因子viii變體及使用方法

2023-07-29 05:33:16

專利名稱：因子viii變體及使用方法
技術領域：
本發明涉及變體因子VIII (FVIII)蛋白。本發明還涉及編碼變體FVIII蛋白的核酸及用於鑑定此類核酸的方法。本發明涉及生成和使用所述變體FVIII蛋白的方法。
背景技術：
血液凝固通過接觸激活途徑(以前稱為內源性途徑)或組織因子途徑(以前稱為外源性途徑)來發生，由此某些血液蛋白質在蛋白水解激活級聯中相互作用以最終將可溶性血纖蛋白原轉化成不溶性血纖蛋白。這些血纖蛋白絲交聯以形成凝塊的支架；在沒有血纖蛋白形成的情況中，不能發生凝固。接觸激活途徑由數個步驟組成(1)因子XII的蛋白水解激活；( 激活的因子 XII切割因子XI以將其激活；(3)激活的因子XI切割因子IX，由此將其激活；(4)激活的因子IX與激活的FVIII相互作用以切割並激活因子X ； (5)激活的因子X結合膜表面上激活的因子V，該複合物以蛋白水解方式切割凝血酶原以形成凝血酶；(6)凝血酶以蛋白水解方式切割血纖蛋白原以形成血纖蛋白；(7)血纖蛋白單體裝配成原纖維，其然後被因子XIII 來交聯。組織因子途徑由下列步驟組成(1)在血管破裂後，因子VII結合組織因子，即存在於血管系統外部的組織中的脂蛋白；(2)通過蛋白水解切割將因子VII激活成因子Vila; 及(3)因子VIIa-組織因子複合物切割並激活因子X。此後，組織因子途徑與接觸激活途徑相同，即兩種途徑共享上文所描述的最後三個步驟。FVIII的生物合成、胞內加工、和分泌及其隨後在血漿中被激活的機制是本領域中公知的(參見例如 Lenting 等，Blood 92 :3983-3996,1998 ；Thompson， Seminars in Hemostasis 29 :11-22,2003 ；Graw ^, Nature Reviews =Genetics 6 :489_501，2005)。人 FVIII最初以2351個胺基酸(SEQ ID NO 1)的單鏈多肽翻譯，其中前19個胺基酸限定被 ER內的信號肽酶除去的信號肽。如此，成熟的人FVIII由2332個胺基酸組成，具有域結構 Al-al-A2-a2-B-a3-A3-Cl-C2 (

圖1A)。FVIII被糖基化，並在分泌前通過B域羧基端附近 (Arg-1648，在B_a3連接處)的切割來胞內加工，並且在B域內，主要在Arg-1313後可變切割，以生成90-210kDa重鏈和SOkDa輕鏈(圖1B)。此後，FVIII以異二聚體糖蛋白分泌，所述糖蛋白由單一重鏈和單一輕鏈組成。血漿糖蛋白FVIII在血液中以與von Willebrand因子(vWf)緊密且非共價結合的無活性前體形式循環。通過用凝血酶或因子)(a在三個Arg-Ser肽鍵處，即在Arg-372、 Arg-740 JPArg 1689後切割來以蛋白水解方式激活FVIII，所述切割將其與vWf解離，並在級聯中激活其促凝血功能。所得的異三聚體變為FVIIIa(圖1C)。在其活性形式(即FVIIIa)中，FVIII在血液凝固的接觸激活途徑中發揮因子X激活酶複合物的輔因子的功能，而且其在血友病A患者中是降低的或非功能性的。FVIII活性的降低水平與疾病的嚴重程度成正比。如此，具有FVIII缺陷或具有針對FVIII的抗體的人罹患不受控制的內部出血，其可以引起一批重度症狀，除非他們用FVIII治療。症狀範圍為關節中的炎症反應到早期死亡。實際上，FVIII的經典定義是存在於正常血漿中的改正源自患有血友病A的個體的血漿中的凝固缺陷的物質。因為vWf是功能性FVIII的一種至關重要的構件，所以vWf缺陷也可以引起表型血友病A。在這些病例中，FVIII在血漿中的循環半衰期以如下的程度降低，使得它不再能在血液凝固中執行其特殊的功能。目前的血友病A治療包括通過施用血漿源或重組FVIII來替換缺少的蛋白質。抑制FVIII活性的抗體(「抑制劑」或「抑制性抗體」)的形成是血友病A患者管理中的一項嚴重的併發症。自身抗體在佔響應FVIII的治療性輸注的血友病A患者的約 20%中形成。在形成抑制劑的先前未治療的血友病A患者中，抑制劑通常在治療的一年內形成。另外，使FVIII失活的自身抗體偶而在先前具有正常的FVIII水平的個體中形成。若抑制劑效價足夠低，則患者可以通過提高FVIII劑量來管理。然而，抑制劑效價經常如此之高以致於它不能被FVIII壓倒。一種備選的策略是使用因子IX複合物製備物或重組人因子VIIa來繞過正常止血過程中對FVIII的需要。另外，因此豬FVIII通常具有實質上小於人FVIII的與抑制劑的反應性，所以可以使用部分純化的豬FVIII製備物。已經形成針對人FVIII的抑制性抗體的許多患者已經用豬FVIII成功得到治療，而且已經耐受此類治療達一段較長的時間。然而，施用豬FVIII不是完整的解決辦法，因為抑制劑可以在一次或多次輸注後針對豬FVIII形成。如此，重組人FVIII或部分純化的豬FVIII的使用尚未解決所有問題。在抑制性抗體外，還出現了如下的問題，其在於FVIII在靜脈內施用時具有相對較短的循環半衰期(在人中為13小時)，因此需要頻繁的輸注，這引起患者劑量給藥順應性的困難。如此，用於每周劑量給藥或甚至每月劑量給藥的更長效的FVIII是未滿足的醫學需要(Dargaud 等，Expert Opinion on Biological Therapy 7 :651_663，2007)。更長的保護會通過延長FVIII半衰期來實現。正在探索許多FVIII生物工程方法，其目的在於產生持續較長一段時間的保護(Baru 等，Thromb. Haemost. 93 1061-1068，2005 ；Pipe, J. Thromb· Haemost. 3 :1692-1701,2005 ；Saenko 等，Haemophilia 12(增刊 3) :42-51,2006)。本發明涉及FVIII變體，其表明經修飾的活性和/或經修飾的藥動學特性(例如， 較長的循環半衰期)。舉例而言，FVIII變體可以是融合物或異二聚體(heterodimer)蛋白，其中在FVIII蛋白的B域部分中插入胺基酸序列(例如調控劑(modulator))或者用此胺基酸序列替換B域或B域的一部分。此插入/替換胺基酸序列不破壞FVIII的翻譯後加工，並且此FVIII變體具有作為凝固因子的活性。可以使用這些FVIII變體來治療血友病A，並且可以由於例如循環半衰期較長而導致不太頻繁的施用。通過需要不太頻繁的劑量給藥，本發明的FVIII變體可以改善患者順從性，並且降低患者由於施用FVIII而形成對 FVIII的免疫響應的概率。發明概述本發明涉及FVIII融合蛋白及其表達產物(在本文中又稱為FVIII融合異二聚體)。本發明進一步涉及雜合FVIII融合異二聚體和多聚體FVIII融合異二聚體。在一個實施方案中，FVIII融合異二聚體包含FVIII蛋白或多肽和胺基酸序列(在本文中稱為調控劑)。在另一個實施方案中，將調控劑序列插入FVIII B域中。在又一個實施方案中，至
6少將B域的一部分缺失，並用調控劑序列替換。本發明還涉及編碼FVIII融合異二聚體的核酸序列。在一個實施方案中，核酸序列編碼包含FVIII蛋白的FVIII融合異二聚體，其中調控劑序列存在於B域中或者用調控劑序列替換B域的一些或所有胺基酸序列。可以在表達盒中可操作連接編碼FVIII融合異二聚體的核酸序列。本發明還包括製備FVIII融合異二聚體的方法。例如，將編碼FVIII 融合異二聚體的表達盒(若還不是表達載體的一部分的話)引入表達載體中，隨後導入適合於FVIII融合異二聚體的重組生成的宿主細胞中。所生成的融合異二聚體具有體外和體內FVIII活性，而且可以例如展現出延長的體內循環半衰期。在本發明的又一個實施方案中，FVIII融合異二聚體包含與SEQ ID NO :1、3、或5 之任一項的胺基酸20-764對應的第一胺基酸序列；與SEQ ID NO :1、3、或5之任一項的胺基酸1656-2351對應的第二胺基酸序列；和調控劑序列，其中(1)所述調控劑序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接於所述第二胺基酸的氨基端，或( 所述調控劑序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且所述調控劑胺基酸序列不共價附接於所述第二胺基酸序列。在本發明的另一個實施方案中，核酸序列編碼FVIII融合異二聚體，其中所述 FVIII融合異二聚體包含與SEQ ID NO :1、3、或5之任一項的胺基酸20-764對應的第一胺基酸序列 』與SEQ ID NO :1、3、或5之任一項的胺基酸1656-2351對應的第二胺基酸序列；和調控劑序列，其中所述調控劑序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端， 且在其羧基端共價附接於所述第二胺基酸的氨基端。另外，本發明還涉及生成融合異二聚體的載體、宿主細胞、方法及治療凝固缺陷的方法。附圖簡述圖IA顯示了全長人FVIII的結構，其從N端到C端含有下列域S (信號肽)、Al、 al、A2、a2、B、a3、A3、CljPC2。圖IB顯示了異二聚體人因子VIII的重鏈和輕鏈的結構。 由於B域內的可變蛋白水解切割，重鏈的大小有所變化。圖IC顯示了活性人FVIII (即 FVIIIa)的亞基的結構。圖2顯示了實施例部分中所描述的本發明的因子VIII融合異二聚體的三個例示性實施方案。三個實施方案表示為「BDDFc+鉸鏈」、「BDDFc-鉸鏈」、和「BDDFc」 (其任選地可以包含異源肽標籤以便於分離)。三個例示性的實施方案在其形成二聚體(經由其Fc部分)或蛋白質聚集體的能力方面及在其對Fcfoi的結合親和力方面不同。圖3描繪了依照實施例1和2生成的因子VIII融合蛋白的結構域。具體地，將鼠 Fc區(具有或沒有鉸鏈)插入B域缺失型(BDD)因子VIII蛋白的特定位點(在N-745與 S-1637之間)中以替換B域的缺失部分。標示鼠Fc區的N端和C端側的非缺失B域部分的胺基酸序列。圖4顯示了依照實施例5生成的單順反子BDD. mFc單體構建體。圖5顯示了通過活性測定法來鑑定高表達克隆。通過FVIII aPPT凝固測定法來篩選表達BDDFc+鉸鏈的HKBll穩定細胞系。克隆0、8、12、18、27、和33)顯示範圍為 500-3500mlU/mL的高凝固活性。圖6顯示了通過ELISA測定法來鑑定高表達克隆。通過抗-FVIII捕捉ELISA來篩選表達BDDFc+鉸鏈的HKBll穩定細胞系。三個克隆(克隆8、18、和27)以約lug/mL表達BDDFc+鉸鏈融合物。圖7顯示了 BDDFc+鉸鏈融合蛋白的蛋白質純化的結構。在還原性凝膠中，BDDFc+ 鉸鏈解析為80-kDa輕鏈(L)、115-kDa重鏈(H)、和195-kDa未加工的單鏈(U)(第8道)。 在非還原性凝膠中，在80-、115-、195-kDa條帶(第8道)外，BDDFc+鉸鏈產生390-kDa條
帶(二聚體)。圖8表明回收血友病A (Hem Α)小鼠中的BDDFc-鉸鏈("FVII I-Fc")和BDD-FVIII。 9隻HemA小鼠接受含有5%清蛋白的配製緩衝液中的50 μ g/kg (400IU/kg) ( · ) BDDFc-鉸鏈。其它HemA小鼠接受200IU/kg( □ )BDD-FVIII，即衍生BDDFc-鉸鏈的因子VIII變體。 與BDD-FVIII的衰變曲線相比，BDDFc-鉸鏈顯示具有快速的分布相的兩相衰變。BDDFc-鉸鏈的beta相半衰期在50 μ g/kg時是11. 9小時，其相對於未修飾的BDD-FVIII (對於其， beta相半衰期是6. 03小時)改善約2倍。圖9A顯示了在Western印跡分析中以115kDa條帶檢測出的BDDFc+鉸鏈的BDD-Fc 嵌合鏈。將來自瞬時轉染子(trans)和穩定集合(sp)兩者的樣品濃縮5倍，然後在還原條件下在10% NuPAGE 凝膠上運行。道1)分子量標誌物；2)作為標準品的純化的BDD蛋白；3-5)來自分別用pSK207載體、pSK207BDD、和pSK207BDDFc+鉸鏈瞬時轉染的HKBll細胞的濃縮的條件化培養基；7-9)來自分別用pSK207載體、pSK207BDD、pSK207BDDFc+鉸鏈穩定轉染的HKBll細胞的穩定集合的濃縮的條件化培養基。用綴合有HRP的抗小鼠IgG(H+L) 探查印跡。以195kDa條帶檢測出未加工的單鏈形式的BDDFc+鉸鏈(「sc BDD-Fc」)，而異二聚體形式的BDDFc+鉸鏈包含因子VIII重鏈和Fc的115kDa嵌合物(「重鏈Fe」)。異二聚體BDDFc+鉸鏈的輕鏈沒有出現條帶，因為它不被綴合有HRP的抗小鼠IgG結合。圖9B顯示了在Wfestern印跡分析中以80kDa條帶檢測出的BDDFc輕鏈。將蛋白質樣品在還原條件下在10% NuPAGE 凝膠上運行。道1)分子量標誌物；2)作為標準品的純化的BDD蛋白； 3-5)來自分別用pSK207載體、pSK207BDD、和pSK207BDDFc+鉸鏈瞬時轉染的HKBll細胞的濃縮的條件化培養基。用FVIII輕鏈特異性抗體探查印跡。圖10顯示了因子VIII活性測定法的結果。將來自用pSK207BDDFc+鉸鏈(「Fe+ 鉸鏈sup」)和PSK207BDDFC-鉸鏈(「Fe-鉸鏈sup」)瞬時轉染的HKBll細胞的條件化培養基收集，並在Coatest 測定法及aPPT凝固測定法兩者中測試FVIII活性。作為對照， 在轉染及活性測定法中使用載體PSK207和pSK207BDD( "BDD sup」)，其編碼未修飾的因子 VIII蛋白。圖11顯示了因子VIII融合異二聚體的因子VIII活性。將來自HKBll細胞 [(BDDFc+鉸鏈瞬時轉染子(Tr)和穩定集合(Sp)]的條件化培養基加載到用兔-抗-小鼠 Fc抗體預先包被的96孔板上。在於室溫溫育2小時後，用PBS/Tween -20/BSA將平板清洗三次以除去非特異性結合，之後進行Coatest⑧測定法。圖12表明BDDFc+鉸鏈形成二聚體，並且BDDFc-鉸鏈是單體。使用來自用 pSK207BDDFc+鉸鏈或pSK207BDDFc-鉸鍊表達載體轉染的HKB 11細胞的5倍濃縮的條件化培養基來實施^festern印跡分析。將樣品在還原和非還原條件下在4_12 % NuPAGE 凝膠上運行。用兔單克隆抗-FVIII輕鏈抗體(Epitomics，Burlingame, CA)，接著用綴合有HRP 的抗兔IgG 二抗探查印跡。分別以170-kDa和195-kDa條帶檢測出未加工的單鏈BDD和 BDDFc。道BDD 純化的 BDD 蛋白；+H =BDDFc+ 鉸鏈；-H =BDDFc-鉸鏈；及 V 單獨的 pSK207載體。圖13顯示了測量BDDFc+鉸鏈和BDDFc-鉸鏈(「BDDFc-H」)(其摻入小鼠Fcfoi結合表位)結合固定化的小鼠Fcfoi的能力的Biacore 研究的結果。BDDFc+鉸鏈(「BDDFc+H」)、 BDDFc-鉸鏈(「BDDFc-H」 )、BDD、和全長重組因子VIII (FVIII)。在BDD或全長因子VIII 的情況中沒有看到可檢出的結合。BDDFc+鉸鏈和BDDFc-鉸鏈融合蛋白以nM親和力顯示對 mFcRn的強結合。圖14顯示了測量BDDFc+鉸鏈和BDDFc-鉸鏈結合固定化的人von Willebrand因子(vWF)的能力的Biacore 研究的結果。通過胺偶聯來將小鼠Fcfoi固定化到CM-5晶片上。 BDDFc+鉸鏈(「BDDFc+H」)、BDDFc-鉸鏈(「BDDFc-H」)、BDD、和全長重組因子 VIII (FVIII) 對vWF顯示亞納摩爾親和力。圖15顯示了 BDDFc-鉸鏈在HemA小鼠的尾靜脈橫斷出血模型中是有效的。為了測定BDDFc-鉸鏈在治療體內出血中是否為功能性的，經由尾靜脈給HemA小鼠注射BDDFc-鉸鏈、BDD-FVIII、或媒介物對照，48小時後橫斷(transection) —個側尾靜脈(lateral tail vein) 0與僅10%在損傷後存活M小時的媒介物-對照組(▲)相比，12個IU/kg(·) 和60個IU/kg( ■ )BDDFc-鉸鏈分別實現25%和80%存活。FVIII-Fc-鉸鏈的功效評估為與BDD-FVIII (其在40IU/kg( )時導致60%存活)的功效相當。發明詳述應當理解的是，本發明不限於所描述的具體方法、方案、細胞系、動物種或屬、構建體、和試劑，並且因此可以有所變化。還應當理解的是，本文中所使用的術語是僅為了描繪具體的實施方案，而且並不意圖限制本發明的範圍，其僅會被所附權利要求書限制。必須注意到，如本文中和所附權利要求書中所使用的，除非上下文另有明確規定， 單數形式「一個」、「一種」、和「所述」包括複數提及物。如此，例如，提及「蛋白質」指提及一個/種或多個/種蛋白質，包括本領域技術人員已知的其等同物等。除非另有定義，本文中所使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以在本發明的實踐或測試中使用與本文中所描述的那些方法、裝置、和材料相似或等同的任何方法、裝置、和材料，但是現在描述優選的方法、裝置和材料。在此為了描述和公開而將本文中所提及的所有出版物和專利收入本文，例如，可結合目前所描述的發明使用的出版物中所描述的構建體和方法。上文所討論的和遍及整個文本的出版物僅提供用於本申請的申請日前的其公開內容。本文中的任何文字都不應解釋為承認本發明沒有資格早於憑藉在先發明的所述公開。如本文中所使用的，下文描述了多個術語。「核酸」指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非明確限制，該術語涵蓋含有與參照核酸具有相似結合特性，並且以與天然存在的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有指明，特定的核酸序列還明確涵蓋其保守修飾的變體(例如簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指示的序列。簡併密碼子取代可以通過生成用混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代一個或多個選定的(或所有)密碼子的第三位的序列來實現。根據上下文，該術語核酸與基因、cDNA、和由基因編碼的mRNA可互換使用。
「源自基因的核酸」指基因或其亞序列最終已經為其合成充當模板的核酸。如此， mRNA、自mRNA逆轉錄的cDNA、自所述cDNA轉錄的RNA、自cDNA擴增的DNA、自擴增的DNA轉錄的RNA等源自基因。並且此類衍生產物的檢測指示樣品中的初始基因和/或基因轉錄物的存在和/或豐度。核酸序列在將其放入與另一核酸序列的功能關係中時是「可操作連接的」或「可操作插入的」。例如，啟動子或增強子可以與編碼序列可操作連接。可操作連接的核酸序列可以是連續的和/或連接兩個蛋白質編碼區。一些核酸序列可以是可操作連接的但不是連續的。核酸序列的連接可以通過在限制性位點處的連接來實現。若不存在此類位點，則可以依照常規的實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。具有生物學活性的第一多肽在將其放入與第二多肽的功能關係時與具有生物學活性的第二多肽「可操作連接」，從而第一多肽和第二多肽兩者至少保留最低水平的生物活性。在多肽的上下文中，可操作連接不必暗示第一和第二多肽是連續的。如本領域技術人員領會的，可以通過納入肽接頭來便於生物學活性的維持。多肽、核酸、或其它組分在它與其通常關聯的組分(其它肽、多肽、蛋白質(包括複合物，例如聚合酶和核糖體，其可以伴隨天然的序列)、核酸、細胞、合成的試劑、細胞汙染物、細胞組分等)，例如諸如與其通常在其最初來源的細胞中關聯的其它組分部分或完全分開時是「分離的」。多肽、核酸、或其它組分在它自其天然環境的其它組分部分或完全回收或分離，使得它是各組分的組合物、混合物、或集合中存在的主要種類(即，按摩爾計，它比組合物中的任何其它個別種類更豐富)時是分離的。在一些情況中，製備物由超過約60%、 70 %或75 %，通常超過約80 %，或超過約90 %的分離的種類組成。「基本上純的」核酸(例如RNA或DNA)、多肽、蛋白質、或組合物也指其中目標種類 (例如核酸或多肽)包含存在於組合物中的所有大分子種類的至少約50、60、70、80、90、或 95% (按重量計)。目標種類也可以以實質同質性純化(通過常規的檢測方法不能在組合物中檢出汙染物種類)，其中組合物基本上由單一大分子種類的衍生物組成。術語「純化的」一般指核酸、多肽、或蛋白質是至少約50%純的、60%純的、70%純的、75%純的、85%純的、和99%純的。術語「重組」在提及例如細胞、多核苷酸、載體、蛋白質、或多肽使用時通常指細胞、 多核苷酸、或載體已經通過導入異源(或外來)核酸或改變天然的核酸進行過修飾，或者蛋白質或多肽已經通過引入異源胺基酸進行過修飾，或者細胞源自如此修飾的細胞。重組細胞表達不可在天然(非重組)形式的細胞中找到的核酸序列或者表達在其它情況中會異常表達、表達不足、或根本不表達的天然核酸序列。術語「重組」在提及細胞使用時指明細胞複製異源核酸，或者表達由異源核酸編碼的多肽。重組細胞可以含有在天然(非重組)形式的細胞內找不到的編碼序列。重組細胞還可以含有在天然形式的細胞中找到的編碼序列， 其中通過人工手段將編碼序列修飾並再導入細胞中。該術語還涵蓋含有對於細胞而言內源的在不從細胞取出核酸的情況中進行過修飾的核酸的細胞；此類修飾包括那些通過基因替換、位點特異性突變、重組、及相關技術獲得的。術語「重組生成的」指通常通過化學合成手段、核酸區段的遞歸(recursive)序列重組或其它核苷酸多樣性產生方法(諸如例如改組)、或核酸的分離的區段的操作，例如通過本領域普通技術人員已知的遺傳工程技術來實現的人工重組。「重組表達的」通常指用於在體外生成重組核酸，並將重組核酸轉移到可以將其表達或增殖的體內、體外、或離體細胞中的技術。「重組表達盒」或僅「表達盒」意指用能夠在與此類序列相容的宿主中實現編碼結構蛋白的核酸的表達的核酸元件重組或合成生成的核酸構建體。表達盒必須包括要轉錄的核酸(例如，編碼期望的多肽的核酸)和啟動子。如本文中所描述的，也可以使用在實現表達中必需的或有幫助的其它構件。例如，表達盒還可以包含編碼指導表達的蛋白質從宿主細胞分泌的分選信號(例如信號肽或分泌前導序列)的核苷酸序列。轉錄終止信號、增強子、和影響基因表達的其它核酸序列也可以包含在表達盒中。出於本發明的目的，「包含因子VIII融合基因的表達盒」指示由表達盒表達的期望的蛋白質是「因子VIII融合蛋白」， 如該術語在下文進一步定義的。根據上下文，術語「載體」可以指克隆載體、表達載體、或這兩者。術語載體和術語 「質粒」可互換使用。術語「表達載體」或「表達質粒」指可以將表達盒導入宿主細胞中，從而轉化宿主並促進導入的序列表達(例如轉錄和翻譯)的媒介物。術語「表達」指容許或引起基因或DNA序列中的信息變得明顯，例如通過激活相應基因或DNA序列的轉錄和翻譯中涉及的細胞功能來生成蛋白質。DNA序列在細胞中或由細胞表達以形成「表達產物」諸如蛋白質。表達產物自身例如所得的蛋白質也可以說成「表達的」。表達產物可以表徵為胞內、胞外、或分泌的。「胺基酸修飾」指預定的胺基酸序列的胺基酸序列的變化。例示性的修飾包括胺基酸取代、插入和/或缺失。「胺基酸插入」指將至少一個胺基酸摻入預定的胺基酸序列中。插入可以由插入的一個或兩個胺基酸殘基或更大的插入物組成。插入的殘基可以是天然存在的或非天然存在的，如上文所公開的。「胺基酸缺失」指從預定的胺基酸序列除去至少一個胺基酸殘基。「胺基酸取代」指將預定胺基酸序列中的至少一個存在的胺基酸殘基用另一個不同的「替換」胺基酸殘基替換。替換殘基可以是「天然存活的胺基酸殘基」(即，由遺傳密碼編碼的)，並且選自下組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬醯胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)； 半胱氨酸(Cys)；穀氨醯胺(Gln)；穀氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸 (Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)。本文中的胺基酸取代的定義還涵蓋用一個或多個非天然存在的胺基酸殘基的取代。「非天然存在的胺基酸殘基」指與上文所列的那些天然存在的胺基酸殘基不同的殘基，其能夠共價結合多肽鏈中的相鄰胺基酸殘基。非天然存在的胺基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸、和其它胺基酸殘基類似物諸如那些記載於Ellman等(Meth. Enzym. 202 =301-336, 1991)的。為了生成此類非天然存在的胺基酸殘基，可以使用Noren等(Science 244:182， 1989)及Ellman等，1991的規程。簡言之，這些規程涉及用非天然存在的胺基酸殘基化學激活抑制型tRNA，接著進行RNA的體外轉錄和翻譯。最後，本領域技術人員應當認可，可以在一個步驟中，或者在兩個步驟中(例如通過胺基酸缺失，接著是胺基酸插入或者反之亦然) 來實現例如蛋白質區域的胺基酸取代。
規定的多肽或蛋白質的「變體」包含由於如本文中所定義的至少一處「胺基酸修飾」而與規定的多肽或蛋白質的胺基酸序列不同的胺基酸序列。「變體」包括展現出期望的活性的多肽或蛋白質的片段，諸如IgG的Fc區中結合Fcto，由此在與凝固因子偶聯時改善循環半衰期的片段。「融合多肽」指包含未發現在相同多肽中天然存在的至少兩個離散的肽部分的多肽。「融合蛋白」指包含至少一種融合多肽的蛋白質。如此，多亞基蛋白質稱為融合蛋白，即使僅其亞基之一是融合多肽。術語「FVIII」、「因子VIII」、或「因子VIII蛋白」意圖涵蓋擁有因子VIII的生物學活性的野生型因子VIII蛋白，包括功能性等位變體，或其任何衍生物、變體、或類似物。出於此定義的目的，「因子VIII的生物學活性」指其參與血液凝固的內源性途徑的能力。一般而言，可以使用商品化因子 VIII 測定法(Coatest 、diaPharma 、West Chester, Ohio) 或本領域中的其它測定法通過參照源自血漿的因子VIII標準品來測定此生物學活性。在提及因子VIII域的情況中，使用「域」來表示本領域技術人員已知的因子VIII 的合適的區域。就人因子VIII而言，圖1中顯示了不同因子VIII域的胺基酸編號。「因子VIII融合基因」指編碼如下文進一步定義的「因子VIII融合蛋白」，而且可以通過將編碼調控劑的核酸在因子VIII蛋白編碼序列內與B域編碼部分對應的位置處可操作插入編碼因子VIII蛋白的核酸中來生成的非天然存在的核酸構建體。舉例而言，至少可以將B域編碼序列的一部分缺失，並用編碼調控劑的核酸替換。如本領域技術人員應當領會的，「可操作插入」僅意圖涵蓋編碼調控劑的核酸的那些插入，其生成編碼調控劑的核酸的一部分和在編碼調控劑的核酸的上遊和下遊的編碼因子VIII的一部分的核酸均在適當的讀碼框中的核酸構建體。因子VIII融合基因可以進一步包含編碼肽接頭或多聚化序列的其它核酸序列。最後，出於上述定義的目的，「基因」並不意圖暗示存在在其它情況中會是實現轉錄、翻譯、或適當的翻譯後加工所需要的任何核酸序列(即啟動子、增強子、信號肽、分泌前導序列等)。「因子VIII融合蛋白」指通過因子VIII融合基因的轉錄和翻譯生成，但是其尚未經歷翻譯後加工的全長多肽。在翻譯後加工過程中，因子VIII融合蛋白轉化成「因子VIII 融合異二聚體」，如下文所定義的。「因子VIII融合異二聚體」指具有因子VIII的生物學活性，並且由於因子VIII融合基因的轉錄和翻譯，及由此生成的因子VIII融合蛋白的翻譯後修飾(包括蛋白水解加工)而生成的異二聚體蛋白質。如此，因子VIII融合異二聚體與發現在血漿中循環的異二聚體形式的野生型因子VIII類似(即包含重鏈和輕鏈)。本發明的因子VIII融合異二聚體與其來源的異二聚體形式的因子VIII蛋白的不同之處可以在於其由例如「經修飾的重鏈」(即包含調控劑，而且還可以具有B域的至少一部分的缺失的因子VIII重鏈)組成。 與衍生融合異二聚體的因子VIII蛋白相比，本發明的因子VIII融合異二聚體可以展現出例如，延長的循環半衰期。「因子VIII融合異二聚體」還可以涵蓋「多聚體」和「雜合」因子 VIII融合異二聚體，如下文進一步定義的。「多聚體因子VIII融合異二聚體」指包含至少兩個因子VIII融合異二聚體的蛋白質。若存在於第一因子VIII融合異二聚體中的調控劑的胺基酸、肽、或多肽部分能夠介
12導與存在於第二因子VIII融合異二聚體中的調控劑的同源或異源部分的非共價或共價關聯，則可以出現多聚體因子VIII融合異二聚體。例如，IgG的Fc部分的鉸鏈區能夠介導兩個因子VIII融合異二聚體間的共價關聯，不管因子VIII融合異二聚體是否具有相同的胺基酸序列(在該情況中，多聚體因子VIII融合異二聚體可以稱為「同-多聚體因子VIII融合異二聚體」)或不同胺基酸序列(在該情況中，多聚體因子VIII融合異二聚體可以稱為 「異-多聚體因子VIII融合異二聚體」)。若在編碼調控劑的核酸外，因子VIII融合基因包含可操作連接的編碼胺基酸、肽、或多肽的核酸，則也可以出現多聚體因子VIII融合異二聚體，所述胺基酸、肽、或多肽能夠介導與同源胺基酸、肽、或多肽(下文稱為「同-多聚化序列」)或異源肽或多肽(下文稱為「異-多聚化序列」)的非共價或共價關聯。熟練技術人員應當領會，在第一因子VIII融合基因僅含有異-多聚化序列時，可以需要獨特的第二因子VIII融合基因來生成多聚體因子VIII融合異二聚體。例如，熟練技術人員會認可，為了利用美國專利No. 5，807，706中所描述的「凸出-進入-空穴」方法，會需要兩種因子VIII 融合基因。關於多聚體因子VIII融合異二聚體的重組生成，熟練技術人員應當領會，同-多聚體形式可以通過單一重組宿主細胞生成，而異-多聚體形式可以通過在單一宿主細胞內的共表達或在多個宿主細胞中分開表達(在相同或不同細胞培養系統中)來生成。雖然並不意圖受限於目前已知的方法，但是下列非限制性參考文獻中教導的用於生成多聚體多肽的通用方法可以進行改編以用於生成多聚體因子VIII融合異二聚體美國專利申請公開文本No. 2007/0287170 ；美國專利No. 7，183，076中所披露的「多聚化域」方法，例如那些採用免疫球蛋白模塊的；使用Fos和Jim亮氨酸拉鏈，如美國專利No. 5，932，448中所採用的； 及美國專利No. 6，833，441中所採用的「異二聚體化序列」方法。「雜合因子VIII融合異二聚體」指僅包含與至少一個其它多肽共價或非共價關聯的單一因子VIII融合異二聚體的本發明的任何重組蛋白。熟練技術人員應當領會，在調控劑能夠形成二聚體或多聚體(例如免疫球蛋白的二聚Fc區)的情況中，有可能生成多聚體因子VIII融合異二聚體(如上文所定義的)。然而，熟練技術人員應當認可，不是多聚體半衰期調控劑的每個多肽都需要以因子VIII融合蛋白表達。例如，在使用Fc區作為調控劑的情況中，可以將僅編碼Fc區(或與親和標籤或非因子VIII肽、蛋白質或蛋白質片段可操作連接的Fc區)的表達盒導入包含含有因子VIII融合基因的表達盒的相同或不同宿主細胞中。熟練技術人員還應當領會，即使在調控劑不能形成二聚體或多聚體時，也可以設計雜合因子VIII融合異二聚體。具體地，同-或異二聚體序列可以位於因子VIII融合基因內， 在編碼調控劑的核酸的5』(表達時關係為N-端)或3』(即，表達時關係為C-端)。術語「調控劑」指在插入或取代到蛋白質(例如因子VIII)中時修飾例如蛋白質的活性和/或藥動學特性的任何多肽、蛋白質、蛋白質片段、或其變體(其由一個或多個多肽亞基組成)。舉例而言，與其來源的蛋白質相比，「半衰期調控劑」可以延長或縮短蛋白質 (例如因子VIII融合異二聚體、雜合因子VIII融合異二聚體、或由於所述插入或取代而生成的多聚體因子VIII融合異二聚體)的循環半衰期。半衰期調控劑可以例如將蛋白質(例如因子VIII融合異二聚體、雜合因子VIII融合異二聚體、或多聚體因子VIII融合異二聚體)的循環半衰期延長至少10 %、至少20 %、至少30 %或至少40 %、至少50 %、至少60 %、 至少70%、至少80%、至少90%、或至少100%。在一個實施方案中，與其來源的因子VIII 蛋白相比，半衰期調控劑可以將因子VIII融合異二聚體、雜合因子VIII融合異二聚體、或多聚體因子VIII融合異二聚體的循環半衰期延長至少約2倍，並且在又一些實施方案中， 將循環半衰期延長至少約2. 5倍、至少約3倍，或更多。在另一個實施方案中，半衰期調控劑不包括因子VIII蛋白的任何內源元件，諸如但不限於B域。如本文中所使用的，術語「循環半衰期」、「血漿半衰期」、「血清半衰期」、或 「ttlA]」在對患者施用肽藥物的上下文中可以定義為藥物在患者中的血漿濃度降低一半所需要的時間。根據多種清除機制、再分布、和本領域中公知的其它機制，可以有超過一個與肽藥物有關的半衰期。通常，alpha和beta半衰期定義為使得alpha相與再分布有關， 而beta相與清除有關。然而，在很大程度上局限於血流的蛋白質藥物的情況中，可以有至少兩個清除半衰期。出於本發明的目的，可以通過在施用後適當選定的時間點時測量血漿蛋白質水平(使用例如抗原ELISA來進行)，或者通過在適當選定的時間點時測量凝結劑活性(使用例如Coatest測定法來進行)來計算beta半衰期。關於半衰期的進一步解釋可以參見 Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin 禾口 RD Sindelar 編，Harwood Publishers，Amsterdam，第 101 頁-第 120 頁)。因子VIII融合基因的構建本發明的一個方面涉及因子VIII融合基因。因子VIII融合基因可以是RNA或 DNA。如先前所述，因子VIII融合基因是編碼因子VIII融合蛋白的核酸分子。因子VIII 融合基因源自因子VIII編碼序列、編碼調控劑的核酸、和任選地編碼同或異-多聚化序列的核酸，其與編碼調控劑的核酸不同。雖然在下文進一步詳述了因子VIII融合基因的這些構件，但是熟練技術人員應當領會，可以使用公知的規程從編碼這些離散的構件的核酸合成因子VIII融合基因的構建。可以在本發明中得到應用的多種方法記載於Molecular Cloning-Α Laboratory Manual，第 3 片反(Maniatis， Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)，及 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) ο編碼因子VIII的核酸的選擇本發明的重組因子VIII融合蛋白和異二聚體可以通過修飾核酸來製備，所述核酸編碼野生型因子VIII、可以存在並從一個個體到另一個發生的因子VIII的天然等位變體、嵌合因子VIII (例如人/豬)、或已經在其它方面進行過修飾，但仍保留促凝血功能的變體因子VIII，諸如已經進行過修飾以影響野生型因子VIII或因子VIIIa蛋白的特性，諸如糖基化位點和樣式、抗原性、比活性、循環半衰期、蛋白質分泌、對因子Ma和/或因子X的親和力、改變的因子VIII-失活切割位點、激活的因子VIIIa形式的穩定性、免疫原性、保存期等的變體。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII序列可以包括具有與野生型因子VIII有關的促凝固功能的任何先前已知的或後來鑑定的變體因子VIII序列。可以依照本發明修飾的合適的野生型因子VIII可以來自多種動物，包括但不限於哺乳動物諸如人(參見例如GenBank登錄號AAA52484(胺基酸)(SEQ ID NO 1)和 KO1740 (核苷酸)(SEQ ID NO 2)、GenBank 登錄號 AAA5M85 (胺基酸)(SEQ ID NO 3)和 M14113(核苷酸)(SEQ ID NO :4)、和 GenBank 登錄號 AAA5M2O (胺基酸)(SEQ ID NO:5))； 大鼠(參見例如GenBank登錄號AAQ21580(胺基酸)和AY362193 (核苷酸))；小鼠(參見例如GenBank登錄號AAA37385 (胺基酸)和L05573 (核苷酸))；犬(參見例如GenBank 登錄號AAB87412(胺基酸)和AF016234(核苷酸))；蝙蝠(參見例如GenBank登錄號ACC68917(胺基酸)和DP000725(核苷酸))；雞(參見例如GenBank登錄號AA033367 (胺基酸)和AF465272 (核苷酸))；黑猩猩(參見例如GenBank登錄號XP_529212 (胺基酸)和 XM_5^212(核苷酸))；豬(參見例如GenBank登錄號NP_999332(胺基酸)和NM_214167(核苷酸))；兔(參見例如GenBank登錄號ACA42556(胺基酸)和EU447260 (核苷酸))；貓、 猴、豚鼠、猩猩、母牛、馬、綿羊、山羊、或其它哺乳動物物種。來自人、豬、鼠和犬的序列還經由血友病A突變、結構、測試和來源網址(或HAMSTeRQ (其進一步提供了人、豬、鼠、和犬因子VIII蛋白的比對)以電子形式可獲得。如本領域技術人員應當領會，哺乳動物因子VIII 蛋白間的保守和同源性是公知的。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的一個非限制性例子是B域缺失型因子VIII(BDD因子VIII)，其特徵在於具有含有天然存在的人FVIII的B域的幾乎14個胺基酸(SFSQNPPVLKRHQR，SEQ ID NO :6)的缺失的胺基酸序列。(Lind等，Eur. J. Biochem. 232 19-27，1995)。此 BDD 因子 VIII 具有胺基酸序列 SEQ ID NO -J0可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是嵌合人 /動物因子VIII，其含有作為負責人因子VIII的抗原性的人胺基酸殘基的取代的一個或多個動物胺基酸殘基(參見例如美國專利No. 5，364，771 ；5, 663，060 』及5，888，974)。例如， 動物(例如豬)殘基取代可以包括但不限於下列一處或多處R484A、R488G、P485A、L486S、 Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、P492L、P492A、K493A、G494S、 V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、1503M、L504M、P505A、G506A、 E507G、1508M、1508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、K2227E、和 / 或 L2251 (參見例如美國專利No. 5，859，204和6，770, 744及美國專利申請公開文本No. 2003/0166536)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是特徵在於由於融合的A2和A3域引起的激活的因子VIII的穩定性更大的因子VIII。例如，可以如下修飾因子VIII，即取代第664位和第1擬6位的半胱氨酸殘基，產生包括共價連接A2 和 A3 域的 Cys664-Cysl^6 二硫化物鍵的突變體因子 VIII (Gale 等，J. Thromb. Haemost. 1 1966-1971，2003)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是具有改變的失活切割位點的因子VIII (參見例如Amano等，Thromb. Haemost. 79 =557-63,1998 ； Thornburg等，Blood 102:299,2003)。可以使用這些變化來降低突變體因子VIII對切割酶的易感性，所述切割酶通常使野生型因子VIII失活。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是具有增強的對因子 IXa(參見例如 Fay 等，J. Biol. Chem. 269 :20522-20527,1994) ；Bajaj 等， J. Biol. Chem. 276 16302-16309，2001 ；及 Lenting 等，J. Biol. Chem. 271 :1935-1940,1996) 和/或因子X(參見例如Lapan等，J. Biol. Chem. 272 =2082-2088,1997)的親和力的因子 VIII。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是修飾為增強因子VIII的分泌的因子VIII (參見例如Swaroop等，J.Biol. Chem. 272 :24121-24124, 1997)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是具有延長的循環半衰期的因子VIII。這些突變體因子VIII蛋白可以表徵為具有但不限於降低的與硫酸乙醯肝素的相互作用(Sarafanov 等，J.Biol. Chem. 276 :11970-11979,2001)和 / 或降低的與低密度脂蛋白受體相關蛋白(「LRP」)的相互作用(參見例如WO 00/28021 ； WO 00/71714 ；Saenko 等，J. Biol. Chem. 274 :37685-37692,1999 ；及 Lenting 等，J. Biol. Chem. 274 :23734-23739,1999)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是由修飾為編碼在已知的、現有的表位內的胺基酸以生成天冬醯胺殘基處的糖基化識別序列的核苷酸序列編碼的經修飾的因子VIII (參見例如美國專利No. 6，759，216)。此例子的突變體因子VIII在提供經修飾的因子VIII中可以是有用的，所述經修飾的因子VIII逃脫現有抑制性抗體的檢測(低抗原性因子VIII)，而且其降低形成抑制性抗體的概率(低免疫原性因子 VIII)。在一個實施方案中，可以依照本發明修飾的此類突變體因子VIII是突變成具有N連接的糖基化的共有胺基酸序列的因子VIII。此類共有序列的例子是N-X-S/T，其中N是天冬醯胺，X是任何胺基酸，且S/T代表絲氨酸或蘇氨酸(參見例如美國專利No. 6，759，216)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是具有多處突變的促凝固活性因子VIII (參見例如美國專利No. 6，838，437和美國專利申請公開文本No. 2004/0092442) 0此實施方案的一個例子涉及突變體因子VIII，其已經修飾為(i)缺失von Willebrand因子結合位點，(ii)添加Arg 740處的突變，並(iii)在A2-和A3-域間添加胺基酸序列間隔物，其中胺基酸間隔物具有足夠的長度，從而在激活後，促凝血活性因子VIII蛋白變為異二聚體(參見例如美國專利申請公開文本No. 2004/0092442 ；Pittman 等，PNAS 85 =2429-2433,1988 披露了 Arg740處的切割對生成輔因子活性不是至關重要的)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是由具有一個或多個位置中插入的截短的因子IX內含子1的核苷酸序列編碼的突變體因子 VIII (參見例如美國專利No. 6，800，461和6，780，614)。可以使用此突變體因子VIII來產生體外及在供基因療法用的轉移載體中的重組因子VIII的更大的產量(參見例如美國專利No. 6，800, 461)。在此實施方案的一個例子中，突變體因子VIII可以由如下的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列具有兩個位置中插入的截短的因子IX內含子1，而且具有適合於在造血細胞系中以及在血小板中驅動表達的啟動子(參見例如美國專利No. 6，780，614)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是展現出抑制性抗體的抑制降低的突變體因子VIII (參見例如美國專利No. 5，859，204 ；6, 180，371 ； 6，458，563 ；和 7，122，634)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是如下的突變體因子VIII，其在A2域中具有一處或多處胺基酸取代，該取代具有提高因子VIII的半衰期和/或比活性的效果(參見例如美國專利No. 7，211，559)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是展現出升高的比活性的突變體因子VIII (參見例如美國專利申請公開文本No. 2007/0265199)。可以依照本發明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是已經在預定的位點處被一個或多個生物相容性聚合物共價結合的FVIII突變蛋白質(參見例如美國專利申請公開文本No. 2006/0115876)。編碼調控劑的核酸的選擇
本發明的因子VIII融合基因包括編碼調控劑的核酸。例如，多種蛋白質(和編碼它們的核酸)是本領域中已知的，其在與治療性蛋白質融合時與未融合的治療性蛋白質相比具有延長血清半衰期的效果。可以潛在地使用編碼這些參考文獻中教導的任何調控劑的核酸來構建本發明的因子VIII融合基因。選擇可以例如潛在地延長因子VIII融合異二聚體的循環半衰期(與其來源的因子VIII蛋白相比)的候選調控劑的考慮因素包括(1)調控劑的循環半衰期應當大於為修飾選定的因子VIII蛋白的循環半衰期；及( 融合蛋白的免疫原性。關於第二項考慮因素，可以優選使用天然表達的或源自在意圖用因子VIII融合異二聚體治療的群體(例如人)中天然表達的蛋白質的調控劑。例如，調控劑天然存在於意圖要治療的群體的血清中(例如，使用人Fc區，其中人是意圖的治療群體)。在本發明的一個實施方案中，免疫球蛋白恆定區可以作為調控劑使用。因而，在構建本發明的因子VIII融合基因中使用的調控劑編碼核酸序列可以是編碼免疫球蛋白(Ig) 的R區或其片段和/或變體的多核苷酸，和編碼FcfoI結合肽或其變體的多核苷酸。在一個實施方案中，所使用的核酸編碼調控劑，其是自人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、或IgM、 或小鼠IgGl、IgGh、IgG2b、IgG3、IgA、或IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區或其片段和/或變體。在另一個實施方案中，所使用的核酸編碼調控劑，其是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失來得到)的人或小鼠IgGWi^c 區的變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。在別的實施方案中，所使用的核酸編碼調控劑，其是小鼠IgGl或人IgGl的Fc區、或人IgGl或小鼠IgGl的Fc區的非鉸鏈部分。 在又一個實施方案中，所使用的核酸編碼調控劑，其是人IgGl的Fc區、具有非功能性鉸鏈 (通過半胱氨酸殘基的取代或缺失來得到)的人IgGl的變體Fc區、或人IgGl的Fc區的非鉸鏈部分。對於免疫球蛋白的Fc區的片段，編碼調控劑的核酸可以至少編碼Fc區中限定被新生兒Fc受體(Fcfoi)結合的表位的胺基酸區段，而且可以進一步編碼與Fc區的鉸鏈部分對應的區段。或者，編碼調控劑的核酸可以至少編碼Fcfoi結合肽。不受限制，合適的Fcfoi 結合肽的例子包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO :24)，而且可以進一步包含選自下組的序歹Ij :HQSLGTQ(SEQ ID NO 25)、HQNLSDGK(SEQ ID NO 26)、HQNISDGK(SEQ ID NO 27)、或 VISSHLGQ(SEQ ID NO 28)(參見例如美國專利 No. 5，739，277)。在本發明的一個實施方案中，調控劑可以由如下的核酸序列編碼，所述核酸序列編碼與 SEQ ID NO :9 (人 IgGl 的 Fc 區)、SEQ ID NO :11 (人 IgG2 的 Fc 區)、SEQ ID NO 13 (人 IgG3 的 Fc 區)、SEQ ID NO :15(人 IgG4 的 Fc 區)、SEQ ID NO :29(小鼠 IgGl 的 Fc 區)、SEQ ID NO :17(人IgGl的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :19(人IgG2的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :21 (人IgG3的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :23 (人IgG4的 Fc區的非鉸鏈部分)、或SEQ ID NO :30(小鼠IgGl的Fc區的非鉸鏈部分)相同或共享至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、或至少約95 %胺基酸同一性的胺基酸序列。編碼上述之一的核酸的具體例子包括SEQ ID NO :8 (人IgGl的Fc區)、 SEQ ID NO 10 (人 IgG2 的 Fc 區)、SEQ ID NO 12 (人 IgG3 的 Fc 區)、SEQ ID NO 14 (人 IgG4 的 Fc 區)、SEQ ID NO :47 QjnIlIgGl 的 Fc 區)、SEQ ID NO :16(人 IgGl 的 Fc 區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :18 (人IgG2的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :20 (人IgG3的Fc 區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 22 (人IgG4的Fc區的非鉸鏈部分)、和SEQ ID NO 48 (小鼠IgGl的Fc區的非鉸鏈部分)。用於鑑定編碼調控劑的核酸的方法可以通過使用本文中所描述的方法來將其它多肽或蛋白質鑑定為合適的調控劑。 候選調控劑(例如，可以潛在地用於創建因子VIII融合基因和因子VIII融合蛋白的多肽) 包括那些已經顯示出通過與治療性蛋白質融合來延長非因子VIII治療性蛋白質或肽的血清半衰期的肽和蛋白質。例如，一種用於鑑定因子VIII蛋白的調控劑的方法是檢查包含調控劑的因子VIII融合異二聚體在血友病A動物模型諸如血友病A(HemA)小鼠中的藥動學。編碼調控劑的核酸的插入位點本發明的因子VIII融合基因包括編碼調控劑的核酸。可以將編碼調控劑的核酸插入因子VIII基因的B域部分內。例如，可以在插入編碼調控劑的核酸前或後，至少缺失編碼因子VIII基因的B域的核酸的一部分(例如至少缺失編碼N-745至S-1637的B域部分的因子VIII基因的一部分)。或者，可以使用位點特異性重組來同時插入編碼調控劑的核酸並缺失B域區編碼核酸的一部分。用於實現插入、缺失、和位點特異性重組的重組方法是本領域中公知的。在一個實施方案中，因子VIII融合基因包含編碼因子VI11融合蛋白的核酸序列， 其中因子VIII融合蛋白包含因子VIII蛋白，其中調控劑的胺基酸序列存在於B域中，或者用調控劑的胺基酸序列替換B域的一些或所有胺基酸序列。在第二個實施方案中，因子 VIII融合基因包含編碼因子VIII融合蛋白的核酸序列，所述因子VIII融合蛋白包含與SEQ ID NOS :1或5之任一項的胺基酸20-764對應的第一胺基酸序列、與SEQ ID NOS :1或5之任一項的胺基酸1656-2351對應的第二胺基酸序列、和調控劑胺基酸序列，其中半衰期調控劑胺基酸序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接於所述第二胺基酸的氨基端。在分泌前，B域在Arg1648 (即，B_a3連接)處切割，並且在B域中，主要在Arg1313後可變切割(參見例如 Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29 11-22，2003)。如此，熟練技術人員應當認可，對於B域區中的插入、缺失和/或取代，應當維持存在於B-a3域連接處的切割位點以將因子VIII融合蛋白適當翻譯後加工成因子VIII融合異二聚體。同樣地，對於在B域區中的插入，應當將編碼調控劑的核酸在編碼B域的核酸內在編碼Arg1313的核酸5』 的位點處插入；或者，可以將B域內的切割位點(除B-a3連接處的切割位點外)突變以阻止在因子VIII融合蛋白的翻譯後加工過程中調控劑從N端(重鏈)部分的切割(並且因此分離)。已知a2_B域連接處的切割對於產生因子VIII的輔因子活性不是至關重要的 (Pittman 等，PNAS 85 :2429-2433,1988)。在人因子 VIII 中，a2_B 域連接存在於 Arg740 處。 本發明的因子VIII融合基因包括編碼在a2-B域連接處經歷切割的因子VIII融合蛋白的基因及編碼在a2-B域連接處具有阻止切割的胺基酸修飾的因子VIII融合蛋白的基因。舉例而言，可以將a2-B域連接切割位點完整保留，因為在激活本發明的因子VIII融合異二聚體後在此連接處的切割導致形成與在激活衍生因子VIII融合異二聚體的因子VIII蛋白後生成的因子VIIIa蛋白相同的因子VIIIa蛋白(並且因此具有與其相同的生物學活性)。本領域技術人員應當領會，若因子VIII融合異二聚體中在a2_B域連接處的切割程度或速率小於在其來源的因子VIII蛋白中看到的，則最有可能是由於調控劑的位阻。如此，可以期望包括在a2_B域連接與半衰期調控劑之間的肽接頭(即間隔物)形成中的額外胺基酸諸如肽接頭 DDDDK (SEQ ID NO 49)和 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO :50)。編碼同-或異-多聚化序列的核酸的選擇和插入位點任選地，本發明的因子VIII融合基因包括與編碼調控劑的核酸不同的編碼同-或異-多聚化序列的核酸。可以期望納入編碼同-或異-多聚化序列的核酸以在第一因子 VIII融合異二聚體中採用的調控劑不能介導與存在於第二因子VIII融合異二聚體中的調控劑的同源或異源部分的非共價或共價關聯時生成多聚因子VIII融合異二聚體。或者，可以期望納入編碼同-或異-多聚化序列的核酸以在第一因子VIII融合異二聚體中採用的調控劑由單一多肽組成時生成雜合因子VIII融合異二聚體。如本領域技術人員應當領會，會通過所利用的特定多聚化方法來規定編碼同-或異-多聚化序列的核酸的選擇。可以將下列非限制性參考文獻中教導的用於生成多聚體多肽的通用方法中所採用的編碼同-或異-多聚化序列的核酸序列摻入本發明的因子VIII 融合基因中美國專利申請公開文本No. 2007/0287170 ；美國專利No. 7，183,076中所披露的「多聚化域」方法，例如那些採用免疫球蛋白模塊的；使用Fos和Jim亮氨酸拉鏈，如美國專利No. 5，932，448中所採用的；及美國專利No. 6，833，441中所採用的「異二聚體化序列」 方法；及美國專利No. 5，807，706中所描述的「凸出-進入-空穴」方法。熟練技術人員應當領會，可以需要獨特的第二因子VIII融合基因以在第一因子 VIII融合基因僅含有異-多聚化序列時生成多聚體因子VIII融合異二聚體或雜合因子 VIII融合異二聚體。例如，熟練技術人員應當認可，為了利用美國專利No. 5，807，706中所描述的「凸出-進入-空穴」方法，會需要兩種因子VIII融合基因，其各自包含獨特的異-多聚化序列。熟練技術人員應當認可，因子VIII融合基因內編碼同-或異-多聚化序列的核酸可以位於因子VIII融合基因內在調控劑的5』(表達時關係為N-端)或3』(S卩，表達時關係為C-端)，只要其位置不幹擾在其它情況中是因子VIII融合異二聚體形成所需要的轉錄、翻譯、或翻譯後修飾。可以至少將編碼多聚化序列的核酸，如編碼調控劑的核酸插入編碼B域的因子VIII基因區域的一部分內或替換編碼B域的因子VIII基因區域的一部分。表達盒和表達載體本發明的又一方面涉及包含因子VIII融合基因的表達盒或表達載體。對於包含因子VIII融合基因的表達盒的重組生成，將因子VIII融合基因分離，並與啟動子可操作連接。任選地，可以將因子VIII融合基因與轉錄終止信號、編碼信號肽的核酸、或其它影響基因表達或翻譯後加工的核酸序列(例如常規定位的限制性位點、增強子、分泌前導序列等)進一步可操作連接。若表達盒的期望的構件(與因子VIII融合基因不同)已經包含在可複製的克隆載體或表達載體內，則僅需要通過本領域中公知的重組技術將因子VIII 融合基因在合適的位置中可操作插入。許多克隆載體是商品化的，而且一般包括下列一種或多種信號序列、複製起點、增強子元件、啟動子、轉錄終止序列、和一種或多種選擇基因或標誌物。許多表達載體也是商品化的，並且可以使用本領域中公知的方法和試劑來實現因子VIII融合基因的插入(參見例如Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Press, NY(1989) ；Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, New York, N. Y. John Wiley & Sons (1989)。表達載體的選擇會
19取決於優選的轉化技術和供轉化用的靶宿主。可用於本發明的表達載體包括但不限於染色體、附加體、和病毒來源的載體， 例如源自細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件(bacteriophages，yeast episomes)、病毒諸如杆狀病毒、乳多泡病毒、痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病病毒 (baculoviruses,papova viruses,vaccinia viruses, adenoviruses,fowl pox viruses, pseudorabies viruses)和逆轉錄病毒的載體，和源自其組合的載體，諸如粘粒和噬菌粒。適合於在動物細胞中重組表達的病毒載體是本領域中公知的(參見例如美國專利 No. 5，871，986 和 6，448，046)。適合於實施本發明的載體包括但不限於下列病毒載體諸如lambda載體系統 gtll、gtffES. tB、Charon 4、和質粒載體諸如 pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、 pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-或 KS+/"(Stratagene, LaJoIIa, CA)、pQE、pIH821、pGEX、pET 系列(Studier 等，Methods Enzymo 1. 185 :60_89，1990)、及其任何衍生物。合適於在細菌中使用的載體包括pQE70、 pQE60、禾口 pQE_9 (Qiagen, Valencia, CA) ；pBS 載體、Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、禾Π pNH46A (Stratagene, LaJoIIa, CA) ；pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA)；禾口 pGEX、ptrxfus、ptrc99a、pET_5、pET_9、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、 和 pRIT5。合適的真核載體是 pWLNEO、PSV2CAT、pOG44、pXTl、pBK、禾口 pSG(Stratagene， La Jo 11 a, CA)；和pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL。其它合適的載體會是熟練技術人員容易顯而易見的。使用包含編碼合適的標誌物的基因的表達載體，所述標誌物賦予可選擇表型，諸如藥物抗性、營養營養缺陷型、對細胞毒劑的抗性或表面蛋白的表達。可以使用的選擇標誌基因的例子包括neo、gpt、dhfr、ada、pac (嘌呤黴素)、hyg、和hisD。可以通過本領域中公知的重組技術來容易地測定因子VIII融合基因的成功連接 (或插入載體中)(例如使用常規的規程來分離並測序或者使用能夠特異性結合連接位點的寡核苷酸探針)。宿主細胞本發明的又一方面涉及包含因子VIII融合基因的宿主細胞。因子VIII融合基因可以存在於克隆載體、表達載體內，或者在宿主細胞基因組中整合。在一個實施方案中，宿主細胞以穩定的質粒或以對宿主細胞基因組的穩定插入或整合形式含有DNA分子形式的必需的核酸構建體。在另一個實施方案中，宿主細胞可以含有表達系統中的DNA分子。在一個實施方案中，將本發明的因子VIII融合基因以有義方向摻入合適的載體中，從而將可讀框適當定向以在選定的啟動子的控制下表達編碼的蛋白質。這牽涉將合適的調節元件納入表達載體中。這些可以包括例如，載體的非翻譯區、有用的啟動子、和5』和 3』非翻譯區，其與宿主細胞蛋白質相互作用以實施轉錄和翻譯。此類元件在其強度和特異性方面可以有所變化。根據所利用的載體系統和宿主，可以使用許多合適的轉錄和翻譯元件，包括組成性和誘導型啟動子。組成性啟動子是在生物體的整個發育和生命中指導基因表達的啟動子。誘導型啟動子是能夠響應誘導物而直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因轉錄的啟動子。在沒有誘導物的情況中，不會轉錄DNA序列或基因。本發明的表達載體還可以包含與編碼選定的蛋白質的DNA分子可操作連接的可操作的3』調節區，其選自那些能夠提供正確轉錄終止和在選定的宿主細胞中表達的mRNA 的多腺苷酸化的調節區。為了在宿主細胞中重組生成因子VIII融合異二聚體，可以將因子VIII融合基因摻入宿主細胞中。可以使用本領域中公知的重組技術經由例如轉化、轉導、接合、轉移 (mobilization)、或電穿孔來將克隆載體、表達載體和質粒導入細胞中。宿主細胞可以包括但不限於哺乳動物細胞、細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞(例如Sf9細胞)、真菌細胞、酵母細胞(例如酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces))、植物細胞(例如擬南芥屬(Arabidopsis)或菸草細胞)、或藻細胞。適合於實施本發明的哺乳動物細胞包括但不限於COS(例如ATCC No. CRL 1650或 1651)、幼侖鼠腎(「BHK」)(例如 ATCC No. CRL 6281)、中國倉鼠卵巢(「CHO」)(ATCC No. CCL 61)、HeLa(例如ATCC No. CCL 2)、293(ATCC No. 1573)、NS0骨髓瘤、CH0P、NS_1、和HKBll (參見例如美國專利No. 6，136，599)。適合於在哺乳動物細胞中指導表達的表達載體一般包含啟動子及本領域中已知的其它轉錄和翻譯控制序列。常見的啟動子包括SV40、MMTV、金屬硫蛋白-1、腺病毒Ela、 CMV、立即早期、免疫球蛋白重鏈啟動子和增強子、和RSV-LTR。本領域技術人員可以基於其作為啟動子的強度來容易地選擇合適的哺乳動物啟動子。或者，在期望特定蛋白質的表達或阻抑時，可以為了控制而採用誘導型啟動子。本領域技術人員可以容易地從本領域中已知的啟動子選擇合適的誘導型哺乳動物啟動子。不論為了本發明的因子VIII融合異二聚體的重組生成而選擇的宿主細胞，可以通過用更常見的密碼子替換因子VIII融合基因中的不常見密碼子來實現蛋白質表達的升高(參見例如美國專利No. 6，924，365)。熟練技術人員應當領會，決定特定的因子VIII融合基因密碼子是否「不常見」或「常見」取決於為重組生成而選擇的宿主細胞的特定密碼子選擇。因子VIII融合蛋白和異二聚體的生成鑑於本文中所討論的重組技術，本發明的另一方面涉及生成本發明的因子VIII 融合異二聚體的方法。此方法牽涉在宿主細胞表達因子VIII融合蛋白的條件下培養本發明的宿主細胞。在因子VIII融合蛋白的翻譯後修飾後，然後可以將重組因子VIII融合異二聚體純化並分離。本發明的一個方面是用於生成因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的方法，包括(a)提供經編碼因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的表達載體轉化的宿主細胞；(b)培養細胞；並(C)分離因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體。在又一個實施方案中，宿主細胞可以是哺乳動物細胞，並且調控劑的胺基酸序列可以是糖基化的。關於多聚體因子VIII融合異二聚體的重組生成，熟練技術人員應當領會，同-多聚體形式可以通過單一重組宿主細胞生成，而異-多聚體形式可以通過在單一宿主細胞內的共表達或在多個宿主細胞中分開表達(在相同或不同細胞培養系統中)來生成。與異-多聚體形式相似，熟練技術人員應當領會，雜合因子VIII融合異二聚體可以通過在單一宿主細胞內的共表達或在多個宿主細胞中分開表達(在相同或不同細胞培養系統中)來生成。在利用不同培養系統的情況中，可以將來自每種培養物的重組蛋白質產物分離，然後使用本領域中公知的標準技術來再結合。對於多聚體因子VIII融合異二聚體和雜合因子VIII融合異二聚體的重組生成，可以選擇能夠以期望的方式裝配多聚體或雜合因子VIII 融合異二聚體的鏈的宿主細胞。作為共表達不同基因的備選，可以生成編碼所有需要的多肽鏈的單順反子基因。 關於可以如何設計此類基因的具體例子，參見下文實施例5。可以以基本上純的形式生成重組因子VIII融合異二聚體。可以使用本領域中公知的方法來純化並鑑定純化的因子VIII融合異二聚體。藥物組合物本發明的另一方面涉及包含因子VIII融合異二聚體和藥學可接受載體的藥物組合物。藥學可接受載體是可以添加至活性成分以幫助配製或穩定化製備物，而且不對患者引起顯著不利的毒物學效果的物質。此類載體的例子是本領域技術人員公知的，並且包括水、糖諸如麥芽糖或蔗糖、清蛋白、鹽諸如氯化鈉等。其它載體記載於例如E.W.Martin的 Remington's Pharmaceutical Sciences。此類組合物會含有有效量的至少一種因子VIII 融合異二聚體。藥學可接受載體包括無菌水溶液或分散體和和供即時製備無菌可注射溶液或分散體用的無菌粉劑。對藥學活性物質使用此類介質和藥劑是本領域中已知的。優選地， 組合物配製用於胃腸外注射。組合物可以配製為溶液、微乳、脂質體、或其它適合於高藥物濃度的有序結構。載體可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇等)、及其合適的混合物。組合物可以包含等張劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。因子VIII的藥物組合物的例子披露於例如美國專利 No. 5，047，249 ；5，656，289 ；5，665，700 ；5，690，954 ；5，733，873 ；5，919，766 ；5，925，739 ； 6，835，372 ；及 7，087，723。可以如下製備無菌可注射溶液，即根據需要在具有上文所列舉的一種成分或成分組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物，接著無菌微濾。一般而言，通過將活性化合物摻入無菌媒介中來製備分散體，所述無菌媒介含有基礎分散介質及需要的其它成分。在供製備無菌可注射溶液用的無菌粉劑的情況中，製備方法包括自其先前無菌過濾的溶液產生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)。治療方法本發明的另一方面涉及一種治療遺傳性和獲得性凝固缺陷諸如血友病(例如血友病A)的方法。此方法牽涉對展現出血友病A的患者施用有效量的本發明的因子VIII融合異二聚體(包括雜合或多聚體形式)，由此患者在血管損傷後展現出有效的血液凝固。因子VIII融合異二聚體的合適的有效量包括但不限於約10-約50個國際單位/kg體重。患者可以是任何哺乳動物(例如人)。可以靜脈內、皮下、或肌肉內施用本發明的因子VIII融合異二聚體。某些調控劑可以容許口服施用。可以使用本發明的因子VIII融合異二聚體來在具有和沒有抑制性抗體的血友病患者中及在由於形成抑制性抗體而患有獲得性因子VIII缺陷的患者中治療由於因子VIII 缺陷所致的不受控制的出血(例如動脈內、顱內、或胃腸出血)的方法。在一個實施方案中， 依照輸注人或動物因子VIII使用的相同規程來將單獨的或藥物組合物形式(即與穩定劑、 投遞媒介、和/或載體組合)的因子VIII融合異二聚體靜脈內輸注到患者中。
或者/另外，可以通過施用包含因子VIII融合基因表達構建體的病毒載體諸如腺伴隨病毒(參見例如Gnatenko等，Br. J. Haematol. 104 =27-36,1999)，或者通過移植遺傳工程化改造成生成因子VIII融合異二聚體的細胞通常經由植入含有此類細胞的裝置來施用因子VIII融合異二聚體。此類移植可以牽涉使用重組皮膚成纖維細胞(參見例如Roth等，New Engl. J. Med. 344 1735-1742, 2001)；骨髓基質細胞(參見例如美國專利 No. 6，991，787)、或造血祖宿主細胞(參見例如美國專利No. 7，198，950)。適合於在血友病A基因療法(使用編碼因子VIII的核酸進行)的病毒載體及其在基因療法中的用途是本領域中已知的(參見例如美國專利No. 6，200，560 ；6，544，771 ；6，649，375 ；6，697，669 ； 6，773，709 ；6，797，505 ；6，808，905 ；6，818，439 ；6，897，045 ；6，939，862 ；7，198，950 ；及 7，238，346)。應當對需要此類治療的患者施用的因子VIII融合異二聚體的治療劑量會隨因子 VIII缺陷的嚴重程度而有所變化。一般而言，與每名患者的出血事件的嚴重程度和持續時間一致地在頻率、持續時間、和單位上調節劑量水平。因此，因子VIII融合異二聚體可以以足以對患者投遞治療有效量的蛋白質以使出血停止的量包含在藥學可接受載體、投遞媒介、或穩定劑中，如通過標準的凝固測定法所測量的。通常，要經由施用因子VIII融合異二聚體在患者中達到的期望的血漿因子VIII 活性水平範圍為正常水平的30-100%。在一個實施方案中，可以以範圍為約5至約50個單位/kg體重、範圍為約10至約50個單位/kg體重的劑量，並且以約20至約40個單位/ kg體重的劑量靜脈內給予治療性因子VIII融合異二聚體的施用；時間間隔頻率範圍可以為8至對小時(在嚴重受累的血友病患者中)；並且按天計的治療持續時間範圍可以是 1-10天或者直至解決出血事件或者因子VIII融合異二聚體的施用可以是預防性的(參見例如 Roberts 等，第 1453 頁-第 1474 頁，第 1460 頁，於 Hematology，Williams，W. J.等編 (1990))。與在用人或血漿來源因子VIII治療中一樣，可以通過一階段因子VIII凝固測定法來限定輸注的治療性重組因子VIII的量，並且在選定的情況中，可以通過測量輸注後的患者血漿中的因子VIII來測定體內回收。應當理解，對於任何特定的患者，應當依照個體需要和施用或監督組合物的施用的人的專業判斷隨時間調節特定的劑量方案，並且本文中所列的濃度範圍僅是例示性的，並且不意圖限制所要求保護的因子VIII融合異二聚體的範圍或實施。根據需要，治療可以採用單次施用或在延長的一段時間裡的周期性或連續施用的形式，或者可以為了預防性目的而施用治療。與其來源的因子VIII蛋白相比，本發明的因子VIII融合異二聚體展現出延長的循環半衰期。具有更大的循環半衰期的因子VIII蛋白可用於治療血友病，因為會需要不太頻繁的劑量給藥以改正患者的因子VIII缺陷。此施用簡易性的升高可以改善治療方案的患者順從性，並且由此降低凝固病症的症狀。還有，因為施用較少的抗原，預期降低的施用頻率降低形成對因子VIII的免疫應答的可能性。上述公開內容一般描述了本發明。可以通過參考以下實施例來獲得更完整的理解，所述實施例僅為了例示而並不意圖限制本發明的範圍而提供。
實施例
為了本發明可以得到更好的理解，列出了以下實施例。這些實施例僅為了例示，而不應以任何方式解釋為限制本發明的範圍。通過提及而完整收錄本文中所提及的所有出版物。實施例1以下實施例描述了使用編碼因子VIII B域缺陷型(BDD)蛋白的核酸和編碼鼠Fc 區(稱為「mFc+鉸鏈」)的核酸來構建包含因子VIII融合基因(稱為「BDDmFc+鉸鏈」)的哺乳動物表達載體(稱為「ρΜΙΙΟ」或「pSK207BDDFc+鉸鏈」 )。BDDmFc+鉸鏈的重組表達導致因子VIII融合異二聚體(稱為「BDDFc+鉸鏈」)的生成，如圖2中所顯示的。由於存在功能性免疫球蛋白鉸鏈區，BDDFc+鉸鏈的兩個分子經由二硫化物鍵合來共價結合以形成多聚體因子VIII融合異二聚體。此型式的優點是二聚體Fc導致融合蛋白對Fcfoi的高親和力結合，導致循環半衰期延長。使用位點定向誘變試劑盒來突變質粒pSK207，其含有以RiieI和NheI位點為邊界的因子VIII B域缺陷型(BDD)基因(稱作「PSK207BDD」)。使用誘變引物CES16 (5』-caa tgccattgaacctaggagcttctcccagaacccaccagtccttaagcgccatcaacggg-3') (SEQ ID NO :34) 禾口 CES17 (5『-cccgttgatggcgcttaaggactggtgggttctgggagaagctcctaggttcaatggcattg-3『) (SEQ ID NO 35)來將兩個限制性位點(在bp 4490處的AvrII和在bp 4520處的AflII) 弓 I 入分子中。使用誘變寡聚物 CES 18 (5，-cagtggtcattacactcaagaacatggcttccca tcc_3，) (SEQ ID NO 36)禾口 CES19 (5，_gg￡itggg￡i￡igcc￡itgttcttg￡ig tgtaatgaccactg-3' ) (SEQ ID NO 37)來消除bp2537處的AflII位點。所得的質粒稱作pM109。這些誘變事件均是沉默的，未對BDD導致胺基酸變化。作為鼠Fc區的來源，使用含有針對人表皮生長因子受體的全長鼠 IgGl 抗體的質粒 pGT2!34。使用引物 CES 36 (5『-agcttcctaggagcttctcccagaacgtgccc agggattg tggttg-3') (SEQ ID NO 38)禾口 CES39(5，—agctacttaaggactggtgggttctgggattt accaggagagtgggagag-3，)(SEQ ID NO :39)用 pGT234作為模板來PCR擴增鼠Fc+鉸鏈部分。 將所得的片段用Aflll/Avrll消化，並克隆到經AfΙΙΙ/AvrII消化的pM109中以生成質粒 PM117。為了恢復bp2537處的初始4打11位點，在？] 117中插入pSK207+BDD的Nhel/Bglll 片段以替換其等同區，從而生成質粒pM115，其含有bp2537處的AflII位點。將pM115的 BDD. mFc+鉸鏈基因(包含在5077bp NheI/PmeI片段內)克隆到表達載體pSS207的RneI/ NheI位點中以生成質粒ρΜΙΙΟ或pSK207BDDFc+鉸鏈。pSK207BDDFc+鉸鏈的因子VIII融合基因構件(即BDDmFc+鉸鏈)具有核酸序列SEQ. ID NO :31。由BDDmFc+鉸鏈所編碼的蛋白質具有圖3中所顯示的結構域(其中小鼠Fc標示mFc+鉸鏈的位置)和SEQ. ID NO 32的胺基酸序列。實施例2以下實施例描述了使用編碼因子VIII B域缺失型(BDD)蛋白的核酸和幾乎編碼鼠Fc區的鉸鏈部分(稱為「mFc-鉸鏈」)的核酸來構建包含因子VIII融合基因(稱為 「BDDmFc-鉸鏈」)的哺乳動物表達載體(稱為「pM118」或「pSS207BDDFc_鉸鏈」)。BDDmFc-鉸鏈的重組表達導致因子VIII融合異二聚體(稱為「BDDFc-鉸鏈」)的生成，如圖2中所顯示的。由BDDmFc-鉸鏈編碼的蛋白質具有圖3中所顯示的結構域(其中「小鼠Fe」標示 mFc-鉸鏈的位置)和SEQ. ID NO 33的胺基酸序列。由於缺乏功能性免疫球蛋白鉸鏈區， BDDFc-鉸鏈不形成多聚體因子VIII融合異二聚體。此型式的缺點是非二聚化的Fc區具有
24降低的Fcfoi結合親和力。BDDmFc-鉸鏈的構建與BDDmFc+鉸鏈的上述構建非常相似。使用PCR引物CES 37 (5，-agcttcctaggagcttctccca gaacgtcccagaagtatcatctgtc-3，)(SEQ ID NO :40)和 CES39 (SEQ ID NO 39)來從質粒pGD34 PCR擴增mFc-鉸鏈區，將其用AvrII/Af III消化， 並克隆到經Avrll/Aflll消化的pM109質粒中。所得的質粒稱作pM114 (又稱作「pSK207. BDD. mFc-鉸鏈」)。然後，將含有BDD. mFc-鉸鏈基因的pM114的Nhel/Rnel片段克隆到表達載體pSS207中以生成質粒pM118 (即pS S207BDDFc-鉸鏈)。實施例3以下實施例描述了構建質粒(稱作「pM130」)以表達在其氨基端末端具有Flag標籤的鼠Fc區(稱作「mFc+鉸鏈」)。在同一宿主細胞中共表達此質粒與pSS207BDDFc+鉸鏈生成BDDFc+鉸鏈二聚體、mFc+鉸鏈二聚體、和BDDFc+鉸鏈和mFc+鉸鏈的異二聚體的混合物。納入Flag標籤便於在序貫分離步驟中使用抗Flag抗體和抗因子VIII抗體通過親和層析來分離異二聚體(稱為「BDDFc」)，如圖2中所顯示的。然而，本領域技術人員應當領會，即使沒有提供肽標籤，會有可能使用本領域中公知的技術，例如大小排阻層析來分離異二聚體形式。使用 ρΜΙΙΟ 作為模板,使用弓丨物 CES49(5，-atatgatatcgcggccgccgccaccatggtgt tgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggggactacaaagacgatgacgacaagg tgcccagggattgtggttg-3')(SEQ ID NO :41)禾口 CES 50(5' -ttcgatctcgagtcatttaccaggaga gtgggagagg-3' ) (SEQ ID NO :42)來PCR擴增在其5，(氨基端)末端具有Flag標籤的鼠 Fc區(具有鉸鏈)。將此片段用NotIAhoI消化，並連接到經NotIAhoI消化的表達載體 PAGE16，以生成質粒pM119 (即pAGE16. mFc+鉸鏈· Flag)。隨後，將含有mFc+鉸鏈· Flag區的pM119的Hindlll/Xhol片段亞克隆到經Hindlll/Xhol消化的表達質粒pEAK flCMV W/ GFP中，並稱作pM130。實施例4以下實施例描述了使用編碼因子VIII B域缺失型(BDD)蛋白的核酸和編碼IgGl、 IgG2、IgG3、或IgG4的人Fc區之任一、或IgGU IgG2、IgG3、或IgG4的人Fc區的非鉸鏈部分之任一的核酸來構建因子VIII融合基因(稱為「BDD.人Fe」)。舉例而言，可以通過將源自IgGl Fc的227個胺基酸殘基或214個胺基酸殘基插入因子FVIII的特定位點(例如在N-745和S-1637之間)以模擬B域來生成小鼠因子VIII融合異二聚體。BDD.人Fc(來自IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4抗體)表達載體的構建遵循與BDD-鼠 Fc表達構建體的上述策略相同的策略。將pM109質粒用Avrll/Aflll消化，並將以AvrII/ AflII為邊界的Fc+鉸鏈和Fc-鉸鏈插入相應的位點中。然後，將所得的質粒(其具有pSK 主鏈)用NheI和RiieI消化，並將BDDFc片段連接到pSS207以創建穩定的細胞克隆。類似地，構建PCEP4.人Fc單體質粒。例示性的人IgG Fc區核酸編碼序列包括SEQ ID NO :8 (人IgGl的Fc區)、SEQ ID NO :10(人 IgG2 的 Fc 區)、SEQ ID NO :12(人 IgG3 的 Fc 區)、禾口 SEQ IDNO :14(人 IgG4 的 Fc區)。或者，可以使用編碼與SEQ ID NO :9(人IgGl的Fc區)、SEQ ID NO :11(人IgG2 的 Fc 區)、SEQ ID NO :13(人 IgG3 的 Fc 區)、和 SEQ ID NO :15 (人 IgG4 的 Fc 區)相同的胺基酸序列(或具有至少90%同一性的胺基酸序列)的核酸序列。例示性非鉸鏈部分人IgG Fc區核酸編碼序列包括SEQ ID NO 16 (人IgGl的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 18 (人IgG2的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 20 (人IgG3的Fc區的非鉸鏈部分)、和 SEQ ID而22(人1864的？(區的非鉸鏈部分)。或者，可以使用編碼與SEQ ID NO :17(人 IgGl的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :19 (人IgG2的Fc區的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 21 (人IgG3的Fc區的非鉸鏈部分)、和SEQ ID NO 23 (人IgG4的Fc區的非鉸鏈部分)相同的胺基酸序列(或具有至少90%同一性的胺基酸序列)的核酸序列。實施例5以下實施例描述了編碼雜合因子VIII融合異二聚體的單順反子因子VIII融合基因的構建。翻譯的因子VIII融合蛋白含有替換全長FVIII的B域的兩個串聯的mFc+鉸鏈區。如下構建表達質粒使用pM117(pSK207+BDD.mFc+鉸鏈)作為模板，用兩組寡聚物的 PCR 來進行第一組是 CES36/CES51，其創建以 AvrII (CES36 :5，-agcttcctaggagcttctcc cagaacgtgcccagggattgtggttg-3『) (SEQ ID NO :30)禾口 SacII(CES51 :5'-cagttgccgcgggct ttaccaggagagtgggagagg-3，)(SEQ ID NO :35)為邊界的 mFc 片段，而第二組引物是 CES52/ CES39, ^^lJMlii, SacII (CES52 5' -ttcgcccgcggcaagagagactacaaagacgatgacgacaaggtgcc cagggattgtggttg-3，)(SEQ ID NO :35)禾口AflII(CES39 :5，_agctacttaaggactggtgggttctgg gatttaccaggagagtgggagag-3，)(SEQ ID NO 31)為邊界的mFc片段。在適當消化並連接時， 這兩個所得的PCR片段給出單順反子BDD基因，其按次序含有Al、al、A2、a2域、B域的前 5個N端胺基酸、然後是mFc+鉸鏈區、弗林蛋白酶(furin)共有序列(KARGKR(SEQ ID NO 36)，其中第一個賴氨酸(K)是 Fc 區的末端)、Flag 標籤(DYKDDDDK) (SEQ ID NO 37) ,mFc+ 鉸鏈、B域的最後12個C端胺基酸、和最後FVIII的a3、A3、Cl和C2域(圖4)。為了構建上述單體基因，將兩個PCR片段用Avrll/SacII或SacII/Aflll消化，並經由三重連接，將其克隆入經Avrll/Aflll消化的pM109(pSK207.BDD)中。將成功的克隆測序，然後將一個從 (pM109的)pSK207主鏈經由Nhel/Pmel克隆到表達載體，即經Nhel/Pmel消化的pSK207。 在蛋白質的合成和分泌期間，最初在Flag-mFc區上遊的弗林蛋白酶位點處及剛好在a3上遊的蛋白酶位點處切割分子。分子會以成熟的FVIII 二聚體(其中用mFc替換B域)循環， 所述成熟的FVIII 二聚體具有經由Fc-Fc 二硫化物相互作用與FVIII分子的mFc區結合的 Flag mFc分子(BDDFc)，如圖2中所顯示的。使用本領域技術人員已知的方法來自存在於上清液中的任何同二聚體產物分離異二聚體產物。實施例6以下實施例描述了可用於瞬時轉染哺乳動物宿主細胞及其細胞培養的通用規程。 將HKBll細胞在軌道搖動器(100-125rpm)上在5% CO2培養箱中於37°C在無蛋白質培養基中以懸浮培養物培養，並以0. 25-1. 5x IO6個細胞/mL的密度維持。通過以1，OOOrpm離心5 分鐘來收集供轉染用的HKBll細胞，然後將其在Fre必tyle 293表達培養基anvitrogen Corporation，CarIskid，CA)中以1. Ix IO6個細胞/mL重懸。將細胞在6孔板中接種 (4. 6mL/孔)，並在軌道旋轉儀(125rpm)上在37°C CO2培養箱中溫育。對於每個孔，將5 μ g 質粒 DNA 與 0. 2ml Opti-MEM I 培養基(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)混合。 對於每個孔，將 7 μ 1 2931^(^in 試齊[J (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)與 0. 2ml. Opti-MEM I培養基溫和地混合，並於室溫溫育5分鐘。將稀釋的^3FeCtinTM添加至稀釋的DNA溶液，溫和地混合，於室溫溫育20-30分鐘，然後添加至已經用切IO6個(4. 6mL) HKBll細胞接種的每孔。然後，將細胞在軌道旋轉儀(125rpm)上在CO2培養箱中於37°C溫育3天，之後通過以IOOOrpm離心5分鐘來使細胞沉澱，然後收集上清液，並於_80°C貯存。實施例7以下實施例描述了可用於通過Western印跡來驗證因子VIII融合異二聚體的重組生成的通用規程。將細胞培養物上清液通過Centricon (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ)來濃縮10倍(此時不使用二抗來探查)或使用純的(此時使用二抗來探查)。將50 μ 1上清液與20 μ 1具有DTT(還原性)或沒有DTT(非還原性)的虹 SDS-PAGE上樣染料混合，於95°C加熱5分鐘，然後加載到10% NuPAGE 凝膠Gnvitrogen Corporation, Carlsbad, CA)上(在還原性條件下)或到 4-20 % NuPAGE 凝膠 (Bis-Tris-MOPs)上(在非還原性條件下)。將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜。在用5%乳/ PBS封閉60分鐘後，將膜與針對小鼠IgG(H+L)的經辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔多克隆抗體或綴合有HRP的抗因子VIII C域抗體一起溫育。還有，可以使用抗人因子VIII兔單克隆抗體(Epitomics，CA)來檢測因子VIII的輕鏈。然後，將膜與抗兔IgG-HRP 二抗於室溫一起溫育60分鐘。在用PBS/0. 1% Tween -20(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯) 清洗印跡後，使用化學發光底物(ECL) (Pierce, Rockford, IL)及暴露於χ-射線膠片來檢測來自HRP的信號。實施例8以下實施例描述了可用於通過ELISA來測量細胞培養物上清液中的因子VIII抗原濃度的通用規程。將細胞培養物上清液在PBS/BSA/Tween -20緩衝液中稀釋以達到標準曲線範圍內的信號。例如，可以使用在PBS/BSA/Tween -20中稀釋的純化的因子VIII BDD蛋白(比活性9，700個IU/mg)來創建lOOng/mL-O. 2ng/mL的標準曲線。將稀釋的樣品和標準品添加至用多克隆抗因子VIII捕捉抗體C2預包被的ELISA板。在添加生物素化的C2作為檢測抗體後，將平板於室溫溫育1小時，廣泛清洗，然後使用TMB底物(3，3』，5， 5』 -四甲基聯苯胺)來顯現，如由試劑盒製造商(Pierce，Rockford, IL)所描述的。可以 il!用 SpectraMax 讀ISi義(Spectra Max 340pc, MolecularDevices, Sunnyvale, CA) VX 450nM測量信號。將標準曲線擬合至四參數模型，並從曲線外推未知物的數值。作為上述規程(其對完整的因子VIII融合異二聚體不是特異的)的備選，使用利用抗因子VIII抗體作為捕捉抗體(或檢測抗體)和對半衰期調控劑特異性的抗體作為檢測抗體(或捕捉抗體)的ELISA測定法。實施例9以下實施例描述了可用於以96孔格式使用商業生色測定試劑盒(Coatest SP4 FVIII，Chromogenix, Lexington, ΜΑ)來測量細胞培養物上清液和純化的級分中的因子VIII融合異二聚體的活性的通用規程。將一式三份樣品在試劑盒測定緩衝液(50mM Tris, pH 7. 3,10mg/L ciprofloxin 和 1· 0% BSA)中稀釋至 25 μ 1，並添加至各孔。然後， 將50 μ L磷脂、因子IXa、因子X溶液添加至每孔，並於37°C在水平搖動器上溫育4分鐘。 將25μ1 CaCl2溶液Q5mM)立即添加至各孔，並以相同的方式溫育10分鐘。添加生色底物溶液(50yL/孔)，並如前述那樣將平板溫育10分鐘，之後通過添加25μ1 20%乙酸來使顏色顯現停止。在 96 孔讀板儀(SpectraMax 340pc，Molecular Devices, Sunnyvale,CA)上以405nm吸光度測量個別的孔。相對於範圍為在與未知物相同的緩衝液中稀釋的 500-0. 5mlU/mL純化的因子VIII B域缺失型(BDD)標準品定量因子VIII活性，並將其擬合至四參數模型。從Coates 和因子VIII ELISA的結果計算比活性(IU/mg FVIII)。實施例10以下實施例描述了可用於使用aPTT測定法來測量細胞培養物上清液和純化的級分中的因子VIII融合異二聚體的凝固活性的通用規程。可以使用因子VIII缺陷的人血漿中的aPTT測定法通過Electra 1800C自動化凝固分析儀(Beckman Coulter Inc., Fullerton,CA)來測定因子VIII凝固活性。簡言之，通過儀器創建凝固稀釋劑中的上清液樣品的三個稀釋物，然後將100 μ 1與100 μ 1因子VIII缺陷的血漿和100 μ 1自動化aPTT 試劑(兔腦磷脂和微粉化矽土，bioMerieux，Inc. , Durham, NC)混合。在添加100 μ 1 25mM CaCl2溶液後，記錄凝塊形成前時間。使用在ELISA測定法中用作標準品的相同的純化的因子VIII BDD的系列稀釋來對每次運行產生標準曲線。標準曲線是線性的，具有0.95或更好的相關係數，並用於測定未知樣品的因子VIII活性。實施例11以下實施例描述了使用實施例1和2中所描述的載體進行的細胞系的穩定轉染和創建。使用293 ^(^ ηΤΜ試劑用質粒DNA、pSK207BDDFc+鉸鏈、或pSK207BDDFc_鉸鏈轉染HKBll細胞，如實施例6中所描述的。將經轉染的細胞以多個稀釋(1 100 ；1 1000 ； 1 10, 000)分成100-mm培養皿，並在補充有5 % FBS和200 μ g/mL潮黴素Qnvitrogen Corporation, Carlsbad, CA)的DMEM-F12培養基中維持約2周。將個別的單集落挑出，並使用無菌克隆盤(Scienceware Bel-Art Products, Pequannock, NJ)來將其轉移到 6 孔板中。將超過50個用pSK207BDDFc+鉸鏈轉染的HKBll細胞克隆建立並儲存。如圖5中所顯示通過因子VIII活性測定法(上文所描述的Coatest⑧和aPTT測定法)，如圖6中所顯示通過因子VIII ELISA(上文所描述的)，及通過生長測定法來對這些克隆篩選因子VIII 融合異二聚體的高表達。圖6中顯示了具有最高表達水平的6個細胞系。BDDFc+鉸鏈的最高克隆，即克隆8在粘附培養時表達約1 μ g/mL融合蛋白。來自克隆8條件化培養基的 BDDFc+鉸鏈的比活性是約5，000-8, 000個IU/mg，這與其來源的BDD因子VIII蛋白相當。 使用相似的穩定轉染和選擇規程，BDDFc-鉸鏈的克隆(克隆t)測定為在粘附培養時表達約1 μ g/mL融合蛋白。實施例12以下實施例描述了使用 10L WAVE 生物反應器 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 來放大穩定轉化子的蛋白質表達。將克隆8和克隆t細胞在補充有5% FBS和200 μ g/mL 潮黴素的DMEM-F12培養基中維持。將細胞每3天以1 4從T75分到T225燒瓶。對於細胞適應，將來自12個T225燒瓶的約10億個細胞轉移到2L或3L-Erlenmyer燒瓶中無血清的補充有2. 5% FBS的IL懸浮培養基中。2天後，將細胞擴充到補充有1. 25% FBS的無血清懸浮培養基中。然後，將細胞轉移到補充有5%人血漿蛋白質溶液(HPPQ的無血清懸浮培養基中。將約100-150億個細胞以約1百萬/ml的密度在10L WAVE生物反應器 袋中在培養基中接種。3天後，細胞密度已經達到5-6百萬/mL，並收穫條件化培養基。首先，通過用 Contifuge Stratos (Thermo Fisher Scientific, ffaltham, MA)以 6，OOOrpm 且以 150mL/分鐘的流速(如由蠕動泵控制的)的連續離心來將粗培養基澄清以除去細胞碎片。將澄清的培養基與Triton X-100 (聚乙二醇叔-辛基苯基醚)(多至0. 05% )混合，並通過在IOkDa Pellicon切向流膜(Millipore,Billerica,MA)上的超濾來將其濃縮約10倍。 將蔗糖添加至濃縮物至1%，之後於_80°C冷凍。純化前的重組生成的因子VIII融合異二聚體的比活性測定為對於由克隆8生成的BDDFc+鉸鏈為10，629個IU/mg，及由克隆t所生成的BDDFc-鉸鏈為11，122個IU/mg。實施例13以下實施例描述了從克隆8的放大培養物純化因子VIII融合異二聚體。使用抗因子VIII單克隆抗體親和柱(C7F7)，接著用陰離子交換Q-kpharose 柱(GE Healthcare, Piscataway，NJ)來從HKB 11細胞條件化培養基純化因子VIIIBDDFc+鉸鏈。總回收率接近30%。將來自IOL WAVE生物反應器""袋的冷凍濃縮物融化，並使用AKTA 純化儀系統(Amersham Pharmacia, Uppsala, SW)以ImL/分鐘加載到免疫親和柱上，然後用緩衝液 (20mM咪唑、0. OlM CaCl2、0. 5M NaCl、0. 01 % Tween -80 (聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)，pH 7.0)洗柱。用含有1.0M CaCl2的緩衝液洗脫結合的因子VIII BDDFc+鉸鏈。通過 Coatest 測定法來對級分測定因子VIII活性，並將活性級分合併，在HiTrapTM26/10脫鹽柱G25M(Amersham Biosciences, Uppsala, Sff)上緩衝液更換成離子交換上樣緩衝液QOmM 咪唑、IOmM CaCl2,200mM NaCl、0. 01% Tween _80，pH 7· 0)。將蛋白質加載到 Iml Hi Trap Q HP 柱(Amersham Biosciences, Uppsala, Sff)上，並用 NaCl 梯度 QOOmM-lOOOmM)洗脫。 通過Coatest 測定法來對級分測定因子VIII活性，並合併峰級分。測定蛋白質濃度和比活性。最好的級分(即，圖7的第8道中的級分5)的純度是約80%，如通過SDS-PAGE和 SimplyBlue 染色anvitrogen，Carl skid，CA)所評估的。純化的融合蛋白含有Fc域，因為它們在Western印跡分析中通過抗Fc抗體檢出。純化的材料的比活性是約10，000個IU/ mg。此比活性與因子VIII BDD (其衍生BDDFc+鉸鏈)非常相當，這提示了 BDDFc+鉸鏈是完全活性的。實施例14以下實施例描述了對重組生成的因子VIII融合異二聚體的內毒素測試。使用動力學生色鱟阿米巴狀細胞溶胞物測定法(Endosafe 試劑盒)以0. 005個EU/mL的靈敏度測定純化的蛋白質溶液的內毒素水平。發現BDDFc+鉸鏈中的內毒素水平是1. 3-2. 0個EU/ mL，其剛好在5個EU/劑下。實施例15以下實施例描述了使用純化的BDDFc+鉸鏈、純化的BDDFc-鉸鏈、和衍生這些因子 VIII融合異二聚體的因子VIII蛋白(「BDD-FVIII」)進行的正常小鼠中的藥動學研究。 以50 μ g/kg體重給正常的C57雄性小鼠靜脈內注射單劑BDD和融合蛋白(BDDFc+鉸鏈或 BDDFc-鉸鏈)。在注射後的 t = 0,0. 083,0. 5、2、4、6、8、24、28、32、48、和 72 小時時收集血液樣品(每個時間點5隻小鼠)。對於藥動學分析，測定血液樣品中的蛋白質水平(通過抗原ELISA)和凝固活性(通過Coatest 測定法)兩者。表1中報告了結果。表1
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權利要求
1.一種包含因子VIII蛋白或多肽的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中調控劑的胺基酸序列存在於B域中，或者用調控劑的胺基酸序列替換B域的一些或所有胺基酸序列。
2.權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是半衰期調控劑。
3.權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑的胺基酸是糖基化的。
4.權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是免疫球蛋白的Fc區或其變體，或Fcfoi結合肽或其變體。
5.權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM或其變體、或小鼠IgG、IgA、IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區或其變體。
6.權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述因子VIII蛋白或多肽缺失一些或整個所述B域。
7.權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其包含與SEQID NO=I 的胺基酸20-764相同的第一胺基酸序列、與SEQ ID NO :1的胺基酸1656-2351相同的第二胺基酸序列和調控劑胺基酸序列，其中(1)所述調控劑胺基酸序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接於所述第二胺基酸的氨基端或(2) 所述調控劑胺基酸序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且所述調控劑胺基酸序列不共價附接於所述第二胺基酸序列。
8.權利要求6的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是免疫球蛋白的Fc區或其變體，或Fcfoi結合肽或其變體。
9.權利要求6的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區或其變體。
10.編碼因子VIII融合蛋白的核酸，其中所述因子VIII融合蛋白包含因子VIII蛋白， 其中調控劑的胺基酸序列存在於B域中，或者用調控劑的胺基酸序列替換B域的一些或所有胺基酸序列。
11.權利要求10的核酸，其中所述調控劑是免疫球蛋白的Fc區或其變體，或Fcfoi結合肽或其變體。
12.權利要求10的核酸，其中所述調控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、 IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區或其變體。
13.權利要求10的核酸，其中所述因子VIII蛋白缺失一些或整個B域。
14.權利要求10的核酸，其中所述因子VIII融合蛋白包含與SEQID NO 1的胺基酸 20-764相同的第一胺基酸序列、與SEQ ID NO :1的胺基酸1656-2351相同的第二胺基酸序列和調控劑胺基酸序列，其中所述調控劑胺基酸序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接於所述第二胺基酸的氨基端。
15.權利要求14的核酸，其中所述調控劑是免疫球蛋白的Fc區或其變體，或Fcfoi結合肽或其變體。
16.權利要求15的核酸，其中所述調控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區或其變體。
17.包含權利要求10的核酸的載體。
18.包含權利要求10的核酸的宿主細胞。
19.用於生成權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的方法，包括(a)提供經編碼因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的表達載體轉化的宿主細胞；(b)培養該細胞；並(c)分離所述因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體。
20.權利要求19的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物宿主細胞，且所述調控劑的胺基酸序列是糖基化的。
21.權利要求19的方法，其中所述調控劑是免疫球蛋白的Fc區或其變體，或Fcfoi結合肽或其變體。
22.權利要求19的方法，其中所述因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體包含與SEQ ID NO :1的胺基酸20-764相同的第一胺基酸序列、與SEQ ID N0:1的胺基酸 1656-2351相同的第二胺基酸序列和調控劑胺基酸序列，其中(1)所述調控劑胺基酸序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接於所述第二胺基酸的氨基端或( 所述調控劑胺基酸序列在其氨基端共價附接於所述第一胺基酸序列的羧基端，且所述調控劑胺基酸序列不共價附接於所述第二胺基酸序列。
23.藥物組合物，其包含權利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體和藥學可接受載體。
24.治療遺傳性和獲得性凝固缺陷的方法，包括對有此需要的患者施用治療有效量的權利要求23的藥物組合物。
25.權利要求M的方法，其中所述遺傳性和獲得性凝固缺陷是血友病A。
26.權利要求5的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
27.權利要求沈的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO: 9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%胺基酸同一性的序列。
28.權利要求9的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
29.權利要求觀的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO: 9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%胺基酸同一性的序列。
30.權利要求12的核酸，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
31.權利要求30的核酸，其中所述調控劑具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%胺基酸同一性的序列。
32.權利要求16的核酸，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
33.權利要求32的核酸，其中所述調控劑具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%胺基酸同一性的序列。
34.包含權利要求31的核酸的載體。
35.包含權利要求31的核酸的宿主細胞。
36.包含權利要求33的核酸的載體。
37.包含權利要求33的核酸的宿主細胞。
38.權利要求21的方法，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
39.權利要求38的方法，其中所述調控劑具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%胺基酸同一性的序列。
40.權利要求21的方法，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
41.權利要求22的方法，其中所述調控劑是人或小鼠IgG的Fc區、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區的變體、 或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
42.權利要求40的方法，其中所述調控劑具有選自下組的胺基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%胺基酸同一性的序列。權利要求20的方法，其中所述調控劑是人或小鼠IgG 的Fc區、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區的變體、或人或小鼠IgG的Fc區的非鉸鏈部分。
43.權利要求3-8中任一項的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調控劑是半衰期調控劑。
44.權利要求10的核酸，其中所述調控劑是半衰期調控劑。
45.權利要求19的方法，其中所述調控劑是半衰期調控劑。
全文摘要
公開了一種包含因子VIII的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中調控劑的胺基酸序列存在於B域中，或用調控劑的胺基酸序列替換B域的一些或所有胺基酸序列。還公開了編碼發明性融合蛋白和融合異二聚體的核酸，也公開了用於生成融合蛋白和融合異二聚體、藥物組合物的方法及用發明性融合分子治療凝固缺陷的方法。
文檔編號A61K35/14GK102427823SQ201080021410
公開日2012年4月25日 申請日期2010年3月24日 優先權日2009年3月24日
發明者D.W.施耐德, J.E.墨菲, P.J.克雷奇默, T.E.湯普森, 趙曉燕 申請人:拜耳醫藥保健有限公司