標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法

2023-07-29 21:14:56 2

專利名稱：標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種利用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗來定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的方法。
背景技術：
隨著「人類基因組計劃」的完成，人類已經進入「功能基因組計劃」，其中首當其衝的就是蛋白質組學的研究。蛋白質結構和功能的多樣性決定了蛋白質組學研究的難度是基因研究所無法比擬的，尤其是新基因所編碼的蛋白質的結構和功能的揭示對生物學家來說是極富挑戰性的。而在蛋白組學的研究領域中，標籤蛋白是一種重要的工具。已有大量的試驗表明，應用適當的融合標籤，可以增加目的基因表達產物(即目的蛋白)的穩定性，使目的蛋白易於檢測和純化，增加表達水平，提高可溶性，並能幫助目的蛋白保留天然構像及與配體結合的能力。常見的標籤包括多聚精氨酸、多聚組氨酸、鈣調蛋白結合多肽、c-myc(序列為EQKLISEEDL)、穀胱甘肽S轉移酶(GST)、FLAG多肽(序列為DYKDDDDK)、葡萄球菌蛋白A、麥芽糖結合蛋白、硫氧化還原蛋白等。融合蛋白表達後，需要定性和定量的檢測。目前對標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的檢測方法主要是免疫印跡法，它操作複雜、實驗過程較長，一般需2天，用的試劑較貴，每次試驗要幾百元，並且只是一種定性的方法。

發明內容
為了克服免疫印跡法的不足，本發明提供一種標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，它不僅可以定量檢測，而且特異性強、靈敏度高、重複性好、簡便易行，非常適合於快速定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是提供一種標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其特徵是它利用在製備抗標籤蛋白單克隆抗體的基礎上，經過配對抗體的篩選，建立的雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗，來定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白。
所述的定量檢測方法包括抗標籤蛋白的單克隆抗體的製備、配對抗體的篩選及雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的建立。
所述的抗標籤蛋白單克隆抗體的製備方法是分別用不同的標籤蛋白作為免疫原，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠；第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只；第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合；融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫，採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化，得到抗目的標籤蛋白的單克隆抗體；其中HAT，H是次黃嘌呤；A是氨基喋呤；T是胸腺嘧啶核苷。
所述的配對雙抗體的篩選方法是，將得到的單克隆抗體分別常規標記辣根過氧化物酶，分別將未標記酶的單克隆抗體作為包被抗體，將標記酶的單克隆抗體作為酶標抗體，採用陣列法兩兩配對挑選最好條件的配對抗體，建立雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的系統。
所述的最好條件的配對抗體的挑選方法是選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的標籤蛋白的光吸收值最高，且特異性高的配對抗體。
所述的雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的方法是在96孔板中，順序加入包被抗體、待測標本和標準品、酶標抗體及底物，于波長410nm測定光吸收值，將上述挑選的最好的一對抗體分別用作包被抗體和酶標抗體來檢測相應的標籤蛋白，用5mg/L包被抗體包被96孔板，24小時後用含牛血清白蛋白的緩衝液封閉96孔板，洗滌後加入待測標本和倍比稀釋的相應標籤蛋白標準品，孵育及洗滌後加入酶標抗體，再次孵育及洗滌後以2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，于波長410nm測定光吸收值，以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合或換算，得出待測標本中相應的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的濃度。
本發明的有益效果是，它可以快速定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白，因為這是在單克隆抗體基礎上建立的方法，而單克隆抗體是識別單一表位的抗體，所以本發明的特異性強；又因為經過抗體的配對篩選，所以本發明的靈敏度高；本發明是建立在酶聯免疫吸附試驗的基礎上的，免疫印跡整個過程約需2天，而本發明只需先用5分鐘左右包被抗體，放到冰箱24小時後做後面一半，後面一半約4個小時，且各復孔間的光吸收值間誤差極小，所以本發明還有簡便易行、重複性好的特點。
具體實施例方式
抗標籤蛋白單克隆抗體的製備是分別用不同的標籤蛋白作為免疫原，免疫動物後，經細胞融合、篩選及克隆化得到目的單克隆抗體，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠；第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只；第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合；融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫，採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化，得到抗目的標籤蛋白的單克隆抗體。其中HAT，H是次黃嘌呤；A是氨基喋呤；T是胸腺嘧啶核苷。
配對雙抗體的篩選方法是將得到的單克隆抗體分別常規標記辣根過氧化物酶，分別將未標記酶的單克隆抗體作為包被抗體，將標記酶的單克隆抗體作為酶標抗體，採用陣列法兩兩配對挑選最好條件的配對抗體，建立雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的系統。最好條件的配對抗體的挑選方法是選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的標籤蛋白的光吸收值最高，且特異性高(即檢測無關蛋白的光吸收值最低，也即非特異本底最低)的配對抗體。
實施例1定量檢測麥芽糖結合蛋白的方法將麥芽糖結合蛋白作為免疫原，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠。第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只。第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合。融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫。採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化。用麥芽糖結合蛋白免疫BALB/c小鼠後經細胞融合、篩選及克隆化，共得到14株抗麥芽糖結合蛋白的單克隆抗體，分別命名為FMU-MBP1～FMU-MBP14。
經過抗體的配對篩選後，將FMU-MBP12作為包被抗體，而將FMU-MBP4標記辣根過氧化物酶後作為酶標抗體。用pH9.6、0.05mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩衝液稀釋包被抗體FMU-MBP12至5mg/L，加入96孔板，100μl/孔，保溼，4℃放置24小時。用洗滌緩衝液洗96孔板3次，加入含0.3％牛血清白蛋白的緩衝液，室溫封閉30分鐘。洗板3次，加入待測標本和倍比稀釋的麥芽糖結合蛋白標準品，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，加入1∶300稀釋的酶標抗體FMU-MBP4，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，以2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，100μl/孔，37℃放置5分鐘，于波長410nm測定光吸收值。以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，其靈敏度達31.3ng/mL。根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合，得出待測標本中麥芽糖結合蛋白的濃度為596.3ng/mL。標準品，即已知濃度的用來免疫小鼠的免疫原。
實施例2定量檢測含麥芽糖結合蛋白標籤的融合蛋白MBP-RPMS1的方法將麥芽糖結合蛋白作為免疫原，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠。第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只。第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合。融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫。採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化。用麥芽糖結合蛋白免疫BALB/c小鼠後經細胞融合、篩選及克隆化，共得到14株抗麥芽糖結合蛋白的單克隆抗體，分別命名為FMU-MBP1～FMU-MBP14。
經過抗體的配對篩選後，將FMU-MBP12作為包被抗體，而將FMU-MBP4標記辣根過氧化物酶後作為酶標抗體。用pH9.6、0.05mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩衝液稀釋包被抗體FMU-MBP12至5mg/L，加入96孔板，100μl/孔，保溼，4℃放置24小時。用洗滌緩衝液洗96孔板3次，加入含0.3％牛血清白蛋白的緩衝液，室溫封閉30分鐘。洗板3次，加入待測標本和倍比稀釋的麥芽糖結合蛋白標準品，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，加入1∶300稀釋的酶標抗體FMU-MBP4，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，以2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，100μl/孔，37℃放置5分鐘，于波長410nm測定光吸收值。以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線。根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合和分子量換算，得出待測標本中融合蛋白MBP-RPMS1的濃度為303.6ng/mL。
實施例3定量檢測穀胱甘肽S轉移酶(GST)的方法將GST作為免疫原，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠。第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只。第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合。融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫。採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化。用GST免疫BALB/c小鼠後經細胞融合、篩選及克隆化，共得到5株抗GST的單克隆抗體，分別命名為FMU-GST1～FMU-GST5。
經過抗體的配對篩選後，將FMU-GST5作為包被抗體，而將FMU-GST4標記辣根過氧化物酶後作為酶標抗體。用pH9.6、0.05mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩衝液稀釋包被抗體FMU-GST5至5mg/L，加入96孔板，100μl/孔，保溼，4℃放置24小時。用洗滌緩衝液洗96孔板3次，加入含0.5％牛血清白蛋白的緩衝液，室溫封閉30分鐘。洗板3次，加入待測標本和倍比稀釋的GST標準品，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，加入1∶500稀釋的酶標抗體FMU-GST4，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，以2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，100μl/孔，37℃放置5分鐘，于波長410nm測定光吸收值。以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，其靈敏度達15.6ng/mL。根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合，得出待測標本中GST的濃度為145.6ng/mL。
實施例4定量檢測含GST標籤的融合蛋白GST-1D2的方法將GST作為免疫原，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠。第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只。第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合。融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫。採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化。用GST免疫BALB/c小鼠後經細胞融合、篩選及克隆化，共得到5株抗GST的單克隆抗體，分別命名為FMU-GST1～FMU-GST5。
經過抗體的配對篩選後，將FMU-GST5作為包被抗體，而將FMU-GST4標記辣根過氧化物酶後作為酶標抗體。用pH9.6、0.05mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩衝液稀釋包被抗體FMU-GST5至5mg/L，加入96孔板，100μl/孔，保溼，4℃放置24小時。用洗滌緩衝液洗96孔板3次，加入含0.5％牛血清白蛋白的緩衝液，室溫封閉30分鐘。洗板3次，加入待測標本和倍比稀釋的GST標準品，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，加入1∶500稀釋的酶標抗體FMU-GST4，100μl/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，以2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，100μl/孔，37℃放置5分鐘，于波長410nm測定光吸收值。以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線。根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合和分子量換算，得出待測標本中融合蛋白GST-1D2的濃度為250.1ng/mL。
實施例5～14同實施例3和4的方法基本相同，它建立了定量檢測其他10種含GST標籤的融合蛋白的方法。作出標準曲線後，根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合和分子量換算，得出待測標本中融合蛋白GST-AML1、GST-GRASP65、GST-GRASP65-P、GST-GRASP55N、GST-Smad7、GST-SLCO6A1、GST-FMR1NB、GST-PDGFαR、GST-PDGFβR、GST-IL-2Rα的濃度分別為427.8、373.2、447.2、377.8、624.3、497.7、250、494.6、303.4、644.7ng/mL。
權利要求
1.標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其定量檢測方法是它利用在製備抗標籤蛋白單克隆抗體的基礎上，經過配對抗體的篩選，建立的雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗，來定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白。
2.根據權利要求1所述的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其定量檢測方法包括抗標籤蛋白的單克隆抗體的製備、配對抗體的篩選及雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的建立。
3.根據權利要求2所述的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其特徵是所述的抗標籤蛋白單克隆抗體的製備方法是分別用不同的標籤蛋白作為免疫原，採用常規弗氏佐劑全程免疫的方案免疫BALB/c小鼠；第一次免疫加弗氏完全佐劑，30μg免疫原/只；30天後第二次免疫加弗氏不完全佐劑，20μg免疫原/只；30天後第三次免疫不加佐劑，20μg免疫原/只；第三次免疫10天後由小鼠尾靜脈取血，用間接酶聯免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清，效價達1∶64000以上，供融合；融合前3天，取血清效價最高的一隻小鼠，以20μg免疫原腹腔注射加強免疫，採用聚乙二醇為促融劑，進行免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養法篩選雜交瘤，並用有限稀釋法進行克隆化，得到抗目的標籤蛋白的單克隆抗體；其中HAT，H是次黃嘌呤；A是氨基喋呤；T是胸腺嘧啶核苷。
4.根據權利要求1所述的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其特徵是所述的配對雙抗體的篩選方法是，將得到的單克隆抗體分別常規標記辣根過氧化物酶，分別將未標記酶的單克隆抗體作為包被抗體，將標記酶的單克隆抗體作為酶標抗體，採用陣列法兩兩配對挑選最好條件的配對抗體，建立雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的系統。
5.根據權利要求4所述的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其特徵是所述的最好條件的配對抗體的挑選方法是選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的標籤蛋白的光吸收值最高，且特異性高的配對抗體。
6.根據權利要求1所述的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，其特徵是所述的雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗的方法是在96孔板中，順序加入包被抗體、待測標本和標準品、酶標抗體及底物，于波長410nm測定光吸收值，將上述挑選的最好的一對抗體分別用作包被抗體和酶標抗體來檢測相應的標籤蛋白，用5mg/L包被抗體包被96孔板，24小時後用含牛血清白蛋白的緩衝液封閉96孔板，洗滌後加入待測標本和倍比稀釋的相應標籤蛋白標準品，孵育及洗滌後加入酶標抗體，再次孵育及洗滌後以2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-磺酸)底物顯色，于波長410nm測定光吸收值，以標準品的光吸收值為縱坐標，相應濃度為橫坐標，作標準曲線，根據待測標本的光吸收值，經曲線擬合或換算，得出待測標本中相應的標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的濃度。
全文摘要
本發明涉及一種利用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗來定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的方法，其定量檢測方法是它利用在製備抗標籤蛋白單克隆抗體的基礎上，經過配對抗體的篩選，建立的雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗，來定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白。為了克服免疫印跡法的不足，本發明提供一種標籤蛋白或含標籤的融合蛋白的定量檢測方法，它不僅可以定量檢測，而且特異性強、靈敏度高、重複性好、簡便易行，非常適合於快速定量檢測標籤蛋白或含標籤的融合蛋白。
文檔編號G01N21/31GK1825117SQ20061004175
公開日2006年8月30日 申請日期2006年1月28日 優先權日2006年1月28日
發明者金伯泉, 徐竹蔚, 宋朝君 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學