一株發酵乳桿菌及其應用的製作方法

2023-07-14 00:05:06 4

專利名稱：一株發酵乳桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株發酵乳桿菌及其應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
飼料中添加抗生素能夠抵抗疾病，促進動物的生長，加快集約化畜牧業的發展。但是隨著人們生活水平的提高和對健康程度的不斷重視，抗生素添加劑在給人們帶來巨大的經濟利益的同時其負面效應逐漸顯現，最典型的特徵就是抗生素引起的耐藥性，內源性感染、二重感染以及食品中殘留，這些將對養殖業、飼料工業和動物帶來嚴重威脅，進而通過食物鏈危機人類健康。因此，禁止抗生素添加劑在畜牧業中使用的呼聲越來越高，研究和開發新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。近年來，益生菌因其安全、綠色無汙染且對動物生長具有顯著作用而被作為抗生素替代品的首要選擇。乳酸桿菌是益生菌中的主要菌種，它是動物消化道棲生微生物，在防治胃腸道感染、調節免疫功能和調節腸道的微生物菌群平衡中具有較好作用，如能夠促進仔豬增重、降低豬腸道的PH值、改善血液生化指標，增強消化道內酶活性及降低腸道大腸桿菌數等，使用乳酸桿菌益生素可以調整胃腸道微生態平衡，所以乳酸桿菌是一種很有前途的益生素生產菌種。美國FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品種共43種，其中乳酸桿菌佔12種，中華人民共和國農業部2011年公布允許使用的19種飼用微生物中有6 種是乳酸桿菌。在美國，益生素工業上應用的產品57%含有乳酸桿菌屬。大連醫學院康白等開發研製的乳酶生，是一種乳酸桿菌的乾燥製劑，保存期間穩定性好，每克產品含活乳酸桿菌約IO7個，仔豬每日口服3-4克可以有效治療腹瀉。乳酸桿菌除了能提高動物的生產性能以外，還能提高動物的抗病力，趙庶吏等 (2004)研究發現生物菌對致病性大腸桿菌有很強的抵抗作用，使仔豬下痢和發病率降低 87.4%，治療效果非常顯著。Peran等Q006)研究發現發酵乳桿菌通過釋放穀胱甘肽及調節細胞因子(如TNF-α)和誘導型一氧化氮合酶的表達，來防止鼠結腸炎的發生。乳酸菌類產品的開發利用已成為飼料工業一個活躍領域，但也存在一些亟待解決的問題如產品質量不穩定、活菌數量不夠、消化率低和成本高等。因此，培養繁殖力強、耐受能力強、產生較高消化酶的菌種以生產出產量高、質量穩定、在體溫範圍內具有較高活性的乳酸桿菌類產品，以提高其利用率，同時改進工藝、降低生產成本、提高產品的市場競爭力以及對於畜牧業的發展和人類的健康都非常有意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供一株發酵乳桿菌(LactcAaci llus fermentum) HAFI5007。本發明所提供的發酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 4648。該發酵乳桿菌具有抗逆性強、抗雜菌能力強和益生特性。
發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007具有以下生物學特性(1)在ρΗ2· 0處理6小時之後的存活率為78. 6% ；(2)在75°C水浴中加熱15min後的存活率為45. 5% ；
(3)室溫下放置1個月後的存活率為78. 9 % ；(4)接種在肉湯培養基於37°C，5% CO2的培養箱中培養M小時達到最高生長濃度為 IO11CfVml (圖 1)。本發明的另一個目的是提供一種發酵乳桿菌菌劑。該菌劑能夠替代現有的飼用抗生素，並具有抗病、促生長的作用。本發明所提供的發酵乳桿菌菌劑，其活性成分為發酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum)HAFI5007。所述菌劑具有下述至少一種用途1)清除動物自由基的產品；2)緩解動物氧化應激的產品；3)增強動物機體抗氧化能力的產品；4)製備調解動物腸內微生態平衡的產品；5)增強動物腸道黏膜屏障的產品；6)調節動物黏膜免疫功能的產品；7)促進動物生長的產品。上述發酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007或菌劑可用於製備大腸桿菌抑制劑。所述大腸桿菌抑制劑中的大腸桿菌具體可為大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、大腸桿菌 K987P。所述自由基為下述三種自由基中的至少一種輕基自由基、超氧陰離子自由基、1，
1-二苯基苦基苯胼自由基。所述緩解動物氧化應激體現為下述1)-3)中至少一種1)提高動物肌肉、肝臟和 /或血漿中抗氧化酶的活性；2)降低動物丙二醛的含量；幻增強動物抑制自由基產生的能力。所述增強動物腸道黏膜屏障體現為改善動物腸道菌群組成和/或促進動物腸道粘液蛋白的表達。所述調節動物黏膜免疫功能體現為下述1)-3)中至少一種1)增加動物外周血 T淋巴細胞⑶4+淋巴細胞亞群的比例；2)促進迴腸中TNF-α基因的表達；3)促進迴腸中 IFN-Y基因的表達。所述腸道粘液蛋白為MUC2。所述菌劑具體可由發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007和保護劑混合後，冷凍乾燥，製成發酵乳桿菌乾燥製劑，所述的保護劑為脫脂奶粉、麥芽糊精、稻殼粉、 麥麩中的一種或多種。本發明所述發酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) HAFI5007或所述菌可以作為添加劑用於動物飼料，其中的動物包括但不限於豬、羊、牛、雞等各種動物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。
本發明的發酵乳桿菌及其發酵乳桿菌菌劑主要作為動物的飼料添加劑，其可以替代現有動物日糧中的抗生素，調節動物腸內微生態平衡，清除體內的自由基，提高抗氧化能力，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、促進動物生長和提高飼料轉化率、提高斷奶仔豬的生產性能。本發明的發酵乳桿菌及其發酵乳桿菌菌劑對防治動物消化系統疾病起到保健作用，同時對幼年動物可刺激其胃腸道發育，所以將之作為飼料添加劑應用在飼料中能起到抗病促生長的作用。同時，本發明的發酵乳桿菌及其發酵乳桿菌菌劑無耐藥性和藥物在動物產品中殘留從而對人類的健康產生潛在的危害的可能，是一種有前途的綠色飼料添加劑。下面結合具體實施例詳細描述本發明，所述實施例用於理解而不是限制本發明。保藏說明菌種名稱發酵乳桿菌拉丁名Lactobacillus fermentum菌株編號HAFI5007保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期2011年3月11日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 4648


圖1為發酵乳桿菌生長曲線。圖2為平皿挖溝法測定乳酸桿菌培養物對大腸桿菌的抑制。圖3為發酵乳桿菌在過氧化氫存在時的存活能力。圖4為發酵乳桿菌對羥自由基的清除能力。圖5為發酵乳桿菌對超氧陰離子的清除能力。圖6為發酵乳桿菌對DPPH的清除能力。圖7為發酵乳桿菌對斷奶仔豬腸道粘液蛋白的影響(標尺200 μ m) (10X20)。ACE分別是對照組的十二指腸、空腸和迴腸，BDF分別是發酵乳桿菌組的十二指腸、空腸和迴腸，粘液蛋白(如深棕色顆粒或團塊)。圖8為發酵乳桿菌對斷奶仔豬腸道組織形態的影響(標尺200 μ m) (10X20)。ACE分別是對照組的十二指腸、空腸和迴腸，BDF分別是發酵乳桿菌組的十二指腸、空腸和迴腸。
具體實施例方式本發明的發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum) HAFI5007，可先接種於 Rogosa SL瓊脂的Himgates滾管培養基中進行培養，得到的種子培養物再接種於Rogosa SL肉湯厭氧培養基裡進行培養。其中所述的瓊脂培養基為適合發酵乳桿菌培養的任何培養基，本領域技術人員都
5知曉何種培養基適合發酵乳桿菌培養。然而可以優選為Rogosa SL瓊脂的Himgates滾管培養基，這裡所述的Rogosa SL瓊脂的Hungates滾管培養基理解為以在Rogosa SL完全選擇性培養基的基礎上，適當修改的適合發酵乳桿菌培養的培養基。所述適合發酵乳桿菌培養的培養基可以為現有技術任何適合發酵乳桿菌培養的培養基，這為本領域技術人員所知曉，但是仍可進一步優選培養基的配方為胰蛋白腖1 20g，牛肉膏1 20g，酵母浸粉1 15g，葡萄糖1 20g，阿拉伯糖1 15g，蔗糖1 15g，醋酸鈉5 25g，枸櫞酸鈉 1 10g，磷酸二氫鉀1 15g，七水硫酸鎂0. 1 1. 5g，四水硫酸錳0. 1 1. 5g，硫酸亞鐵 0. 01 0. IOg,吐溫-800. 1 2. OmL,瓊脂5 20g，蒸餾水100 2500mL ；優選為胰蛋白腖5 15g，牛肉膏5-15g，酵母浸粉3 10g，葡萄糖5 15g，阿拉伯糖3 10g，蔗糖3 10g，醋酸鈉10 20g，枸櫞酸鈉1 5g，磷酸二氫鉀1 10g，七水硫酸鎂0. 1 lg，四水硫酸錳0. 1 lg，硫酸亞鐵0. 01 0. 05g,吐溫-80 0. 5 1. 5mL,瓊脂10 15g，蒸餾水 500 2000mL ；更優選為胰蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g， 蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 ImL,瓊脂13g，蒸餾水IOOOmL0其中的液體培養基為適合發酵乳桿菌培養的任何培養基，本領域技術人員也知曉這種液體培養基，其中可優選肉湯厭氧培養基，這裡所述的肉湯厭氧培養基理解為在普通肉湯厭氧培養基的基礎上，適當修改的培養基，所述適當修改的培養基可以為現有技術任何適合發酵乳桿菌培養的培養基，這為本領域技術人員所知曉，優選Rogosa SL肉湯厭氧培養基，其中培養基的配方為胰蛋白腖5 15g，牛肉膏1 20g，酵母浸粉3 10g，葡萄糖5 15g，阿拉伯糖3 10g，蔗糖3 10g，醋酸鈉10 20g，枸櫞酸鈉1 5g，磷酸二氫鉀1 10g，七水硫酸鎂0. 1 lg，四水硫酸錳0. 1 lg，硫酸亞鐵0. 01 0. 05g,吐溫-800. 5 1. 5mL，蒸餾水500 2000mL ；更優選為胰蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母浸粉 5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂 0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 ImL,蒸餾水IOOOmL0應用上述培養基，本領域技術人員一般都知曉具體培養過程，這裡優選為上述 Rogosa SL瓊脂培養基的Hungates滾管中培養，優選在培養箱中，37°C下，培養15 72小時；其中的發酵乳桿菌擴大培養優選在Rogosa SL肉湯厭氧培養基中，37°C下培養15 80 小時。前面所述的保護劑為本領域技術人員通常使用的能夠作為發酵乳桿菌菌劑的保護劑，本發明優選所述載體為為脫脂奶粉、麥芽糊精、稻殼粉、麩皮的一種或多種，優選為脫脂奶粉，其發酵乳桿菌菌液與脫脂奶粉按照重量體積比1 8 0.1 2體積比混合，優選為3 5 0. 5 1。本發明含有發酵乳桿菌的動物飼料，其特徵在於，該發酵乳桿菌飼料在提高動物抗氧化和免疫力中的作用。所述動物為家禽和家畜。本發明的動物飼料包括常用動物飼料和本發明的發酵乳桿菌菌劑。其中發酵乳桿菌菌劑的含量至少為0. 001%，優選為0. 001 3%，更優選0.01% 2%，最優選 0.05% 0.2%。主要研究該配合飼料在提高動物抗氧化和免疫力中的作用。所述動物為家禽和家畜。本發明的發酵乳桿菌菌劑可以同目前市面上任何常用動物飼料進行配合，即本發明所述動物飼料保護範圍不為配合的常用動物飼料種類所限制。。
然而其中的常用動物飼料可優選為日糧，進一步優選為豬用日糧、雞用日糧、反芻動物用日糧和水產動物用日糧。對於不同的動物，其日糧的配方各不相同，但是，現有技術中公開的任何日糧都可以作為本發明的動物飼料，其配方都是該領域的公知常識。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例2 6中的發酵乳桿菌如無特殊說明，均指發酵乳桿菌 (Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No. 4648實施例1、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 的分離鑑定本發明的發酵乳桿菌是從豬胃腸道黏膜中提取、分離、篩選、純化得到的。(一 )發酵乳桿菌的分離與純化1. 1試驗材料取健康仔豬胃腸道黏膜5cm2(胃、十二指腸、空腸、迴腸、盲腸和結腸)，在滅菌杯中，用無菌生理鹽水衝洗黏膜上的食糜，將黏膜浸入裝有15mL HEPES緩衝液的燒杯中，用鑷子來回搖動黏膜5min後，得到上清液。1. 2培養基1.2.1 Rogosa SL 瓊脂的培養基胰蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉 15g，枸櫞酸鈉2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g,吐溫-80 lmL，瓊脂13g，蒸餾水lOOOmL，用醋酸調節pH至5. 0。1. 2. 2Rogosa SL肉湯厭氧培養基配方同1.2. 1，不添加瓊脂，蒸餾水IOOOmL,用醋酸調節pH至5.0。用新配製的 0. 忍天青溶液作氧指示劑，趁熱分裝入Himgates管，衝CO2至無色，迅速封口。121°C高壓蒸汽滅菌5min。1. 3菌株的分離培養用無菌注射器吸取0.2mL上清液注入裝有Rogosa SL瓊脂的Hungates滾管中，用手輕輕滾動使上清液均勻分布在管中瓊脂表面。放入5% CO2培養箱，37°C培養7 之後， 在生物安全櫃裡無菌操作將白色針尖大小的菌落用針頭挑取轉移到厭氧無菌Rogosa肉湯裡進行培養，觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4°C冰箱貯藏備用。1.4革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量Rogosa SL肉湯培養物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘乾固定。滴加結晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復染lmin， 水洗，待幹，在普通光學顯微鏡上觀察，菌體成紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態一致的桿菌，進一步進行接觸酶試驗。1. 5接觸酶試驗作Rogosa SL斜面培養基，取培養物約0.2mL注入裝有Rogosa SL培養基斜面，5% 0)2培養箱，37°C培養Mh，長出菌落後，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產生說明是陰性，若有氣泡產生說明是陽性。通過Rogosa SL厭氧培養的培養物經革蘭氏染色陽性和接觸酶試驗陰性可初步認為是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
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2結果與討論本試驗從健康仔豬胃腸道黏膜中利用經過鹽酸校正後Rogosa SL完全選擇性培養基篩選出5907株乳酸桿菌株。將仔豬胃腸道黏膜在HEPES緩衝液中搖動5min，用無菌注射器吸取0. 2mL上清液裝入含Rogosa SL瓊脂的滾管中培養Mh，再挑去白色菌落在厭氧無菌 RogosaSL肉湯裡進行培養。經過革蘭氏染色和接觸酶試驗，證明乳酸桿菌是健康仔豬胃腸道的優勢菌群，說明經鹽酸校正的Rogosa SL培養基適合分離胃腸道黏膜乳酸桿菌。菌種的篩選是及其煩瑣的過程。大多數乳酸菌的選育過程是從消化道上皮分離益生菌，這樣便可以獲得具有良好定植效果的菌種。( 二)發酵乳桿菌的抗逆性選育1. 1培養基1. 1. IRogosa SL 肉湯培養基同(一)中的1.2. 2。1.1.2厭氧斜面培養基同(一)中的1.2.1。1. 2耐酸性能選育製備含pH3. O和pH2. 5的Rogosa SL肉湯培養基，分別接種已培養Mh的胃乳酸桿菌和腸乳酸桿菌，接種量1 %，於37°C培養24h後觀察。如果培養基變的渾濁，說明該菌株耐酸。從接種開始和第他用無菌注射器取出ImL進行梯度稀釋至10_5後，取0.3mL稀釋液在MRS瓊脂(pH5. 2)上均勻塗布，平皿放置在37°C，5% 0)2培養箱中，培養Mh，計算存活率。然後鏡檢看是否染菌。能夠生長的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 3耐膽鹽性能選育製備含豬膽鹽0. 3 %的厭氧斜面培養基，接種已培養Mh的菌株，接種量1 %，於培養24h後觀察。如果培養基變的渾濁，說明該菌株耐膽鹽。然後鏡檢看是否染菌。能
夠生長的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 4耐高銅性能選育製備含有250mg/kg五水硫酸銅的肉湯厭氧培養基，接種已培養Mh的菌培養物， 接種量1%，於培養12 7 後觀察。如果培養基變的渾濁，說明該菌株耐高銅。然後鏡檢看是否染菌。能夠生長的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。1. 5耐高鋅性能選育製備含有氧化鋅的肉湯厭氧培養基，接種已培養24h的菌培養物，接種量1%， 於培養12 7 後觀察。如果培養基變的渾濁，說明該菌株耐高鋅。然後鏡檢看是否染菌。能夠生長的菌株的最初分離樣品保存在_80°C冰箱備用。2.結果與討論2. 1耐酸性能選育通過耐酸性能選育，有513株乳酸桿菌可以在pH2. 1的Rogosa SL培養基中生長繁殖，淘汰率為30%。這說明胃腸道的大多數乳酸桿菌耐酸性能較好，有70%可以在仔豬的胃腸道中進行繁殖。乳酸桿菌一般通過定植在消化道上皮發生益生特性。因此，如果菌種對胃酸沒有耐受性很難對動物的生產性能產生良好的作用。2. 2耐膽鹽性能選育
將通過耐酸性能選育的513株乳酸桿菌進行耐膽鹽性能選育，有103株乳酸桿菌可以在含膽鹽0.3^WR0g0sa SL培養基中生長繁殖，淘汰率為79.92%。研究表明，膽鹽是腸乳酸桿菌在動物胃腸道內遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer (1999)研究發現用膽鹽選擇性馴化乳酸桿菌對膽鹽的耐受力是有效的，經過幾代膽鹽馴化之後得到的乳酸桿菌耐膽鹽的能力比親代乳酸桿菌強，乳酸桿菌容易對膽鹽性能產生耐受性，且具有一定的遺傳性，選育出耐膽鹽的發酵乳桿菌在生產中具有重要的意義。2. 3耐高銅性能選育將通過耐膽鹽性能選育的103株乳酸桿菌進行耐高銅性能選育，有87株乳酸桿菌可以在含250mg/kg五水硫酸銅的Rogosa SL培養基中生長繁殖，淘汰率為15. 53%。證明該乳酸桿菌具有較強的耐高銅特性。由於高銅日糧具有促生長的作用，是目前我國比較普遍使用的日糧，因此選擇具有耐高銅的發酵乳桿菌是極其必要的。2. 4耐高鋅性能選育將通過耐高銅性能選育的87株乳酸桿菌進行耐高鋅性能選育，有76株乳酸桿菌可以在含氧化鋅的Rogosa SL培養基中生長繁殖，淘汰率為12.64%。高鋅具有防止腹瀉、促進生長的作用，因此在我國利用氧化鋅來配製仔豬飼料，尤其是生產斷奶仔豬飼料的廠家很多。因此選育出耐高鋅的發酵乳桿菌也是必要的。3 小結通過本試驗獲得76株來源於仔豬胃腸道黏膜，對消化道內環境有一定抵抗能力的乳酸桿菌菌株，這為以後的選種工作打下了基礎。(三)發酵乳桿菌的益生特性選育1. 1發酵乳桿菌代謝產物抑制大腸桿菌能力的選育大腸桿菌(K88、K99和987P)購自中國獸藥監察所。Κ88在中國醫學細菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44742，K99在中國醫學細菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44820， 987P在中國醫學細菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44317。乳酸桿菌76株耐酸、耐膽鹽、耐高銅、耐高鋅的腸乳酸桿菌。培養基麥康凱(MacConkay)培養基(購自北京天壇生物製品般份有限公司)。在Hungates管裡加MRS肉湯(蛋白腖，IOg ；牛肉浸膏，IOg ；酵母浸粉，5g ；磷酸氫二鉀，2g ；枸椽酸二銨，2g ；葡萄糖，20g ；七水硫酸鎂，0. 58g ；四水硫酸錳，0. 25g ；醋酸鈉， 5g ；蒸餾水，IOOOmL)約15mL，充二氧化碳，製成無菌厭氧MRS肉湯。每個管中分別接種從健康仔豬胃腸道分離到的76株抗逆性強的腸乳酸桿菌，乳酸桿菌經1 培養後按接種於肉湯中，在37°C培養箱裡培養24h後，置4°C冰箱保存備用。抑制大腸桿菌試驗製作麥康凱培養基，加熱溶解後在121°C高壓滅菌15min後， 無菌傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域，每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌培養液G.0X108CFU/mL)於培養基表面，然後在距平皿中線約3cm的地方挖一寬為0. 5cm的溝，溝與接種劃線垂直，用熱接種棒補底，如圖2所示。分別用不同的乳酸桿菌培養物將溝填滿(不能溢出)，置普通培養箱37°C培養1 後，觀察出現大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離。每個乳酸桿菌作兩個平行樣，以平均值表示結果。1. 2乳酸桿菌與大腸桿菌混合培養抑制作用選育
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大腸桿菌(K88、K99和987Ρ)來源與1. 1節同。乳酸桿菌16株腸代謝產物對大腸桿菌具有較強抑制作用的乳酸桿菌。大腸桿菌的檢測培養基麥康凱(MacConkay)培養基與1. 1節同。乳酸桿菌接種於厭氧無菌MRS肉湯中，37°C培養24h後，置4°C冰箱保存備用。1. 2. 1不同濃度乳酸桿菌對大腸桿菌的抑制隨機選擇一株乳酸桿菌，取5mL培養物(8. 2X109CFU/mL)分別與5、10、15mL營養肉湯混合，製成3個含不同乳酸桿菌培養物濃度的營養肉湯，接種大腸桿菌，接種量為培養液的5%，置37°C，5% CO2培養箱培養4、8和1 後，分別用無菌注射器取出培養液，培養液經梯度稀釋成10_2 10_5後，每個稀釋度作4個平行樣，取0. 3mL稀釋液，用「L」棒均勻塗布於麥康凱瓊脂平板上，置於37°C，普通培養箱培養18h，取菌落數在50 150個的平皿計數，以平均值表示結果，計算每毫升培養液中大腸桿菌的數量。1. 2. 2含1/4乳酸桿菌的營養肉湯中乳酸桿菌與大腸桿菌的數量關係取5mL乳酸桿菌培養物(108CFU/mL)與15mL營養肉湯混合，接種24h大腸桿菌培養物，接種量為培養液的10% (107CFU/mL)，起始混合液中乳酸桿菌的數量為大腸桿菌的10 倍，用0. IN NaOH溶液調節培養液的pH為7.0，置37°C培養箱培養24h後，分別用無菌注射器取出培養液，培養液經梯度稀釋至10_5，ΙΟ"6,10_7後，取0. 3mL稀釋液用「L」棒均勻塗布於 MRS瓊脂培養基上，每個梯度的培養液作3個平行樣，MRS瓊脂培養基(pH5.4)置37°C、5% CO2培養箱培養18h，取菌落數在50 150個的平皿計數，以平均值表示乳酸桿菌的數量，計算每毫升培養液中乳酸桿菌的數量。培養24h後直接用無菌注射器取ImL培養液經梯度稀釋至10_2後，取0. :3mL稀釋液置於麥康凱瓊脂上，用「L」棒均勻塗布，每個管做3個平行樣， 將平板置於37°C，普通培養箱培養18h，計算每個平板的大腸桿菌菌落數，以平均值表示結^ ο2結果與討論2. 1乳酸桿菌代謝產物抑制大腸桿菌的選育乳酸桿菌代謝產物抑制大腸桿菌的效果以離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離為指標，距離越大，說明抑菌效果越好。本試驗所採用的平皿挖溝法是對經典的平皿挖孔法的改進，基本原理是放置在溝中的抗菌物質能滲透過瓊脂來抑制大腸桿菌，隨著離溝距離的增大，能滲透過去的抗菌物質的濃度就越小。大腸桿菌菌落與小溝的距離越大，說明乳酸桿菌代謝產物所含抗菌物質的抑菌能力越強。用平皿挖溝法在同一平皿可以同時測定乳酸桿菌代謝產物對3株大腸桿菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能測定對一株大腸桿菌的抑制作用。16株腸乳酸桿菌的抑菌距離在0. 7 3. Icm之間，進一步研究它們與大腸桿菌混合培養的數量關係。2. 2乳酸桿菌與大腸桿菌體外培養的數量關係2. 2. 1不同比例乳酸桿菌培養物與大腸桿菌在混合培養條件下的數量關係結果見表1。表1營養肉湯中含不同比例乳酸桿菌培養液對大腸桿菌的抑制作用(單位CFU/ mL)
權利要求
1.發酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 4648。
2.一種發酵乳桿菌菌劑，其特徵在於所述菌劑的活性成分為權利要求1所述的發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007。
3.權利要求1所述的發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)HAFI5007或權利要求2 所述的菌劑在製備下述任一產品中的應用1)清除動物自由基的產品；2)緩解動物氧化應激的產品；3)增強動物機體抗氧化能力的產品；4)製備調解動物腸內微生態平衡的產品；5)增強動物腸道黏膜屏障的產品；6)調節動物黏膜免疫功能的產品；7)促進動物生長的產品。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述自由基為下述三種自由基中的至少一種輕基自由基、超氧陰離子自由基和1，I" 二苯基苦基苯胼自由基；所述緩解動物氧化應激體現為下述1)-3)中至少一種1)提高動物肌肉、肝臟和/或血漿中抗氧化酶的活性；2)降低動物丙二醛的含量；幻增強動物抑制自由基產生的能力；所述增強動物腸道黏膜屏障體現為改善動物腸道菌群組成和/或促進動物腸道粘液蛋白的表達；所述調節動物黏膜免疫功能體現為下述1)-3)中至少一種1)增加動物外周血T淋巴細胞⑶4+淋巴細胞亞群的比例；2)促進迴腸中TNF-α基因的表達；3)促進迴腸中IFN-γ 基因的表達。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述腸道粘液蛋白為MUC2。
6.根據權利要求3-5中任一所述的應用，其特徵在於所述動物為豬。
7.含有權利要求1所述發酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007或權利要求 2所述菌劑的動物飼料。
8.權利要求1所述發酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum) HAFI5007或權利要求2所述菌劑在製備大腸桿菌抑制劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述大腸桿菌抑制劑中的大腸桿菌為大腸桿菌K88、大腸桿菌K99或大腸桿菌987P。
全文摘要
本發明公開了一株發酵乳桿菌及其應用。該發酵乳桿菌為Lactobacillus fermentumHAFI5007，2011年3月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號CGMCC No.4648。本發明的發酵乳桿菌主要作為動物的飼料添加劑，提高豬營養物質消化率，改善胃腸道微生物菌系組成、腸道粘液蛋白表達以及腸道黏膜免疫功能，改善機體的抗氧化防禦系統，緩解氧化應激造成的氧化損傷，改善提高豬的生產性能。
文檔編號A61P31/04GK102226157SQ20111011657
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月6日 優先權日2011年5月6日
發明者丁修良, 宋青龍, 張海燕, 譙仕彥 申請人:北京龍科方舟生物工程技術中心