完全培養液注入腹腔，切勿刺破臟器和腸道，注射器不要拔出，在腹腔內來回抽吸5-10次，然後用鑷子按摩兩側腹部30秒左右，再進行抽吸，重複以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔內液體。注意避開腸繫膜及脂肪組織，以免堵塞針頭。將從2隻鼠中取出的腹腔細胞加入55mlHAT培養液中，吹散混勻細胞，分裝於6塊96孔培養板，100nl/孔。置於37。C、5%0)2培養箱中培養。b)骨髓瘤細胞的製備融合前36-48h，將骨髓瘤細胞擴大培養，使13細胞處於對數生長期。融合當天，用15mlDMEM基礎培養液將細胞從瓶壁上吹下，收集於50ml離心管中。1000rpm離心10min。將細胞沉澱重懸置20mlDMEM基礎培養液中，混勻。取少量骨髓瘤細胞懸液，臺盼蘭染色計數，備用。c)免疫脾細胞的製備融合前摘除小鼠眼球採血，製備陽性血清。將小鼠拉頸脫臼致死，浸泡於751酒精中，10min後放於超淨臺。無菌打開腹腔，分離結締組織並取出脾臟，將脾臟放入裝有滅菌尼龍網和盛有15mlDMEM基礎培養液的平ini中，用滅菌玻璃注射器內芯研磨脾臟，使脾細胞全部通過網孔進入平皿中。將脾細胞溶液轉入50ml離心管中，加DMEM基礎培養液大約至30ml，混勻。1000rpm離心8min，棄上清。將細胞沉澱懸於10mlDMEM基礎培養液中，混勻。取細胞懸液，臺盼蘭染色計數，備用。d)脾細胞與骨髓瘤細胞融合取65mlHAT培養液，15ml勤出DMEM培養液和lml50y。PEG於37。C水浴中預熱，另備盛有37。C水的200ml燒杯。4安5份脾細胞數力口l份骨髓瘤細胞數擬目應細胞懸液量，加入50ml玻璃離心管中，補力口DMEM基礎培養液至30ml，混勻。1OOOrpm離心10min,棄上清，儘可能倒幹。用手掌輕擊離心管底部，使沉澱細胞+碌均勻呈糊狀。將離心管方文入盛有37'C水的200ml燒杯中，一手均勻轉動離心管，另一手用lml巴氏吸管吸取37。C50%PEG溶液lml，lmin內加完，靜置2min。隨後先十曼後快地加入DMEM基礎培養液終止反應，37。C水浴靜置10min。1000rpm離心10min,棄上清，加入65mlHAT培養基，輕輕地吹散細胞，每孔O.lml接種於已培養有飼養細胞的6塊96孔培養板，置37。C、5%的(:02培養箱中培養。5d後半量換液，8d後全換液，待克隆長至孔底面積l/4-l/3時取上清14進行檢測並換HT培養液。4.抗體檢測ELISA用提純的病毒抗原包被於微孔板中，加入10(^1雜交瘤細胞培養上清，37。C溫育lh後洗滌，加入1:5000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，洗滌後加入底物OPD避光顯色1Omin，于波長492nm測定吸光值。5.間接免疫螢光微孔板培養BHK-21細胞至單層，接種口蹄疫病毒4x103TCID5。/well,出現CPE之前用冷無水乙醇進行固定，加入50pl雜交瘤細胞培養上清，37°C溫育40min後PBS洗滌三次，加入1:200稀釋的螢光素標記羊抗鼠IgG抗體，37°C溫育40min,洗滌後在倒置螢光顯微鏡下觀察，以+號數目記錄螢光強度。6.微量細胞中和試驗(l)病毒毒價的測定將病毒接種於單層細胞，37。C吸附lh後加入維持液，置溫箱培養；逐日觀察，待細胞病變(CPE)達75%以上，收穫病毒懸液凍融3次，以3000r/min離心10min,取上清液，定量分裝成lml小瓶置-7(TC保存備用，選用的病毒必須是對細胞有較穩定的致病力。取自-7(TC冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養板上作10倍遞進稀釋即l(T1，10—2，10—11…...，每孔病毒懸液量為50jii1，每個稀釋度作8孑L,每孔加入100細胞懸液，每塊板的最後一行設8孔細胞對照，製備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5°化02溫箱37。C培養，從48-72h逐日觀察細胞病變，記錄結果。按Reed和Muench兩氏法計算TCID5。。15表ltableseeoriginaldocumentpage16(2)中和試驗動物腹水中，含有多種蛋白質成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫J求蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素，用於中和試驗的血清或腹水須經加熱56°C30min滅活處理。取已滅活處理的單抗腹水，在96孔微量細胞培養板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀釋,使其稀釋度分別為原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、l:64等等，每孔含量為50jal，每個稀釋度作4孔。取-7(TC水箱保存的病毒液，將原始毒價稀釋至200TCIDs。，50pl(與等量腹水混合，其毒價為100TCID5。)。如病毒價為l(T63，50ja1。所以應將病毒作2x10-43稀釋。每孔加入50iil病毒稀釋液，封好蓋，置於37。C溫箱中和lh。在製備細胞懸液時，其濃度以在24h內長滿單層為度血清與病毒中和lh後取出，每孔加入100jul細胞懸液。置5%C0237。C溫箱培養，自培養48h開始逐日觀察記錄，120h終判。為保證試驗結果的準確性，每次試驗都必須設置下列對照。陽性和陰性(sp2/0)腹水與待檢腹水進行平行試驗,陽性腹水對照應不出現細胞病變，而陰性腹水對照應出現細胞病變。每次試-驗每一塊板上都設立病毒對照，先將病毒作0.1、1、10、100、1000TCID5。稀釋，每個稀釋度作4孑L，每孔加50m1。然後每孔100ju1細胞懸液。0.lTCIDTCIDs。應不引起細胞病變，而且100TCIDs。必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。為檢查被檢腹水本身對細胞有無任何毒性作用，設立被檢腹水毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢腹水(相當於中和試驗中被檢腹水的最低稀釋度)。正常細胞對照即不接種病毒和待檢腹水的細胞懸液孔。正常細胞對照應在整個中和試驗中一直保持良好的形態和生活特徵，為避免培養板本身引起試驗誤差，應在每塊板上都設立這一對照。當病毒回歸試一驗，陽性、陰性、正常細胞對照相，腹水毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢腹水孔出現100%CPE判為陰性，50%以上細胞出現保護者為陽性；固定病毒稀釋腹水中和試驗的結果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產生細胞病變的腹水稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結果。表2固定病毒-稀釋血清法中和抗體效價計算tableseeoriginaldocumentpage17用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結果80%-50%距離比例=-=0.580%-20%IgPDs。-高於50%血清稀釋度的對數-距離比例x稀釋係數的對數IgPD50=-1.5-0.5x(-0.3)=-1.35貝'JPD50=10—L36，50ja1因10—135=l/22,即1:22的血清可保護50%細胞不產生病變，1:22就是該份血清的中和抗體效價。7.生物淘洗將腹水先經辛酸-硫酸銨法粗提，然後用MbProteinGSpinPurificationKit(PIERCE)進行親和層析純化，經SDS-PAGE鑑定純度後用於生物淘洗，用M13噬菌體展示隨機線性十二肽庫對單抗進行表位作圖。生物淘洗參照試劑盒說明書進行第l輪淘洗於微孔板中包被l(^g單抗，第2、3輪分別包淨皮5pg、lpg,4°C過夜；0.05%TBST洗滌後，用10g/LBSA封閉，加入1.5xl011pfu/100jLil展示十二肽的M13噬菌體，室溫輕搖lh，TBST洗滌10次後，用洗脫緩沖液將結合的噬菌體於室溫輕搖10min洗脫下來，加入緩衝液中和洗脫的噬菌體，接種大腸桿菌ER2738進行擴增。對擴增後的噬菌體進行回收並測定滴度，取1.5x10"pfu噬菌體進入下一輪淘洗。第4輪淘洗釆用ProteinG捕獲法進行液相結合，單抗使用量為300ng。挑取單個噬菌體克隆進行擴增，用噬菌體親和捕獲ELISA鑑定其活性，最後對陽性噬菌體的單鏈DNA進行序列分析。8.噬菌體親和捕獲ELISA於96孔聚乙烯酶標板中包被100ng單抗(每孔10(^1,0.1M》友酸氫鈉pH8.6)，4'C過夜，設立重複孔，同時設立識別不同表位的來源於同一隻小鼠製備的單克隆抗體，1仰SA封閉液為對照。室溫封閉2h後，用0.1。/。TBST稀釋噬菌體克隆至1(Tpfu/10(^l,加入每孔，室溫輕搖反應lh,用0.1%TBST洗六次後，加入1:5000稀釋的HRP標記的鼠抗M13喧菌體抗18體,用底物ABTS[2，2'-azinobis(3-ethylbenzthiazo1inesulfonicacid)]顯色後於"5nm測吸光度，以P/N〉2.1作為待檢樣品的陽性結果判定標準。9.噬菌體單鏈DNA模板的製備與測序在第3、4輪淘洗後，隨機挑選噬菌體克隆，分別接種到含lml1:100稀釋的ER2738對數中期培養物，於37。C震蕩培養4.5h。12OOOrpm離心10min,各取500pl上清到新管中，每管加入200plPEG/NaCl，混勻後，靜置10min，12OOOrpm離心10min,沉澱溶於100jal石典化鈉緩衝液中，再加入250pl無水乙醇，室溫靜置10min,12OOOrpm離心10min,棄上清，沉澱用70%乙醇洗滌，自然乾燥後，用30fi1純水溶解，即可作為測序才莫板。測序由上海生物工程有限公司完成，測序引物為-96gl11,序列為5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，。10.SDS-PAGE和Westernblot分析SDS-PAGE、轉印、封閉等操作，按實驗室常規方法進行，再與封閉液稀釋的腹水單抗(1:1000)37。C反應lh,Tris-Cl洗液洗塗3次，每次10min,然後與l:5000倍稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG室溫反應lh，洗滌3次，每次10min，最後置於MB底物顯色液中顯色，觀察記錄結果。1911.大腸桿菌融合表達表位相關短肽人工合成編碼表位和截短表位DNA的兩條互補寡核苷酸鏈，如表3、4、5所示。插入片段上遊引入&頂HI粘性延伸末端(小寫部分)，下遊引入終止密碼子以及Eol粘性延伸末端(下劃線部分)，並才艮據大腸桿菌密碼子偏好對該表位基因進行密碼子優化。表3.表位基本活性單元鑑定相關短肽及鑑定引物編碼DNA的互補寡核苷酸鏈短肽互補寡核苷酸鏈DKKTEETTLLEDRILETTIXEDRILTTRNGETTLXETTLLEPCR鑑定引物15-1-叩5'gatccGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCCTGTAAe:15-l匿low:5'^gagTTACAGGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTGTCg15-2-叩5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCCTGACTACCCGCAACGGGTAAg315-2-low:5'Jeg^gTTACCCGTTGCGGGTAGTCAGGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg6-叩5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGTAAg3'6-low:5'^eg^gTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'5-up:5'gatccACCACTCTTCTTGAGTAAs3'5-low:5'ieg^gTTACTCAAGAAGAGTGGTg3'4匿up:5'gatccACTCTTCTTGAGTAAs3'4-low:5'teg^gTTACTCAAGAAGAGTg3,Up:5'AACCGAGGAGACCACTCTTCTTG3'Low:5'CGCTCGTCGTTTGGTATGGCT3'20表4.表位增效胺基酸鑑定相關短肽編碼DNA的互補寡核苷酸鏈短肽互補寡核苷酸鏈ETTLLEDR7-up:R7-low:gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACTAAe3'mgigTTAGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'ETT1XEDRR8-up:5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCTAAs3'R8-low:5'IsgigTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'ETTLLEDRIR9-up:R9-low:5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCTAAe3'5'tSg5gTTAGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'ETTIXEDRILR10隱up:5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCCTCTAAs3'R10-low:5'tegagTTAGAGGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'EETTLLEL7-up:5'gatccGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAe3'L7隱low:5'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCg3'TEETTLLEL8-up:L8-low:5'gatccACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAg3'5'Jeg5gTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTg3'KTEETTLLEL9-up:5'gatccAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAe3'L9-low:5'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTg3'KKTEETTLLEL10-up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAs3'L10-low:5'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'DKKTEETTLLEL11-up:Lll-low:gatccGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAe3'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTGTCg3'21表5.表位關鍵性胺基酸鑑定相關短肽及鑑定引物編碼DNA的互補寡核苷酸鏈短肽互補寡核苷酸鏈Y12:;KKTEETTLLEDR12-up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCTAAe3'12-low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-l:KKTEATTLLEDR12-1up:5'gatccAAGAAAACCGAGGCGACCACTCTTCTTGAGGACCGCTAAe3'12-1low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCGCCTCGGTTTTCTTg3,S隱2:KKTEEATLLEDR12-2up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGGCGACTCTTCTTGAGGACCGCTAAe3'12-2low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTCGCCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-3:KKTEETALLEDR12-3up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCGCGCTTCTTGAGGACCGCTAAe3,12-3low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGCGCGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-4:KKTEETTALEDR12-4up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTGCGCTTGAGGACCGCTAAs3,12-4low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGCGCAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-5:KKTEETTLAEDR12-5up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTGCGGAGGACCGCTAAe3'12-5low:5'tegagTTAGCGGTCCTCCGCAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-6:KKTEETTLLADR12-6up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGCGGACCGCTAAe3'12-6low:5'tcgagTTAGCGGTCCGCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg鑑定引物up:5'CTGGGATCCAAGAAAACCGAG3'low:5'CGCTCGTCGTTTGGTATGGCT3'將兩條互補鏈直接退火形成帶粘性末端的雙鏈DM,插入pGEX-6p-1的化/HHI和Xi3oI之間，轉化BL21感受態細胞，用PstI酶切鑑定重組質粒，分別命名(表3-5)。挑取單個陽性菌落過夜培養並測序驗證，然後1:IOO稀釋接種於新鮮的液體LB培養基中，37。C震蕩培養至OD6。。^0.6,加入誘導劑IPTG至終濃度為lmmol/L,37。C繼續培養5h,收集菌體並用適量的PBS重懸，備用。12.SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測SDS-PAGE電泳(15%Tris-glycine)分離融合蛋白，轉印至硝酸纖維素濾膜上(90V,45min),用5W脫脂乳-PBS封閉液於4。C封閉過夜，與單抗8E8於37。C溫育lh,與HRP標記的羊抗鼠IgG於室溫作用lh,DAB(6mg/10mL)顯色。13.單克隆抗體的純化及生物素標記將單克隆抗體3D9、4B2先經辛酸-硫酸銨法初步提純，然後用PIERCE公司NAbTMSpinPurificationKits進行親和層析純化。13.1辛酸-硫酸銨法初步提純主要步驟如下(1)取3ml預處理過的腹水加6ml0.06mol/LPH4.8醋酸i爰衝液，攪拌均勻；腹水中加99^1辛酸(水浴下逐滴加入辛酸)攪拌30分鐘，4。C靜置2小時以上；取出11000rpm離心30分鐘，棄沉澱；上清用2mol/LNaOH調PH至7.4(只需加1^1左右即可)；(2)在4。C下加入飽和硫酸銨至50°/。飽和度，水浴攪拌作用30分鐘，4。C靜置2小時以上；11000轉離心30分鐘，棄上清；沉澱溶於5ml0.1M的PH7.4的PBS中；(3)向沉澱懸浮中便攪拌邊加適量飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液中濃度為30%—40%,冰浴攪拌作用30分鐘，4度靜止2小時以上；11000轉離心30分鐘，取沉澱，將沉澱融入2ml0.1M的PH7.4的PBS中；(4)將沉澱懸浮液裝入透析帶中，4。C用0.1M的PH7.4的PBS透析，2小時^:液一次，透析2天。13.2親和層析純化操作步驟如下(1)渦旋混勻蛋白G填料，吸取200ju1蛋白G加入吸附柱；(2)加入300ju1結合緩衝液，輕輕混勻；(3)5000xg離心lmin,取出吸附柱，棄去收集管中的液體；(4)重新將吸附柱放入收集管中，加入400jil結合緩衝液，混勻後5000xg離心lmin;(5)取出吸附柱，棄去收集管中的液體，將吸附柱重新放入收集管；(6)加入200n1辛酸-硫酸銨法初步提純的單抗樣品到吸附柱中，室溫作用30min，不時地搖動確保凝膠填料始終處於懸浮狀態；(7)5000xg離心lmin，將吸附柱移入一個新的收集管中；(8)向吸附柱中加入400jLi1結合緩衝液，混勻懸浮凝膠填料，5000xg離心lmin.棄去收集管中的液體.將吸附柱重新移入收集管中.重複兩次；(9)將吸附柱移入一新的收集管，加入400ja1洗脫緩衝液，混勻凝膠填料5min;(10)5000xg離心lmin，然後將吸附柱轉入新的收集管，收集蛋白洗脫液；(11)紫外分光光度計測定洗脫液蛋白含量，小量分裝，-2(TC凍存備用。13.3生物素標記單抗4B2:用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotinylation試劑盒對單抗4B2進行生物素化，按照產品說明書上的方法進行生物素標記，具體步驟如下(1)Sulfo-NHS-LC-生物素的配製。從-20。C水箱中取出Sulfo-NHS-LC-生物素，在打開之前使其溫度與室內溫度保持一致。取2.2mgSulfo-NHS-LC-生物素，溶於400nl的去離子水中，配製為10mMSulfo-NHS-LC-生物素，現用現配。(2)MAb純化物的配製。取出親和層析純化的單抗，將其用PBS配製成2mg/ml的蛋白液。(3)MAb純化物的生物素化。4要照MAbs純化物摩爾數Sulfo-NHS-LC-生物素為1:20(Sulfo-NHS-LC-生物素充分過量)的比例進行混合，將27jil的10mMSulfo-NHS-LC-生物素加入至lml2mg/mlMAbs純化物中，放置水中孵育2h。(4)透析去鹽。採用試劑盒所帶的Zeba去鹽柱將未發生反應的生物素小分子和鹽類清除掉。(5)收集透析後的生物素化的MAb。二、試驗結果(一)4B2和3D9單克隆抗體的製備及4B2識別表位的鑑定1.針對FMDV非血清型依賴性線性表位單克隆抗體的篩選和鑑定免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合的雜交瘤細胞培養上清，用間接ELISA檢測和IFA驗證，陽性判定標準為，以雜交瘤培養上清對FMDV抗原的0D"2光吸收值與正常BALB/c小鼠血清、SP2/0細胞上清對FMDV抗原0D^值之比均大於2.1,且雜交瘤細胞上清對正常BHK-21細胞的免疫螢光結果為陰性，判為陽性雜交瘤細胞。經篩選和三次有限稀釋法克隆，獲得2抹陽性雜交瘤細胞，分別命名為4B2和3D9。用雜交瘤上清鑑定2抹雜交瘤細胞分泌抗體的免疫球蛋白亞類，結果顯示，3D9重鏈類型為IgG2b,4B2重鏈類型為IgGl,2株單抗輕鏈均為k類型(表6)。與0/YS/CHA/05抹和Asial/YS/CHA/05病毒抹的中和試^r顯示單抗3D9和4B2都未能達到1:32的稀釋比，判定為無中和活性。對2林單抗進行了全病毒Westernblot分析，3D9未見特異性反應條帶，而4B2有明顯反應條帶。因此認為，所獲得的2株單抗3D9識別構象型表位、而4B2識別線性表位。表6抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體生物學特性鑑定單抗抗體亞類間接免疫螢光試驗中和試驗Westernblot3D9IgG2b/K++++4B2IgGl/K+++++2.4B2免疫螢光;f企測在單抗的血清型特異性分析時，用4B2和另外24朱0型FMDV單抗進行0型和Asial型抗原的IFA才僉測(圖l)。結果證明，4B2能夠識別所有檢測對象，可確定該單抗為非血清型依賴性FMDV共享表位單克隆抗體。3.3D9、4B2與多血清型FMDV抗原的間接免疫螢光檢測分別用Asial型、0型和A型FMDV各個基因型代表毒株感染BHK-21細胞，同時設立BHK-21細胞對照，經無水乙醇固定後進行間接免疫螢光實驗，鑑定單抗3D9、4B2與不同血清型和基因型FMDV的反應性，結果如圖2顯示，單抗3D9、4B2與全部6個FMDV代表毒林均有反應。從而，確定單抗3D9、4B2為FMDV各個基因型共享性單克隆抗體。4.單克隆抗體3D9、4B2純化單克隆抗體3D9、4B2經辛酸-硫酸銨和親和層析純化後，經SDS-PAGE鑑定純度，結果如圖3所示，分別大約在55kDa和25kDa處可見Ig重鏈和輕鏈兩條特異性條帶，與預期相符；經紫外分光光度計測定兩者的蛋白含量分別為2.5mg/mL、2.6mg/mL。(二)4B2識別表位的精確定位及鑑定1.單抗4B2識別的模擬表位基序為ETTXLE為鑑定單抗4B2識別的線性表位，本實4全利用一個展示隨^^線性十二肽的噬菌體文庫對純化的單抗4B2進行4輪生物淘洗(表7),在第3、4輪共挑取36個噬菌體克隆進行擴增，用噬菌體親和捕獲ELISA鑑定其反應活性，設立同一隻鼠製備的同種抗體亞型的單抗1F6和封閉液BSA作為對照，以排除抗體恆定區以及BSA的幹擾，最終獲得24個針對抗體可變區的陽性噬菌體克隆(圖4),均具有較高的親和力。對這些陽性噬菌體克隆的單鏈DNA進行序列分析，獲得7條不同的12肽序列，命名為P9、P12、P14、Pll、P22、P16和P8。再將該7個不同噬菌體陽性克隆進一步用ELISA檢測，並按照3次實驗平均值大小排序建圖(圖5)。將7條不同的12肽氨基*列進行序列比對，從結果中可以推導出7個噬菌體克隆均含有一個特徵性序列ETTXLE(x代表20種胺基酸殘基任意一種)(圖6)，將其暫定為單抗4B2識別的線性表位的基序。將基序ETTXLE與GenBank中所有7個血清型FMDVPl蛋白胺基酸序列比對，發現其與VP2N-端的第6-ll位胺基酸(6ETTLLEU)顯示出極高的相似性(圖8)，而且，該區域在所有血清型FMDV中高度保守。因此提出4B2可能為所有血清型FMDV共享型單抗。在基序推導時，本發明人注意到，P9、P12、P14和P11對於TTXLE的確定起到關鍵作用，尤其P14中的胺基酸序列TTXLE更具說服力。P22、P16和P8對於E6的確定作用也很明確。在胺基酸性質和功能方面，S與T、D與E由於胺基酸性質和功能相似可以相互替換；而E與G也在胺基酸的某些方面有相近的地方，例如結構和溶解性等。因此，雖然P8的反應活性降低，但依然能為4B2所識別。表7利用噬菌體展示肽庫對4B2進行4輪生物淘選結果RoundsInputOutput產率(%)Ist1.5x10"4x1052.7x10-42nd1.5x10116x1074x10—23rd1.5x10"9x1076xl(T24th1.5x10112x1061.3xl(T31.4B2表位精確定位為詳細描述4B2表位，首先需要驗證4B2是否能與ETTLLT發生特異的反應。本發明的策略是，用大腸桿菌融合表達VP2N-末端包含6ETTLLEU的兩個15aa重疊肽Y15-l(^KKTEETTLLEDRI！^)和Y15-2(6ETTLLEDRILTTRNG2。)、六肽(6ETTLLEU)及其N-端截短的五肽(7TTLLEU)和四肽(8TLLEU)。通過WesternMot分析，確定六肽(6ETTLLE)是否為該表位活性的基本單元。其次，在基本單元左右兩側分別逐一增加胺基酸殘基以融合表達9條寡肽，Rl(6ETTLLEQ12)、R2(6ETTLLE^13)、R3(6ETTLLEDRI14)、R4(6ETTLLEDRIL15)、LI(5pTTLLEu)、L2Gj^ETTLLEn)、L3(3KTEETTLLEn)、L4(2KKTEETTLLEU)和L5dDKKTEETTLLEu),以一驗證哪兩個胺基酸(左)和(右)均能明顯增強該基本單元活性，;現為強化該表位活性的臨界胺基酸。結果證明2K3K和Ru為明顯增強該基本單元活性的臨界胺基酸。在此勤出上，設計表達Y12(2KKTEETTLLEDR13)，經與先前各肽連同Y15-1、L4、R2和Y15-2進行Westernblot分析，比4交驗證，確定Y12為該表位最佳活性單元。繼而以Y12為參考肽，將其中基本活性單元(2ETTLLEU)的胺基酸殘基逐個用丙氨酸(A)替換，Westernblot分析顯示，以確定對該表位活性有貢獻性的胺基酸，即關鍵性胺基酸。2.1酶切及產物連接鑑定結果載體pGEX-6p-l經BamHI和Xhol酶切鑑定結果，表明載體已經^皮準確切割，大小在4900bp左右，如圖8所示。所設計的5、9和7條短肽插入片段與載體pGEX-6p-l連接後經酶切鑑定結果,設計包括酶切位點在內的片萃更大小約1000bp，如圖9、10和11所示。結果證明，外源片段連入正確，可以用於下一步的融合表達及Westernblot分析。2.24B2表位基本活性單元為六肽(6ETTLLEU)融合表達寡肽Y15-1(J)KKTEETTLLEDRIL丄5)、Y15-2(6ETTLLEDRILTTRNG20)、六肽P6(6ETTLLEU)、五肽P5(7TTLLEU)和四肽P4(8TLLE),與4B2進行Westernblot分析。同時設空載體對照。結果顯示，Y15-l與4B2呈強反應；Y15-2次之；六肽最弱；五肽、四肽和載體對照均無條帶。由此可確定六肽(6ETTLLEn)為表位活性的最小單位(圖12，B)。為確保結果的真實性，本試驗採用SuperEclPlus超敏顯色試劑盒和FUJIFILM發光成像分析儀LAS-3000,對於反應條帶進行了高靈敏性分析。2.34B2表位活性最佳單位為12肽2KKTEETTLLEDR13根據前面的實-3^i殳計，融合表達R1(6ETTLLE仏2)、R2(6ETTLLE2E13)、R3(6ETTLLEDRI14)、R4(6ETTLLEDRIL15)、LlG旦ETTLLEn)、L2(4HETTLLE)、L3(3KTEETTLLEU)、L4(2KKTEETTLLE)和L5dDKKTEETTLLEn)，以L5-R4的表達產物(定量)分別與純化的4B2100ug/lane進行SDS-PAGE(圖4-13，A)和Westernblotv(圖13，B)分析。結果顯示，從L4與R2開始，反應條帶隨著2{^和1113的分別加入而明顯增強，說明2U(和Ru的重要參與對該表位免疫反應均有明顯的強化作用。從而可以判定2K3K和1113為對於表位活性基本單元活性增強的臨界胺基酸。因此，基本上確定了增強基本單元ETTLLE活性的最小範圍。才艮據前面結果,再融合表達Y12(2KKTEETTLLEDRJ,連同Y15-l、L4、R2和Y15-2進行SDS-PAGE(圖14，A)和Westernblot(圖14，B)分析。結果發現，Y15-1和Y12的條帶明顯強於其它L4、R2和Y15-2,此結果進一步驗證了Y12的強活性。由於要選擇胺基酸序列更短且活性最強的表達肽，因此，比較而言，選擇Y12(2KKTEETTLLEDRJ作為表位最佳活性單元較為合理。3.4B2表位中關鍵性胺基酸Glu6(E6)、Thr7(T7)、Thr8(T8)、Leu"(U)和Glu"(En)以Y12為參考肽，對表位中基本活性單元6ETTLLEn的胺基酸逐一用丙氨酸(A)替換，命名為S-1(KKTEATTLLEDR)、S-2(KKTEEATLLEDR)、S-3(KKTEETALLEDR)、S-4(KKTEETTALEDR)、S-5(KKTEETTLAEDR)和S-6(KKTEETTLLADR)。原核表達各置換的短肽並以Westernblot檢l全各置換肽的活性消減情況。表達的寡肽和Y12—同進行SDS-PAGE和Westernblot分析，結果顯示，S-2、S-3和S-5反應明顯減弱，而S-6無反應，說明6ETTLLEn中T7、T8、U和En對該表位均有貢獻;其中Eu對該表位活性起決定性作用，一經替換，導致該表位不被4B2所識別(圖15)。結合2.4結果，最後確定&、T7、T8、L,。和Eu均為該表位的關鍵性胺基酸。對VP2蛋白進行同源建模顯示，4B2表位所在的VP2蛋白N-末端剛好處於三重軸附近的蛋白底部，並恰好覆蓋了病毒粒子上的Ca2+位點。該位置雖然具有隱蔽性，但仍能被特異性抗體識別。因此，單抗4B2可克服FMD診斷的血清型限制，應用於通用型診斷試劑的開發。試驗例1本發明單抗的應用效果試驗1.包被單抗和檢測單抗4吏用濃度的確定採用實施例1中13.1方法包被單抗和檢測單抗使用濃度，結果表明當捕獲單抗3D91:1000稀釋(2.5ng/mL)、生物素標記檢測單抗4B2為1:100稀釋(0.9ng/ml)時，OD45^值接近1.0而且P/N比值最大。結果如表8所示。表8捕獲單抗最佳包被濃度及檢測單抗最佳使用濃度方陣滴定結果檢測抗體稀釋梯度Asial型O型細胞對照Asial型O型細胞對照1000.708961.290060.133820.468620.805070.11512000.593181.125610.111260.366530.716680.09583楊0.507830.895590.092160.313060.566380.088858000.41730.857290.074280.269750.49690.0846616000.310560,693670.08550.204030.458780.0772232000.221880.493070.076160.163310.318640.0693264000.156440.322160.076680.124480.230140.07961128000.114230.223280.071520.100730.161810.06689捕獲抗體稀釋梯度1000100010002000200020002.敏感性試驗將AsialFMDV細胞毒(TCID5。=106'75)和0型FMDV細胞毒(TCID5。=106.5)進行梯度稀釋，進行ELISA檢測，結果顯示，該方法對AsialFMDV細胞毒的最低檢出量為1.8x104TCIDs。，對0型FMDV細胞毒的最低檢出量為7.9x103TCID5。。如表9所示。_表9敏感性實驗測定結果_細胞毒稀釋度1:11:101:1001:2001:3001:4001:5001:600Asial1.138960.906440.325840.207320.171290.12750.110040.10116O型1.418450.965790.306310.202890.161550.141770.120550.1119細胞對照0.064310.067020.062370.059970.061890.061020.065690.06744將1:50倍稀釋抗Asial型FMDV陽性牛血清、抗0型FMDV陽性豚鼠血清及相應的陰性血清分別與Asial型和0型FMDV等體積混合，37°C水浴2h。用單抗3D9包被好的酶標板，37。C封閉lh後，依次加入上述阻斷樣品和未阻斷的樣品，4企測單抗，HRP標記的鏈黴親和素，底物顯色液，測定OD值。按照文獻阻斷率％=[(陰性血清阻斷OD值-陽性血清阻斷OD值)/(陰性血清阻斷OD值-空白OD值)]x100%;若阻斷率大於50%，則判定為陽性。表IO所示。表io特異性阻斷試驗口蹄疫病毒來源阻斷率％江蘇譜系78.56Asial新疆譜系68.15A型A型(疫苗林)58.34O型泛亞語系89.67東南亞譜系79.45中國型74.50同時，用建立的抗原捕獲ELISA方法對牛結核病、牛肺疫、牛流熱、赤羽病、牛傳染性鼻炎(牛傳鼻)等抗原進行;險測，設立標準FMDV陽性和陰性對照。結果表明，檢測樣品全為陰性，無交叉反應發生。3.抗原捕獲ELISA方法檢測FMDV細胞毒和組織毒53.1抗原捕獲ELISA方法檢測各個基因型FMDV細胞毒分別用Asial型、0型和A型FMDV各個基因型代表毒抹感染朋K-21細胞後獲取13份細胞毒，用抗原捕獲ELISA方法進行檢測，結果顯示13份細胞毒均為陽性，檢出率分別為100°/。。樣品順序依次為細胞對照、Asial標準細胞毒、0型標準細胞毒、Asial-1、Asial-2、Asial-3、10Asial-4、Asial-5、Asial-6、泛亞-1、泛亞-2、泛亞-3、東南亞、A型、中國型-1、中國型-2。結杲如表ll所示。表11抗原捕獲ELISA方法檢測各個基因型FMDV細胞毒反應結果樣品OD值OD值樣品OD值OD值陰性對照0.107660.10693Asial-60.669290.6735Asial0.770580.75137泛亞-11.450921.320260型1.433271.32598泛亞-21.352191.45247Asial-l0.913350.90147泛亞-30.257410.21494Asial-20.376420,35612東南亞0.811020.83157Asial-30.412560.40852A型(疫苗抹)0.452370.46307Asial-40.612560.62254中國型-l0.610550.63121Asial-50.779010.78924中國型-20.926410.912723.2抗原捕獲ELISA方法檢測各個基因型FMDV組織毒對本實驗室保存的13份FMDV組織病料,用抗原捕獲ELISA方法進行檢測，結果顯示13份細胞毒均為陽性，檢出率分別為73.3%。樣品順序依次為陰性對照、Asial標準乳鼠毒、0型標準乳鼠毒、Asial-l、Asial—2、Asial-3、Asial-4、Asial-5、Asial-6、；乏亞-1、；乏亞-2、；乏亞-3、東南亞、中國型-1、中國型-2、中國型-3。表12抗原捕獲ELISA方法檢測各個基因型FMDV組織毒反應結果樣品OD值OD值樣品OD值OD值陰性對照0.132090.12113Asial-60.127490.13159Asial0.756230.77973泛亞-11.012431.11145O型0.697210.71483泛亞-20.339760.32795Asial-l0.陽50.80571泛亞-30.357520.36688Asial-20.272510.26625東南亞0.503290.49783Asial-30.591620.57252中國型-10.066560.06742Asial-40.920460.91125中國型-20.146710.14896Asial-50.076290.07458中國型-30.538850.54331序列表-確定稿20090731.txt序列表中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所抗口蹄疫病毒血清型共享單克隆抗體及其識別的抗原表位<130〉KLPI056762Patentlnversion3.1<210〉16PRTFootandmouthdiseasevirus1GluThrThrXLeuGlu15212PRT<213〉Footandmouthdiseasevirus<400〉2LysLysThrGluGluThrThrLeuLeuGLuAspArg1510權利要求1、一株能分泌抗口蹄疫病毒的非血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系4B2，其微生物保藏號是CGMCCNo.3103。2、由權利要求1所述雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體。3、4又利要求2所述單克隆抗體所識別的口^帝疫病毒VP2蛋白N-末端的線性表位的基序，其特徵在於該線性表位的基序是由口蹄疫病毒的VP2蛋白N-末端上的氨基^列所組成，其#^*列為SEQIDN0:1所示，其中，X為任意一種胺基酸殘基。4、按照權利要求3所述的線性表位的基序，其特徵在於其關鍵性胺基酸殘基為Glu6、Thr7、Thr8、Leu"和Glu11;其中，決定性胺基酸殘基為Glu11。5、按照權利要求3或4所述的線性表位的基序，其特徵在於該表位序列為七個血清型FMDV共享，最佳活性單位是十二肽，其胺基酸序列為SEQIDNO:2所示。6、一抹能分泌抗FMDV非血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系3D9,其孩i生物保藏號是CGMCCNo.3104。7、由權利要求6所述雜交瘤細胞系所分泌的單克隆抗體。8、權利要求1或6所述的雜交瘤細胞系在製備診斷、預防或治療口蹄疫的試劑或藥物中的用途。9、權利要求2或7所述的單克隆抗體在製備診斷、預防或治療口蹄疫的試劑或藥物中的用途。10、權利要求3或4所述的線性表位的基序在製備診斷、預防或治療口蹄疫的試劑、疫苗或藥物中的用途。全文摘要本發明公開了抗口蹄疫病毒血清型共享單克隆抗體及識別的抗原表位和應用，屬於口蹄疫防制領域。本發明獲得兩株能分泌抗口蹄疫病毒的非血清型依賴性單克隆抗體的雜交瘤細胞系(其微生物保藏號分別是CGMCCNo.3103、CGMCCNo.3104)以及由該雜交瘤細胞系所分泌的單克隆抗體4B2和3D9。ELISA及間接免疫螢光檢測表明，兩株單克隆抗體均屬於FMDV共享性單克隆抗體；其中，4B2識別FMDV一個線性表位，3D9識別FMDV一個構象型表位。分別以3D9為捕獲抗體，4B2作為檢測抗體，採用抗原捕獲ELISA方法，可用於FMDV的特異性檢測，該檢測方法具有敏感性高、特異性強和重複性好的特點。文檔編號C12N5/20GK101643720SQ20091016134公開日2010年2月10日申請日期2009年7月31日優先權日2009年7月31日發明者力於,於永忠,周國輝申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所