採用高溫冷凍法低溫保藏生物活性物質的製作方法
2023-07-29 18:58:01
專利名稱：採用高溫冷凍法低溫保藏生物活性物質的製作方法
技術領域：
本發明總的涉及低溫保藏，更具體地說，本發明涉及採用玻璃化技術低溫保藏生物活性物質。
背景技術：
低溫保藏(低溫保存)可以定義為為了保藏和再次恢復到其冷凍前活著的狀態，將活的結構和生化分子的溫度降低到冷凍點以下。18世紀進行的犬精液試驗首次證明，單細胞可被冷凍，並在之後解凍，有小百分比的細胞恢復了正常的生理功能。後來，在20世紀，人們發現如果在化學製備這些細胞時，在冷凍過程中使用總稱為低溫防凍劑的化合物使這些細胞能經受得住，則細胞的恢復率提高。但是，即使使用低溫防護劑，由低溫保藏狀態恢復到正常狀態的恢復率也常常為50％或以下。
迄今為止，提高低溫保藏的恢復率的嘗試一般都集中於冷凍前處理生物材料的新低溫防凍劑和非常慢或快的冷凍技術。這兩種技術一般都是針對減少冷凍過程中冰晶的形成所致的細胞內水膨脹而導致的細胞損傷。理論上，非常慢或快的冷凍將減少或消除細胞內冰晶的形成。非常慢速率的冷凍的機制包括從氮蒸氣到液氮的受控下降，或者使樣品先通過非常冷的醇化合物，繼而投入液氮中。在冷凍過程中，這種方式的冷凍不使冰晶尺寸進一步生長，但仍有冰晶形成。
另一種技術，常稱為玻璃化作用，是直接將樣品投入液氮中，試圖將細胞內的水快速冷凍，從而抑制冰晶的形成。玻璃化作用將細胞的溫度快速地從室溫降到液氮的溫度-196℃。在如此短的時間內，溫度的這種極大落差常常導致細胞膜內的應力破壞。低溫防凍劑與玻璃化作用和其它各種冷凍技術一道使用。
發明概要因此，需要一種改進的方法來低溫保藏能生存的單細胞、組織、器官、核酸或其它生物活性分子，該方法至少能避免目前採用的方法中所固有的一些問題。因此，本發明的至少一個實施例提供一種低溫保藏的方法，該方法包括將生物活性材料浸入冷卻液中，並使該冷卻液環流通過該材料。材料在浸入之前可先進行化學處理，也可不進行化學處理，取決於所要低溫保藏的材料類型。冷卻液以基本上恆定的預定速率和溫度環流通過材料，將其冷凍，這樣材料被玻璃化，並且減少細胞膜中形成的應力破壞。在至少一個實施例中，冷卻液被維持在約-20℃到-30℃之間的溫度，冷卻液流過材料的速率大約為35升/分鐘/英尺冷凍液體，該冷卻液通過不大於約24英寸(寬)×48英寸(深)的面積。此外，本發明至少一個實施例直接將材料冷凍到約-30℃以下。本發明又一實施例提供一種已進行這種低溫保藏處理的生物材料。
本發明至少一個實施例的目的是以避免形成冰晶和應力破壞的方式冷凍生物材料。
本發明至少一個實施例的一個優點是低溫保藏恢復率明顯增加，因為生物材料在冷凍期間被玻璃化。
本發明至少一個實施例的另一優點是低溫保藏恢復率提高，因為生物材料在足夠高的溫度下玻璃化，避免了細胞膜內形成應力破壞。
本發明至少一個實施例的另一優點是一旦被冷凍，目前的低溫保藏設備和機制可用於保存該冷凍的生物材料。
附圖的簡要說明在結合附圖考慮以下描述和權利要求之後，將能理解本發明的其它目的、優點、特徵和特性，和相關結構要素的方法、操作和功能，以及製造零件和經濟學的組合，所有這些都是本說明書的一部分，其中，相同的參考數值在各圖中表示相應的部件
圖1是適用於實施本發明至少一個實施例的方法的冷卻裝置的側視圖。
圖2是圖1中的冷卻裝置的橫截面的側視圖。
圖3是闡述本發明至少一個實施例的方法的流程圖。
圖4是顯示採用各種常規的冷凍器(並不是所有的冷凍器都用於低溫保藏和儲存)和本發明優選實施例的冷凍方法對全無核葡萄的橫截面進行無化學製劑冷凍所得的細胞損傷的試驗比較結果的柱形圖。
圖5是顯示現有的冷凍方法和本發明優選實施例的冷凍方法在將人的精子解凍後細胞存活和功能的試驗比較結果的柱形圖。
圖6是顯示現有的冷凍方法和本發明優選實施例的冷凍方法在將豬的肌肉細胞解凍後細胞存活和功能的試驗比較結果的柱形圖。
圖7是顯示現有的冷凍方法和本發明優選實施例的冷凍方法在將小鼠胚胎解凍後細胞存活和功能的試驗比較結果的柱形圖。
本發明優選實施例的詳細描述首先結合圖1和2討論適用於實施本發明至少一個實施例的一種冷卻裝置，通常將其稱為冷卻系統100。冷卻系統100較佳包括裝有冷卻液140的容器110。浸沒在冷卻液140中的是循環器134，如具有推進器132的馬達130、熱交換線圈120和支架150，該支架150在一個實施例中包括用於支持生物材料冷凍的託盤155。生物材料可包括但不限於能存活的單細胞、組織和器官、核酸和其它生物活性分子。在容器110之外與熱交換線圈120相連的是致冷器190。
容器110可以是將要冷凍的生物材料浸入冷卻液140中所需的任何尺寸，該冷卻液的體積為12英寸×24英寸×48英寸。根據本文所述的內容，也可以使用其它尺寸的容器。例如，在一個實施例中(未闡述)，容器110的大小為剛好容納足夠的冷卻液140，這樣，諸如小瓶、試管、燒杯、量筒等之類的容器就可以放在容器110中，用於快速冷凍含有生物材料和低溫防凍劑的懸浮液。在其它實施例中，容器110大到足以將整個器官或有生物體完整地浸入，以進行快速冷凍。將可理解，容器110可製成較大的，或者製成較小的，這要根據有效適應要冷凍的生物材料的各種尺寸和數量的需要而定。
容器1 10中裝有冷卻液140。在一個實施例中，該冷卻液是食物級溶質。食物級質量液體的好例子是基於丙二醇、氯化鈉等的那些液體。在另一實施例中，冷卻液本身就是低溫防凍劑，如二甲基亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等。注意到在一些例子中，低溫防凍劑本身就是好的食物級質量液體。在其它實施例中，用其它液體作為冷卻液，優選溶質。雖然可使用各種容器來裝生物材料，但是本發明的一些實施例直接將生物材料浸入冷卻液中進行快速和有效的冷凍。這種直接浸入的方法可簡化一些組織和器官的低溫保藏。
為了在冷凍生物材料的同時避免冰晶的形成，本發明的一個實施例以不超過24英寸寬×48英寸深的面積中含有的每英尺冷卻液每分鐘35升的相對恆定速率將冷卻液140環流通過要冷凍的生物材料。必需的環流由一個或多個循環器134(如馬達130)提供。在本發明的至少一個實施例中，浸沒的馬達130驅動推進器132，將冷卻液140環流通過要冷凍的生物材料。也可使用與本發明目的一致的其它的循環器134，包括各種泵(未闡述)。在本發明的至少一個例子中，使用除了馬達130以外的至少一個循環器134來增加環流的冷卻液的面積和體積。在使用多個循環器134的實施例中，冷卻液環流的面積和體積與所使用的各個附加的循環器成正比。例如，在一個優選的實施例中，使用一個附加的循環器來推進各英尺要環流的冷卻液通過不超過約24英寸寬×48英寸深的面積。
較佳的是，可控制馬達130，以維持冷卻液以恆定的預定速率流過要保藏的生物材料，而同時維持容器110內所有的點上的冷卻液溫度平均分布在+/-0.5℃之內。冷卻液以基本上恆定的預定速率環流過生物材料，這樣可恆定地、準確地移走熱量，從而使生物材料在冷凍期間玻璃化。在一個實施例中，測量和處理冷卻液的特性如粘度、溫度等，然後將控制信號傳送給馬達130，以根據需要增加或減少推進器的旋轉速率或扭矩。在其它實施例中，將馬達130設為在一定範圍的液體條件中維持在給定的旋轉速率。在這個例子中，由馬達130賦予的推進器132的扭矩或旋轉速率不是由外部控制的。要注意的是，不需要外部的泵、軸或滑輪來實施本發明的優選實施例。將馬達130或者其它循環器134直接浸入冷卻液140中。結果是，冷卻液140不僅將置於容器110中的生物材料冷凍，而且還使馬達130冷卻。
熱交換線圈120較佳是「多通路線圈」，它使致冷劑通過多個通路(即三個或多個通路)輸送，這與常規的致冷線圈不同，在常規的致冷線圈中其致冷劑被限制在一個或兩個連續的通路中。此外，線圈的大小直接與含有準確量的冷卻液140的橫截面面積相關。例如，在優選的實施例中，容器110長1英尺、深2英尺、寬4英尺，而所使用的熱交換線圈120是1英尺×2英尺。如果容器110的長度增加到20英尺，則熱交換線圈也增加到20英尺。結果，可將熱交換線圈120製成為處理相同的熱量負荷所需的常規線圈的大約50％尺寸。循環器134(如馬達130)將冰冷的冷卻液140循環通過要冷凍的生物材料，然後將較溫的冷卻液轉運到浸沒在該冷卻液140中的熱交換線圈120。在至少一個實施例中，如此設計熱交換線圈120，以將不少於與被冷凍的生物材料釋放的熱量相同的熱量從冷卻液140中除去，從而將冷卻液140的溫度維持在預定的範圍。熱交換線圈120與致冷器190連接，該致冷器從熱交換線圈120和系統中除去熱量。
在一個優選的實施例中，設計致冷器190用於匹配熱交換線圈120的負荷需求，以便以平衡和有效的方式從系統中除去熱量，獲得受控、快速冷凍的材料。致冷器190的效率與用於通過熱交換線圈120的有效供給和該單元中使用的壓縮機的有效輸出控制吸入壓力的方法直接相關。
這種方法要求致冷劑和冷卻液140的溫度以及冷凝溫度和環境溫度之間維持在非常接近的公差範圍之內。這些溫度標準和熱交換線圈120的設計都使熱交換線圈120得以更有效地供給，這反過來又使壓縮機以平衡和緊緊控制的方式得到供給，從而使壓縮機的性能超出製造商指定的標準等級的25％以上。
注意到在圖1闡述的實施例中，致冷器190處於外部，遙控放置的冷卻系統。但是，在另一實施例中(未闡述)，致冷器190被加到容器110的另一部分中。應理解，致冷器190的各種構型對於冷卻系統100的某些構型或多或少是合適的。例如，如果容器110非常大，可能需要一種分離的致冷器190，而可移動的實施例可能受益於整合的致冷器190。這種整合僅僅在通過執行上述原則而獲得功效的情況下才是可能的，尤其是使用尺寸減小了的熱交換線圈。
在一個優選的實施例中，藉助於致冷器190和熱交換線圈120，冷卻液被冷卻至-20℃到-30℃之間，整個冷卻液的溫度差別小於約+/-0.5℃。在其它實施例中，冷卻液被冷卻到-20℃到-30℃的溫度範圍之外，以控制將物質冷凍的速率。其它實施例控制冷卻液的環流速率，以獲得所需的冷凍速率。或者，為了促進特殊的冷凍速率，可改變冷卻液的體積。應理解，冷卻液循環速率、冷卻液體積和冷卻液溫度的各種組合都可用於實現所需的冷凍速率。
現在結合圖2討論適合用於冷凍量較大的生物材料的冷卻系統100。圖2中與圖1中相同、相似或同樣的參考數值表示相同、相似或同樣的特徵。容器110含有冷卻液140，支架150可在該液體中降低。支架150可移動地連接於支架支持物210，這樣支架150可升可降，有利於物質將物質放到容器110中。
在使用時，要冷凍的生物材料放在支架150的託盤155上。較佳的是，託盤155是線狀的、網篩或者其它形式，以使冷卻液140可自由地循環通過放置於其上的物品的下面和/或四周。較佳的是，一旦冷卻液被冷卻到所需的溫度，就使用支架支持物210將支架150下降進入容器110中，以將託盤155浸沒在冷卻液140中。可人工或使用本領域熟練的技術人員已知的各種齒輪、鏈條和/或滑輪構型使支架150下降。循環器134將冷卻液140循環通過放置於託盤155中的物質，以產生快速和受控的冷凍。應理解，可採用其它的方式將生物材料浸入容器110中，採用自動升降系統在所有的情況中不一定是最佳的。
現在結合圖3闡述本發明一個實施例的方法，一般將其指定為參考數值300。所闡述的方法從步驟310開始，在那裡冷卻液循環通過一個熱交換線圈。該熱交換線圈可操作性地與上述致冷系統相連，用於減少冷卻液循環通過熱交換線圈時的溫度。在步驟320中，冷卻液的溫度被測量，步驟330則測定冷卻液的溫度是否在最佳的溫度範圍之內。這個最佳的冷卻液溫度範圍對於不同的應用可以不同，但是，對於許多應用，優選的最佳溫度範圍為-20℃到-30℃。
如果測得冷卻液的溫度不在最佳的預定溫度範圍之內，則進行步驟335。在步驟335中，熱交換線圈被致冷器冷卻，此方法回到步驟310，在該步驟中，冷卻液被循環通過熱交換線圈，以降低其溫度。較佳的是，連續執行步驟310、320、330和335，直到冷卻液的溫度達到最佳的溫度範圍。
用於冷凍生物材料的冷卻液的溫度是本發明至少一個實施例的重要要素。為了使用常規的方法獲得玻璃化效果，通常用液氮使生物材料驟冷，達到-196℃的溫度。在非常短的時間內如此急劇的溫度變化使細胞結構內的水非常快地冷凍，以至於這些水沒有機會形成冰晶。但是，採用在液氮中驟冷的方法冷凍生物材料可能導致細胞膜內的應力破壞，從而限制了在液氮中驟冷的方法在低溫保藏中的應用。由於在本發明的優選實施例中採用的溫度範圍是-20℃到-30℃，所以由溫度變化引起的應力破壞減少到最小程度，可實現玻璃化而對細胞膜的損傷少得多。
在冷卻液被冷卻至適當的溫度時，在步驟305中製備要冷凍的生物材料。如早些時候所述，生物材料包括但不限於可存活的單細胞、組織和器官、核酸和其它生物活性分子。適當時，在冷凍前先對材料進行化學處理。化學處理生物材料可包括用增加細胞存活的製劑(穩定劑)除去細胞生長或死亡過程中分泌的有害物質而對其進行的預處理。有用的穩定劑包括本領域熟練的技術人員已知的那些化學品和化學化合物，這類化合物以高度反應性螯合併破壞諸如氧自由基之類的分子。
化學處理的生物材料還可包括適應步驟(未闡述)。在預處理期間或之後的某個時間，使要保藏的生物材料適應低於培養溫度但仍高於冷凍溫度的溫度。這可通過延遲細胞代謝和減少快速的溫度變化的衝擊而有助於製備用於要低溫保藏過程的生物材料。但是，應很好地注意，為了實施本發明，適應步驟不總是需要的。
在一個優選的實施例中，用於冷凍的化學製備的生物材料包括在生物材料中加入低溫防凍劑。加料通常涉及生物材料在一種或多種低溫防凍劑中的平衡。可將在加料期間使用的物質稱為填充劑。有用的填充劑包括一種或多種脫水劑、滲透劑(permeating agent)或非滲透劑以及滲透劑(osmotic agent)。可使用滲透劑如DMSO和乙二醇，和滲透劑與非滲透性滲透劑如果糖、蔗糖或山梨糖、甘露糖或甘油的組合。應理解，在滿足本發明的目的的情況下，可使用其它合適的低溫防凍劑。
在冷卻液達到正確的溫度後，進行步驟315，將化學製備的生物材料浸入冷卻液中。如先前所述，可將生物材料裝在一個容器中，或者直接放在該冷卻液中，然後進行該方法的步驟337，使用如浸沒的馬達/推進器裝置或泵以先前所討論的速率將冷卻液環流通過浸入的生物材料。隨著冷卻液流過生物材料，其溫度比冷卻液的溫度高的生物材料中的熱量被去除，這些熱量被轉移到用來去除生物材料的熱量的冷凍液體中。根據本發明的至少一個實施例，為了以玻璃化的方式冷凍所製備的生物材料，應維持冷卻液以基本上恆定的環流通過要冷凍的生物材料。
在冷卻液環流通過要冷凍的生物材料之後進行步驟339。步驟339根據需要調整冷卻液的速率，以適應冷卻液的粘度、溫度等的變化。較佳的是，通過調整一個或多個循環器提供的力使冷卻液的速率維持恆定。
圖3中闡述的步驟按順序進行了顯示和討論。但是，所闡述的方法中的一些或全部步驟都連續進行，也可以以不同的順序進行。例如，本發明至少一個實施例使用單個循環馬達使冷卻液循環。在這個實施例中，冷卻液與步驟310一樣，被循環通過熱交換線圈，同時也與步驟337一樣循環通過要保藏的生物材料。此外，本發明的一個實施例連續測量冷卻液的溫度、粘度和其它液體特徵，並在系統內的多個位點中測量。
在又一實施例中，沒有直接測量冷卻液的一些特性。而是由循環馬達的旋轉速度間接測定了冷卻液特性的變化。如果馬達以較低速率運轉，則可給馬達提供附加的動力，以使其轉到所需的旋轉速度，從而彌補冷卻液特性的改變。在至少一個實施例中，馬達被設置成維持基本上恆定的旋轉速率。馬達的這個基本上恆定的旋轉速率將產生基本上恆定的冷卻液循環速率。
進行了本發明一個實施例的一個測試，其中，在分度容器中冷凍5ml的水。在冷凍後，總體積有小於1％的增加，比採用常規的冷凍所預期的體積要小得多。在另一測試中，在常規的冷凍機中和在本發明優選方法的冷卻系統中將冰冷凍成層狀。在冷凍後，在暗視野顯微鏡下檢測冰。如所預期的，常規的冰顯示出晶體模型，而根據本發明的原理冷凍的冰沒有光移位，這表明有少量到沒有冰晶形成。
現在結合圖4闡述在採用許多冷凍方法冷凍未處理的植物組織(全無籽葡萄)後，細胞損傷的實驗結果比較。柱形圖400以對照組A為基準，比較了採用被方法B、C、D和E損傷的單個細胞的數量。方法A中是新鮮的、從未冷凍過的對照，方法B使用常規的冷凍機冷凍到-20℃，方法C使用超低溫冰箱將細胞冷凍到-80℃，方法D使用液氮將細胞冷凍到-196℃，方法E使用本發明的優選實施例將細胞冷凍到-25℃。
其結果顯示在柱形圖400中的試驗使用未製備的、無低溫防凍劑處理的植物組織獲得的數據。圖4中所闡述的結果清楚顯示了本發明優選實施例的方法的優越性。對照(方法A)中檢測到的細胞，沒有一個顯示出任何損傷，因此，其它方法中的損傷只是冷凍方法引起的。根據該測試，使用方法B(常規冷凍)冷凍的細胞，在解凍後有40％受到損傷，方法C(超低溫冰箱)則約有50％的損傷，方法D(液氮)則有約60％的損傷。明顯地，採用方法E(本發明優選的實施例)冷凍的細胞在解凍後僅有20％的細胞受到損傷。注意到損傷是通過在放大鏡檢測植物細胞壁評估的。
現在結合圖5，比較採用現有的冷凍方法和本發明優選實施例的冷凍方法冷凍化學處理的人精子細胞後細胞存活(存活)和細胞功能(測定為細胞活動性)的試驗結果。採用工業標準技術對兩種方法中使用的細胞進行化學處理，以用於冷凍。柱形圖500比較了採用兩種方法冷凍後細胞的存活和活動性。方法A採用在氮霧中懸浮細胞30分鐘，然後將細胞投入液氮中的常規方法。方法B採用本發明的優選實施例將細胞冷凍到-25℃。
其結果顯示在柱形圖500中的試驗使用化學處理的人精子。由柱形圖500闡述的結果清楚顯示本發明優選實施例的方法的優越性。根據該測試，採用方法A(常規方法)冷凍的細胞僅有40％在解凍後維持存活，且僅有約20％的細胞維持活動性。但是，採用方法B冷凍的細胞有75％在解凍後是存活的，且大約有45％仍能活動。注意到在解凍後採用活-死染色法評估細胞的存活，通過在放大鏡下直接觀察細胞而測定活動性。
現在結合圖6，比較採用現有的冷凍方法和本發明優選實施例的冷凍方法冷凍化學處理的豬肌肉細胞後細胞生存(存活)的試驗結果。使用兩個濃度的低溫防凍劑對用於兩種方法的細胞進行化學處理，以用於冷凍。柱形圖600比較採用各種方法冷凍後細胞的存活。方法A使用濃度為10％的低溫防凍劑，採用直接將細胞投入液氮中的常規方法；方法B使用濃度為1％的低溫防凍劑，採用直接將細胞投入液氮中的常規方法；方法C使用濃度為10％的低溫防凍劑，採用將細胞冷凍到-25℃的本發明優選實施例的方法；方法D使用濃度為1％的低溫防凍劑，採用將細胞冷凍到-25℃的本發明優選實施例的方法。
其結果顯示在柱形圖600中的試驗使用化學處理的豬肌肉細胞。如圖6所闡述的試驗結果清楚顯示了本發明優選實施例的方法的優越性。根據該測試，採用方法A(常規的方法+10％低溫防凍劑)或B(常規方法+1％防凍劑)冷凍的細胞在解凍後有約40％維持存活。但是，採用方法C(本發明的優選實施例+10％低溫防凍劑)或D(本發明優選的實施例+1％防凍劑)冷凍的細胞在解凍後有80％以上細胞存活。注意到細胞的存活是在解凍後採用活-死染色法評估的。
現在結合圖7，比較採用現有的冷凍方法和本發明優選實施例的冷凍方法冷凍化學處理的小鼠胚胎後細胞生存(存活)的試驗結果。採用工業標準技術對兩種方法中使用的細胞進行化學處理，以用於冷凍。柱形圖700比較了採用兩種方法冷凍後胚胎的存活。方法A採用在氮霧中控制冷凍速率的常規方法，然後將細胞投入液氮中的常規方法。方法B採用本發明的優選實施例將細胞冷凍到-25℃，然後投入到液氮中。
其結果顯示在柱形圖700中的試驗使用化學處理的豬胚胎的數據。圖7闡述的結果清楚顯示本發明優選實施例的方法的優越性。根據該測試，採用方法A(常規的方法)冷凍的胚胎僅有約50％在解凍後維持存活。但是，採用方法B冷凍的胚胎有90％以上在解凍後是存活的。注意到在冷凍後採用活-死染色法評估胚胎的存活。
因為本發明可以玻璃化的方式冷凍生物材料，並且細胞膜中應力破壞的形成減少到最小程度，所以本發明的各種實施例可應用於如皮膚移植、角膜保存、循環血管保存、移植組織的冷凍、不育治療以及分子退化疾病(癌症)的研究的醫學領域中。或者，本發明可用於家畜工業的精液、卵母細胞和胚胎的低溫保藏。
在前面的詳細描述中，已結合作為本發明的一部分的附圖進行了描述，這些附圖是以實施本發明的闡述性特殊實施例的方式顯示的。這些實施例已描述得足夠詳細，以使本領域的熟練技術人員能實施本發明，並且應理解，在不偏離本發明的精神和範圍的情況下可使用其它的實施例，以及可作出合理的、機械的、化學和電方面的改變。為了避免本領域熟練的技術人員實施本發明時不必需的細節，本說明書省略了某些對本領域熟練的技術人員來說是已知的信息。因此，前述詳細的說明書不應認為是限制性的，本發明的範圍僅由附加的權利要求來限定。
權利要求
1.一種低溫保藏法，它包括將生物活性材料浸入冷卻液中；和以基本上恆定的預定速率和溫度使所述冷卻液環流通過所述生物活性材料，以冷凍該生物活性材料，使其玻璃化，並將細胞膜中應力破壞的形成減少到最小程度。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液的溫度維持在約-20℃到-30℃之間。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液流過所述生物活性材料的速率大約是每英尺的冷卻液每分鐘以約35升的量通過不大於約24英寸寬×48英寸深的面積。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括以化學方法製備所述要冷凍的生物活性材料。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述化學方法製備要冷凍的生物活性材料包括用低溫防凍劑處理所述材料。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液的環流由浸於其中的循環器驅動。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述循環器包括馬達；和耦合於該馬達隨其旋轉的推進器，推進器的旋轉使冷卻液環流。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將所述冷卻液環流通過浸沒在該冷卻液中的熱交換線圈中，所述熱交換線圈至少能從所述冷卻液中帶走與該冷卻液從所述生物活性材料中帶走的熱量相同的熱量。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述熱交換線圈是多通路線圈。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述熱交換線圈的大小直接與冷卻液環流通過的面積相關，其中，該面積約為24英寸寬×48英寸深。
11.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用基本上匹配熱交換線圈的負荷需求的致冷器冷卻該熱交換線圈。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的單細胞。
13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的組織。
14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的器官。
15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的核酸。
16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的核糖核酸。
17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的、基於胺基酸的化合物。
18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的、基於脂質的化合物。
19.一種低溫保藏的方法，該方法包括將生物活性材料浸入冷卻液中；和以基本上恆定的預定速率和溫度使所述冷卻液環流通過所述生物活性材料，直接將其冷凍到約-30℃以上的溫度，使其玻璃化。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液的溫度維持在約-20℃到-30℃之間。
21.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液流過所述生物活性材料的速率大約是每英尺的冷卻液每分鐘以約35升的量通過不大於約24英寸寬×48英寸深的面積。
22.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括以化學方法製備所述要冷凍的生物活性材料。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述化學方法製備要冷凍的生物活性材料包括用低溫防凍劑處理所述生物活性材料。
24.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液的環流由浸於其中的循環器驅動。
25.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述循環器包括馬達；和耦合於該馬達隨其旋轉的推進器，推進器的旋轉使冷卻液環流。
26.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將所述冷卻液環流通過浸沒在該冷卻液中的熱交換線圈中，所述熱交換線圈至少能從所述冷卻液中帶走與該冷卻液從所述生物活性材料中帶走的熱量相同的熱量。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述熱交換線圈是多通路線圈。
28.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述熱交換線圈的大小直接與冷卻液環流通過的面積相關，其中，該面積約為24英寸寬×48英寸深。
29.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用基本上匹配熱交換線圈的負荷需求的致冷器冷卻該熱交換線圈。
30.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的單細胞。
31.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的組織。
32.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的器官。
33.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的核酸。
34.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的核糖核酸。
35.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的、基於胺基酸的化合物。
36.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的、基於脂質的化合物。
37.一種已進行低溫保藏方法的生物材料，該低溫保藏方法包括將生物活性材料浸入冷卻液中；和以基本上恆定的預定速率和溫度使所述冷卻液環流通過所述生物活性材料，以冷凍該生物活性材料，使其玻璃化，並將細胞膜中應力破壞的形成減少到最小程度。
38.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液的溫度維持在約-20℃到-30℃之間。
39.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液流過所述生物活性材料的速率大約是每英尺的冷卻液每分鐘以約35升的量通過不大於約24英寸寬×48英寸深的面積。
40.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述低溫保藏方法還包括以化學方法製備所述要冷凍的生物活性材料。
41.如權利要求40所述的方法，其特徵在於，所述化學方法製備要冷凍的生物活性材料包括用低溫防凍劑處理所述材料。
42.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述冷卻液的環流由浸於其中的循環器驅動。
43.如權利要求42所述的方法，其特徵在於，所述循環器包括馬達；和耦合於該馬達隨其旋轉的推進器，推進器的旋轉使冷卻液環流。
44.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將所述冷卻液環流通過浸沒在該冷卻液中的熱交換線圈中，所述熱交換線圈至少能從所述冷卻液中帶走與該冷卻液從所述生物活性材料中帶走的熱量相同的熱量。
45.如權利要求44所述的方法，其特徵在於，所述熱交換線圈是多通路線圈。
46.如權利要求44所述的方法，其特徵在於，所述熱交換線圈的大小直接與冷卻液環流通過的面積相關，其中，該面積約為24英寸寬×48英寸深。
47.如權利要求44所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括用基本上匹配熱交換線圈的負荷需求的致冷器冷卻該熱交換線圈。
48.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的單細胞。
49.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的組織。
50.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是可存活的器官。
51.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的核酸。
52.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的核糖核酸。
53.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的、基於胺基酸的化合物。
54.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述生物活性材料是有活力的、基於脂質的化合物。
全文摘要
通過製備要冷凍的可存活的生物材料、將其浸入裝有冷卻液的容器中、並以基本上恆定的預定速率和溫度使冷卻液環流通過該生物材料，使其冷凍，從而將存活的生物材料進行低溫保藏(低溫保存)。本發明的方法以足夠快的速率冷凍生物材料，以避免在細胞結構內形成冰晶(玻璃化)。冷卻液的溫度較佳為－20℃到－30℃，這個溫度範圍足夠使細胞膜中由於熱變化而導致的應力破壞的形成減少到最小程度。採用本發明方法冷凍的細胞具有約80％的存活率，此比率明顯高於其它的低溫保藏方法。
文檔編號C12N1/04GK1434679SQ01810856
公開日2003年8月6日 申請日期2001年6月12日 優先權日2000年6月12日
發明者S·D·普裡恩, J·布蘭頓, K·R·龐德, M·F·米勒, B·伍德, A·J·卡斯爾 申請人:蘇帕契勒國際控股有限公司