羥乙基澱粉的製作方法

2023-07-20 22:35:06

專利名稱：羥乙基澱粉的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種羥乙基澱粉和製備這種羥乙基澱粉的方法。此外，本發明涉及一種含有羥乙基澱粉的藥劑，這種藥劑用於製備容量代用品，血漿代用品或血漿增容劑的用途，以及這種藥劑用於保持血量正常和/或用於改進大循環和微循環和/或用於改進營養氧供應和/或用於穩定血液動力學和/或用於改進容量效率和/或用於降低血漿粘度和/或用於提高耐貧血症性和/或用於在被擾亂的血液供應和動脈、特別是外周動脈性閉塞病中進行血液稀釋、特別是治療性血液稀釋的用途。
在預防和治療血容量過低中使用血管內液是最重要的措施，而不管是否血容量過低是否因在大循環和微循環(如膿血症)間被擾亂的分布或因血管舒張(例如，在麻醉開始期間)而造成的血液或體液立即損失(在出血，外傷，手術，燒傷)。適於這種症狀的灌輸液被認為可以恢復血量正常並保持灌注重要器官和外周血流。同時，這種溶液必須不能過度地壓迫循環，並且它們必須沒有副作用。就這一點而言，目前使用的所有容量代用品都有優點和缺點。儘管所謂的晶體溶液(電解質溶液)基本上沒有立即的副作用，但它們僅能保證血管內容量和血液動力學在短期內穩定，並且穩定不充分。在明顯或持續血容量過低的情況下，必須灌輸過量晶體溶液，因為它們不能全部保留在血管內，而是快速地在血管外空間中消散。然而，快速流進血管外空間不僅限制了晶體溶液的循環填充作用，而且有發生外周和肺水腫的可能。除了出現肺水腫的致命威脅外，還導致營養氧供應的惡化，這也受到外周水腫的影響。
相比而言，膠體容量代用品，不管其中所含的膠體是天然來源還是合成來源的，都具有更可靠的作用。這是由於如下原因因為膠體具有膠體-滲透作用，所以與晶體相比，它們可以在循環中保留供應的液體更久，這樣可防止液體流進空隙中。另一方面，與晶體溶液相比，膠體容量代用品引起更高程度的不需要的反應。這樣，天然膠體清蛋白，如所有的血液或血漿衍生物，都有被病毒疾病感染的可能；此外，可以與其他藥物相互作用，例如，ACE抑制劑；最後，清蛋白的實用性受到限制，並且它作為容量代用品的用途不成比例地昂貴。清蛋白用作容量代用品的其他疑問是從外部加入時清蛋白內生合成的抑制以及易於外血管化。這意味著從循環進入血管外空間，並在那裡由於清蛋白的膠體-滲透作用發生不需要的和持續的液體積聚。
在合成膠體中，嚴重過敏反應和血凝物的嚴重抑制使右旋糖苷製劑在治療中幾乎完成消失。儘管羥乙基澱粉(HES)溶液也有引發過敏反應和影響血凝物的可能，但是與右旋糖苷相比，這種可能程度更小。與右旋糖苷相比，使用HES溶液時幾乎觀察不到嚴重過敏反應(嚴重度III和IV的反應)，並且近年來通過進一步研究HES溶液，高分子量HES溶液固有的對血凝物的影響也明顯降低。與明膠溶液(也用作血漿代用品並且基本上不影響血凝物)相比，至少高和中分子量實施方案的HES溶液具有更長血漿停留時間和有效性的優點。
EP-A-0 402 724公開了一種羥乙基澱粉的製備和用途，其平均分子量Mw為60,000～600,000，摩爾取代MS為0.15～0.5，和取代度DS為0.15～0.5。其中披露了快速(6～12小時)和完全降解羥乙基澱粉，並用作血漿增容劑。在平均分子量為100,000～300,000的優選範圍內，明確測試了平均分子量為234,000的羥乙基澱粉。
US-A-5,502,043公開了羥乙基澱粉用於改進外周動脈閉塞病中的大循環的用途，其平均分子量Mw為110,000～150,000，摩爾取代MS為0.38～0.5，和取代度DS為0.32～0.45。此外，該文獻教導了使用低分子量(Mw 110,000～150,000)羥乙基澱粉，由於低分子量，這種羥乙基澱粉使血漿粘度低，並確保改進血流中的大循環。然而，該文獻中反對使用較高分子量羥乙基澱粉，如Mw為500,000的羥乙基澱粉，因為它們會提高血漿粘度，從而儘管它們較低的摩爾取代(MS＝0.28)也會惡化大循環。
在世界範圍內，目前使用不同的HES製劑作為膠體容量代用品，並主要通過分子量來區分，也通過與羥乙基的醚化程度和其他參數來區分。最具有低表性的這類物質是所謂的Heta澱粉(HES 450/0.7)和Penta澱粉(HES 200/0.5)。後都是當前最廣泛使用的″標準HES″。此外，HES 200/0.62和HES 70/0.5也有一點作用。涉及到分子量和涉及到其他參數的公開信息是平均量，其中分子量是以道爾頓計的重均(Mw)值(例如，HES 200,000)或簡寫作千道爾頓(例如，HES 200)。與羥乙基的醚化程度以摩爾取代MS表徵(例如，在HES 200/0.5為0.5；MS＝羥乙基與脫水葡萄糖單元的平均摩爾比)，或以取代度表徵(DS＝單或多羥乙基化的葡萄糖與總脫水葡萄糖單元的比)。根據分子量，在臨床應用中將HES溶液分成高分子量(450kD)，中分子量(200-250kD)和低分子量(70-130kD)製劑。
至於HES溶液的凝結作用，分成非特異性和特異性影響。對血凝物的非特異性影響是對血液進行稀釋(血液稀釋)的結果，這在將溶液和其他容量代用品灌輸進循環中時出現。這種血液稀釋也影響凝結因子，其濃度隨灌輸而對血液和血漿蛋白的稀釋程度和時間而下降。相應地，較大或持續作用可以導致低凝結，這可以實驗室診斷檢測到，並且在極端情況下，是臨床相關的。
此外，羥乙基澱粉可以對血凝物產生特異性影響，並對幾種因子起作用。因而，在某些條件下或在使用某些HES製劑時，發現凝結蛋白因子VIII(F VIII)和血管性血友病因子(vWF)下降，並且由於血液稀釋的原因大於血漿蛋白的常見降低。這種比預期更大的降低是否因FVIII/vWF的形成下降或釋放所引起的，如因HES對血管內皮的塗覆作用或其他機制所引起的，還不十分清楚。
然而，HES不僅影響所述凝結因子的濃度，而且也影響血小板功能。這完全或部分地由於HES與血小板表面結合的原因，從而抑制配體進入血小板的纖維蛋白原受體。
當使用高分子量HES(例如，HES 450/0.7)時，儘管它們沒有起到中分子量(例如，HES 250/0.5)或低分子量HES(例如，HES 130/0.4或HES 70/0.5)那樣的大作用，但是HES對血凝物的特異性作用特別明顯(J.Treib等人，Intensive Care Med.(1999)，pp.258～268；0.Langeron等人，Anesth.Analg.(2001)，pp.855～862；R.G.Strauss等人，Transfusion(1988)，pp.257-260；M.Jamnicki等人，Anesthesiology(2000)，pp.1231～1237)。
如果將高分子量HES的風險分布與中和低分子量製劑相比，後者的風險明顯降低，即不僅與血凝物相互作用，而且具有特定的藥物動力學性能。因此，高分子量HES溶液在循環中表現出較高的積聚，儘管這種缺點在中分子量HES中降低，並且在低分子量製劑中基本上不存在積聚。低分子量HES溶液如HES 130/0.4中沒有更多積聚的事實是一種相關治療過程，因為HES的血漿水平不能在臨床途徑中檢測到，因此沒有發現在數天內用高分子量溶液得到的極端濃度。在這種情況下，使用者不能知道在循環中積聚的″殘餘HES″量，但仍然影響額外灌輸的HES的動力學和行為，在循環中仍存在不清楚的量。因此，現有技術中高分子量HES的作用不可計算；在大多數情況下，出於治療原因，在循環中比所需要的或所期望的持續時間更長，並且代謝過程不清楚。
相比而言，在灌輸後的約20～24小時內低分子量HES完全從循環中消失。這避免了積壓作用，並且不發生積聚，特別是對於反覆灌輸而言。與高分子量澱粉相比，低分子量澱粉的藥物動力學行為是可計算的，因此易於控制。在循環中沒有出現過高負載或清除機制。
然而，與高分子量製劑相比，低分子量HES的行為是有利的，其血漿半衰期明顯較短。低分子量HES的血漿半衰期僅約為HES 200的一半或更少(J.Waitzinger等人，Clin.Drug Invest.(1998)，pp.151～160)，並且在明膠製劑的半衰期範圍內，而明膠製劑被定級為決定性的短期效力。儘管容量代用品的短半衰期不利於分類，因為通過更頻繁或更高劑量地給予容量代用品可以進行補償，但是在嚴重或持續血容量過低中，短半衰期和短有效期的容量代用品可能導致循環填充不足(更象晶體溶液)，或者，在相應地提高劑量以補償這種缺點時，間質液可能過載。
在這種背景之下，需要一種容量代用品，一方面其積聚趨勢低和對血凝物的影響低(如低分子量HES)，另一方面，與低分子量HES溶液相比，半衰期更長，其性能接近於晶體溶液。
目前正在尋找具有這種性能的羥乙基澱粉，已發現與已知低分子量HES溶液相比具有更長血漿半衰期的羥乙基澱粉HES溶液，這些可以被製備，並且令人驚訝地是，本發明的高分子量溶液沒有現有高分子量溶液的缺點，如在循環中積聚的性能或對血凝物明顯的抑制。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及一種羥乙基澱粉，其平均分子量Mw大於或等於500,000，摩爾取代MS為0.25～0.5，優選0.35～0.50(0.35≤MS≤0.50)，和C2/C6比為2～小於8。
本發明的羥乙基澱粉受摩爾取代MS影響。摩爾取代MS定義作每個脫水葡萄糖單元的羥乙基的平均數量(Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie(1987)，pp.271～278)。摩爾取代可以根據Ying-Che Lee等人，Anal.Chem.(1983)55，334，和K.L.Hodges等人，Anal.Chem.(1979)51，2171進行測定。在此方法中，通過加入二甲苯中的己二酸和氫碘酸(HI)使已知量的HES進行醚解。隨後，使用內標(甲苯)和外標(碘乙烷校準溶液)，通過氣相色譜量化釋放的碘乙烷。摩爾取代MS影響本發明的羥乙基澱粉的作用。如果MS選擇的過高，那麼當羥乙基澱粉用作容量代用品時，可能在循環中引起積聚作用。另一方面，如果MS選擇的過低，這會使羥乙基澱粉在循環中降解過快，從而降低所需的血漿半衰期時間。有利的摩爾取代MS為0.35～0.5(0.35≤MS≤0.50)，優選為0.39～小於或等於0.45(0.39≤MS≤0.45)，特別是MS大於0.4～0.44(0.4＜MS≤0.44)。
本發明的羥乙基澱粉屬於高分子量羥乙基澱粉，優選其平均分子量(Mw)為大於600,000～1,500,000，更優選620,000～1,200,000，特別是700,000～1,000,000。由於製備條件的原因，羥乙基澱粉不是處於均勻分子量的物質形式，而是不同大小的分子混合物的形式，並且也羥乙基的取代也不相同。因此，這種混合物的表徵需要藉助於統計平均量。因此，使用重均分子量(Mw)來表徵平均分子量，這種平均值的一般定義陳述於Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie(1987)，pp.271～278中。
可以使用GPC柱TSKgel G 6000PW，G 5000PW，G 3000PW和G 2000PW(7.5mm×30cm)，MALLS檢測器(DAWN-EOS；WyattDeutschland GmbH，Woldert)和RI檢測器(Optilab DSP；WyattDeutschland GmbH，Woldert)，利用GPC-MALLS進行分子量測定，其中流速為1.0ml/分鐘，50mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0。使用ASTRA軟體(Wyatt Deutschland GmbH，Woldert)進行分析。
優選的是從天然或部分水解的穀類或馬鈴薯澱粉得到的羥乙基澱粉。由於支鏈澱粉含量較高，因此使用從相應植物的蠟質品種(存在時(例如，蠟質玉米，蠟質大米))得到的澱粉是特別優選的。
本發明的羥乙基澱粉還用在脫水葡萄糖單元的C2取代與C6取代的比描述。在本發明內這種比例也簡寫作C2/C6比，是指在羥乙基澱粉的2位取代的脫水葡萄糖單元的數量與在羥乙基澱粉的6位取代的脫水葡萄糖單元的數量的比。HES的C2/C6比可以根據羥乙基化中所用的氫氧化鈉水溶液的量大範圍的變化，如表1和表2所示。使用的NaOH量越高，澱粉的脫水葡萄糖中6位的羥基被羥乙基化活化的程度越大。因此，隨著NaOH濃度增大，羥乙基化中的C2/C6比下降。測定按Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie(1987)，pp.271～278所述的進行。使用給定順序的增大，C2/C6比優選為3～小於8，2～7，3～7，2.5～小於或等於7，2.5～6，或4～6。在本發明的較高分子量HES中，C2/C6比是實現本發明目的的另一貢獻。
由於在人或動物有機體中優異的耐受性和易於降解性，本發明的羥乙基澱粉適用於各種藥劑中。
在特別的實施方案中，本發明的HES其平均分子量為700,000～1,000,000，摩爾取代為大於0.4～0.44(0.4＜MS≤0.44)，和C2/C6比為2～7，優選3～7，特別是2.5～6。
本發明還涉及製備羥乙基澱粉的方法，優選製備本發明的羥乙基澱粉。優選地，該方法包括如下步驟(i)使懸浮於水中的澱粉，優選玉米澱粉，更優選地部分水解的，所謂的稀糊，蠟質玉米澱粉，與環氧乙烷反應；和(ii)使用酸、優選鹽酸部分水解得到的澱粉衍生物，直到羥乙基澱粉到達所需的平均分子量範圍。
原則上，所有已知澱粉都適於製備本發明的羥乙基澱粉，主要是天然或部分水解的澱粉，優選穀類或馬鈴薯澱粉，特別是具有高含量支鏈澱粉的那些。在本發明方法的特別實施方案中，使用蠟質品種的澱粉，特別是蠟質玉米和/或蠟質大米。在特別實施方案中，通過使懸浮於水中的穀類和/或馬鈴薯澱粉，優選稀糊蠟質玉米澱粉，與環氧乙烷反應，來製備HES。有利的是，通過加入鹼化劑催化反應，優選鹼金屬氫氧化物，例如，氫氧化鈉或氫氧化鉀。因此，在本發明方法的優選實施方案中，還將鹼化劑，優選氫氧化鈉，加到懸浮於水中的澱粉中。鹼化劑加到懸浮澱粉中的方式，優選使得鹼化劑與澱粉的摩爾比大於0.2，優選為0.25～1，特別是0.3～0.8。通過在羥乙基化步驟中環氧乙烷與澱粉的比，可以在所需MS範圍內任意地控制摩爾取代，即羥乙基與脫水葡萄糖單元的摩爾比。優選地，環氧乙烷和懸浮的澱粉間的反應在30～70℃下進行，優選35～45℃。通常，在反應後除去任何殘餘的環氧乙烷。在反應後的第二步驟中，衍生的澱粉進行酸性部分水解。″部分水解″指澱粉的α-糖苷互聯的葡萄糖單元的水解。原則上，本領域技術人員所熟悉的所有酸都可用於酸水解，但優選是無機酸，特別是鹽酸。水解也可以使用市售澱粉酶在酶作用下進行。
在另一個優選的實施方案中，本發明的方法還包括如下步驟(iii)滅菌過濾和可選擇地(iv)超濾。如果在本發明方法中進行上述過濾，那麼原料HES的酸性部分水解被進行到平均分子量略低於所需的目標分子量。通過超濾，可以除去低分子量反應副產物，主要是乙二醇，由於低分子量HES成分的部分去除，平均分子量略有增加。
優選地，衍生於製備方法的溶液隨後稀釋到所需HES濃度，通過加入鹽調節到所需滲透壓力，進行滅菌過濾，並加到適合容器中。可選擇地，可以進行滅菌，優選通過流通蒸汽。
因此，本發明還涉及一種含有一種或多種本發明的羥乙基澱粉的藥劑。原則上，本發明的藥劑可以是任何可能的劑型。在本發明的優選實施方案中，本發明的藥劑可以靜脈內注射或灌輸。因此，藥劑優選是水溶液或膠體水溶液形式。優選地，製劑所含的本發明的羥乙基澱粉濃度達到20％，更優選0.5～15％，更優選2～12％，特別是4～10％，例如，6％。
除非另有所指，各量以％計，在本發明範圍內應被理解成指g/100ml溶液。
在另一個實施方案中，本發明的藥劑還含有氯化鈉，優選0.6～2％，更優選0.9％。氯化鈉的0.9％水溶液也稱作″生理鹽水″。其具有與血清相同的滲透壓，因此適於用作靜脈注射或灌輸的等滲壓溶液。任何其他滲透有效物質都可用於等滲透作用，只要它們是生理安全的並且具有良好耐受性，如葡萄糖，葡萄糖取代物(果糖，山梨糖醇，木糖醇)或甘油。在另一個優選的實施方案中，藥劑還可含有調節血漿的電解質。這種等滲壓製劑的製備對於本領域技術人員是已知的。具有調節血漿的電解質的等滲壓溶液的例子是所謂的Tyrode溶液。其在100ml蒸餾水中含有0.8g NaCl，0.02g KCl，0.02g CaCl2，0.01g MgCl2，0.005g NaH2PO4，0.1g NaHCO3和0.1g葡萄糖。另一個例子是所謂的Ringer溶液，其含有0.8％氯化鈉，0.02％氯化鉀，0.02％氯化鈣和0.1％碳酸氫鈉。當然，電解質的陰離子也可以被能夠代謝的陰離子代替；因此，例如，Ringer溶液中的碳酸氫鈉可以被0.3或0.6％的乳酸鈉代替。本領域技術人員將相應的電解質組合物或溶液稱作″Ringer乳酸鹽″。可以單獨使用或混合使用的能夠代謝的陰離子是乙酸鹽(例如，″Ringer乙酸鹽″)或蘋果酸鹽。
在本發明的另一個實施方案中，藥劑也可以是高滲溶液形式。高滲溶液是比人血具有更高滲透壓的溶液。在某些臨床症狀中使用高滲藥劑是有利的。通過加入相應量的滲透有效物質，例如，氯化鈉，調節高滲溶液的所需滲透壓，為此其濃度可達到7.5％和更大。
為避免並減小感染的可能，本發明的藥劑優選進行滅菌過濾或熱滅菌。對本發明的含水或膠體含水藥劑特別適合的滅菌過濾是細孔過濾柱，如以商品名SARTPORE由Sartorius公司提供的那些。例如，孔徑為0.2μm的過濾柱是適合的。此外，本發明的藥劑還可進行熱滅菌，而對羥乙基澱粉沒有不利影響。優選地，熱滅菌在高於100℃的溫度下進行，更優選105～150℃，特別是110～130℃，例如，121℃，進行達到30分鐘，優選達到25分鐘，特別是18～22分鐘。
在優選的實施方案中，藥劑是容量代用品。容量代用品用於代替動物和人有機體中的血管內液。容量代用品特別用於血容量過低的預防和治療中。血容量過低是否起因於血液或體液的立即損失，如在急性出血，外傷，手術，燒傷等中，或起因於大循環和微循環間的被擾亂的分布，如在膿血症中，或起因於血管舒張，如在麻醉開始期間，這不是關鍵的。容量代用品進一步分成所謂的血漿代用品和所謂的血漿增容劑。對於血漿代用品，血管內應用的試劑體積與供應到血管的體積相應。相比而言，對於血漿增容劑，血管內應用的膨脹劑液體體積低於實際供應到血管的體積。這種現象是由於使用血漿增容劑擾亂了血管內和血管外空間之間的腫脹平衡，並且額外的液體體積從血管外空間流進待治療的血管系統。
血漿增容劑與血漿代用品的區別基本上如下其中所含的本發明的羥乙基澱粉的濃度增大，和/或各電解質的濃度引起腫脹和/或滲透不平衡。
本發明的藥劑還可含有藥學活性成分或活性成分的組合物，從而用作給予其中所含的活性成分的介質，特別是通過注射和灌輸給予。
本發明還涉及本發明的藥劑用於製備容量代用品或血漿代用品或血漿增容劑的用途。
更優選地，本發明的藥劑可用作容量代用品或血漿代用品或血漿增容劑。優選地，這種藥劑用於保持血量正常。保持血量正常對於血液動力學穩定性是特別重要的，這對於人或動物有機體有重要影響，例如，在血壓，排尿速率或心率方面。為了儘快地補償血管內液體損失和恢復血量正常，本發明的藥劑是特別有利的，因為與現有技術中的血漿代用品相比，特別是低分子量HES溶液，如HES 130/0.4，它們具有更長的血漿半衰期，特別是在灌輸後的關鍵階段中。本發明的藥劑也是特別有利的，因為令人驚訝的發現，在使用這種組合物時，與U.S.5,502,043中所述的高分子量HES相比，血液和/或血漿粘度沒有增大，並且也因為與其他高分子量製劑相比，血凝物受到的抑制較少。血漿粘度令人驚訝地沒有增大的事實也改進了大循環和改進了向血管的營養氧供應。
本發明還涉及本發明的藥劑用於保持血量正常和/或用於改進大循環和微循環和/或用於改進營養氧供應和/或用於穩定血液動力學和/或用於改進容量效率和/或用於降低血漿粘度和/或用於提高耐貧血症性和/或用於在被擾亂的血液供應和動脈、特別是外周動脈性閉塞病中進行血液稀釋、特別是治療性血液稀釋的用途。
本發明的藥劑或本發明的羥乙基澱粉優選用於製備藥物，特別是用於保持血量正常和/或用於改進大循環和微循環和/或用於改進營養氧供應和/或用於穩定血液動力學和/或用於改進容量效率和/或用於降低血漿粘度和/或用於提高耐貧血症性和/或用於在被擾亂的血液供應和動脈、特別是外周動脈性閉塞病中進行血液稀釋、特別是治療性血液稀釋的藥物。
此外，本發明的藥劑或本發明的羥乙基澱粉優選用於處理保持血量正常和/或用於改進大循環和微循環和/或用於改進營養氧供應和/或用於穩定血液動力學和/或用於改進容量效率和/或用於降低血漿粘度和/或用於提高耐貧血症性和/或用於在被擾亂的血液供應和動脈、特別是外周動脈性閉塞病中進行血液稀釋、特別是治療性血液稀釋的方法中。
本發明還涉及一種藥盒，單獨地包括(i)本發明的羥乙基澱粉；(ii)無菌溶液，優選氯化鈉溶液；和可選擇地(iii)藥學活性成分或活性成分組合物。
在優選的實施方案中，本發明的藥盒包括在多隔室袋中的分開的隔室內的各成分(i)，(ii)和可選擇地(iii)，其中所有成分可以分離，或某些成分，如(i)和(ii)，可以包括在一個容器中。
通過下面實施例進一步闡述本發明。
HES原料的製備實施例實施例1製備具有相同MS和C2/C6比但不同分子量的HES原料通過部分水解從一次反應料製備體內研究的實驗部分中所述的HES物質。為此，採用下面的過程。劇烈攪拌下，將30kg稀糊蠟質玉米澱粉懸浮在室溫下的52.2kg wfi(注射用水)中。為了優化水合澱粉，隨後通過將懸浮液加熱到至少85℃進行凝膠化。通過噴入氮氣10min，然後抽空，反覆惰化懸浮液，通過加入5.1kg NaOH使澱粉活化。隨後，將液體形式的4.159kg冷環氧乙烷加到反應器中，溫度緩慢升至40℃，反應混合物在此溫度下放置2小時，同時保持攪拌。通過反覆進行上述惰化，從反應料中除去環氧乙烷。然後，通過逐步酸水解從該原料HES中製備具有相同Mw和C2/C6比但不同MS的三種HES製劑。為減小分子量，用20％HCl將溶液調節到pH 2.0，加熱到75±1℃，並在此溫度放置，直到根據GPC-MALLS測定的HES膠體的平均分子量Mw下降到865kD。從反應器中取出三分之一的水解物，並立即冷卻到溫度低於50℃。通過用活性碳處理使溶液脫色後，用市售預濾器和滅菌過濾器過濾溶液，通過超濾(UF)稀釋到12％後，純化。因而，使用Millipore公司的截流10kD的聚醚碸膜。在UF過程中，由於低分子量HES成分的部分去除，Mw略有增大。這種增大取決於膠體製劑的起始Mw，但主要取決於所用UF膜的標示截流以及所用UF膜的規格。為在UF後得到所需的目標分子量，在UF中Mw變化必須主要是根據所用UF膜的規格而實驗性建立的。也應該注意到，水解從用於測定酸水解中的Mw的取樣時間持續進行到已得到建立的Mw值。因此，在全部水解過程中系統地監測Mw下降，並通過隨時間外推Mw估計到達目標Mw的時間。然後，在外推的時間處停止水解。除去第一個三分之一量後餘下的水解物繼續保持，直到平均分子量Mw下降到460kD。隨後，按與第一個三分之一量相同的方式處理第二個三分之一量。同樣，餘下的三分之一進一步水解到Mw為95kD，並進行與其他兩部分物質相同的處理過程。從部分物質1，可以得到HES 900/0.42(C2/C6比＝4.83)，從部分物質2，可以得到HES 500/0.42(C2/C6比＝4.83)，從部分物質3，可以得到HES 130/0.42(C2/C6比＝4.83)。
超濾完成後，將膠體濃度調節到6％，pH值調節到5.5，通過加入NaCl使溶液等滲壓化，裝入500ml玻璃瓶中，在121℃下滅菌20分鐘。
實施例2製備其他HES原料為製備具有其他摩爾取代和C2/C6比的HES膠體，按相同規模進行了多次實驗，其中改變環氧乙烷的量。此外，當到達不同Mw(目標Mw)時停止酸水解。這些實驗總結在下表1中表1
實施例3在羥乙基化中NaOH與澱粉的摩爾比對C2/C6比的影響為證實NaOH與澱粉的脫水葡萄糖單元的摩爾比對C2/C6比的控制能力，將30kg稀糊蠟質玉米澱粉與不同量的NaOH混合，並在40℃下與環氧乙烷反應。在表2中，列出了所用試劑的量和C2/C6比以及此反應所得HES產物的MS。可以看出，C2/C6比隨NaOH與澱粉的比增大而下降。這是由於，低NaOH濃度下的澱粉鹼催化的羥乙基化優選在脫水葡萄糖單元的2位中的羥乙基處進行，而這是最具有反應性的。使用較高NaOH濃度，本身反應性不高的C6羥基也可被充分活化，從而被充分羥乙基化。
表2在羥乙基化中控制C2/C6比
HES終產品的製備實施例在下表3中，列出用於製備各種HES溶液的製劑。HES用作超濾後的HES濃縮物。通過三次計算規則測定製備6％或10％HES溶液所需的HES濃縮物的量。另一種可能是使用噴幹的HES，這不會對備有噴幹塔的本領域技術人員造成任何困難。所用的HES其分子量為900kD，MS為0.42。
在200l反應槽中，稱重表中列出的所需量的HES濃縮物和所需量的鹽和NaOH溶液，攪拌下使鹽溶解。將溶液1，4，5，7和8的pH調節到5.5，將溶液2，3，6的pH調節到6.0，加入注射用水(WFI)，使得到達按照規格的理論Na濃度。
本領域技術人員很清楚，通過改變所述活性成分或助劑的比例以及活力或加入其他物質，可以改變製劑，並且如果使用其他HES物質，也可製備相應的溶液。
表3
應用實施例的測量方法下面說明檢測血液和血漿樣品的測量方法。
天然血液測量在實驗室中處理加入有檸檬酸鹽的血液樣品，如下立即測量樣品的血液粘度(Rheostress1，Thermo-Haake，Karlsruhe，Germany)，其中線性增大的剪切速率為1～240/秒。在剪切速1/秒和128/秒時檢測粘度。在Thromboelastograph(TEG，Haemoscope Corporation，Niles，Illinois)上進行分析之前，血液樣品在37℃水浴中培養1小時。按照製造商的指示進行血液鈣化和TEG測量。測定凝結指數(CI)，其綜合了凝血彈性描記法的幾種部分功能。
血漿測量血液樣品在4℃和3000rpm(Rotana/RP，Hettich，Bch，Switzerland)下離心15分鐘。根據上述血液測定測量血漿粘度。
通過自動化的凝結分析儀(BCS，Dade Behring，Marburg，Germany)，使用含有重組組織因子的PT試劑(Innovin，Dade Behring)和含有鞣花酸的aPTT試劑(Actin FS，Dade Behring)，測量凝血素時間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)。基於供應商提供的ISI值，將PT值轉化成INR值。通過自動化的凝結分析儀(BCS，DadeBehring)中的市售瑞斯西丁素輔助因子陣列(vWF RCA，Dade Behring)測定血管性血友病因子(vWF)的功能活性。通過在瑞斯西丁素存在下，凝結人凝血細胞的能力來建立vWF活性。通過使用凝結分析儀進行渾濁測量來測定凝結。根據製造商的指示使用市售ELISA藥盒(Asserachrom vWF antigenic，Roche Diagnostics，Rotkreuz，Switzerland)檢測抗原vWF。
從血液血漿萃取並水解進葡萄糖單體單元後，量化HES濃度(H.Frster等人，Infusionstherapie 1981；288-94)。與0.5ml KOH溶液35％(w/w)(Fluka，Buchs，Switzerland)混合後，血漿樣品(1ml)在100℃下培養60分鐘。通過將10ml冰冷無水乙醇(Fluka，Buchs，Switzerland)加到反應混合物的上清液中，然後在2N HCl(Fluka，Buchs，Switzerland)中在100℃下酸水解60分鐘，使HES沉澱。使用基於己糖激酶/葡萄糖6-磷酸酯酶(Boehringer Mannheim，Darmstadt，Germany)的酶測試藥盒進行葡萄糖測定。
使用實際劑量和灌輸時間，在恆定灌輸速率下，假設兩容器模型，計算藥物動力學參數(WinNonlin，Version 4.1，Pharsight Corp.，Mountainview，CA)。
統計分析各值以平均值±標準偏差表示。利用JMP 5.1統計包(SASInstitute，Inc.，Cary，NC)，比較具有較高分子量(500和900kD)的兩種HES溶液與低分子量(130kD)溶液。結合Bonferroni修正利用兩側ANOVA分析測試溶液和時間效果的相互作用。為統計分析藥物動力學參數，使用Student未配對t測試。p＜0.05被認為具有統計顯著性。
應用實施例為進下述體內實驗，使用平均分子量(Mw)為500,000和900,000道爾頓和相同摩爾取代(MS＝0.42)和相同C2/C6比(4.83)的本發明的羥乙基澱粉(在下面的應用實施例中，分別稱作HES 500/0.42和HES900/0.42)(參見HES原料的製備實施例)。使用0.2μm過濾柱(Sartpore；Sartorius)將兩種羥乙基澱粉(HES 900/0.42和HES 500/0.42)溶解在0.9％鹽水中，濃度為6％，進行滅菌過濾，裝入玻璃瓶中，在121℃下熱滅菌15分鐘。具有相同MS和C2/C6比的低分子量羥乙基澱粉(Mw＝130,000道爾頓)(在下面的應用實施例中，稱作HES 130/0.42)用作對比溶液，也在0.9％鹽水中達到6％濃度。如上所述按與本發明的高分子量澱粉相同的反應得到，因此僅分子量有區別。
檢測血漿去除及其對血凝物的影響將30頭豬隨機分成3組，每組10頭。一組靜脈灌輸HES 900/0.42，另一組灌輸HES 500/0.42，第三組灌輸HES 130/0.42作為對比。在所有情況下，劑量是每kg體重20ml HES溶液，每種溶液都是6％，灌輸30分鐘。為進行灌輸和隨後血液取樣，麻醉動物(氟烷麻醉)和進行控制呼吸。在灌輸開始之前，灌輸5，20，40，60，120和240分鐘之後，以及灌輸結束後24小時，進行血液取樣。在得到的血液樣品和血漿樣品中，測定下列參數血液和血漿粘度，HES濃度，凝血素時間，部分促凝血酶原激酶時間，血管性血友病因子，因子VIII和瑞斯西丁素輔助因子以及通常的凝血彈性描記特徵。從灌輸結束到其後24h的HES濃度過程，計算濃度對時間曲線下的面積(＝AUC，曲線下的面積)，α和β半衰期以及去除率。根據log-線性梯形規則計算AUC，基於兩容器模型計算其餘藥物動力學參數。得到2個半衰期α和β，α半衰期指HES從中央容器(基本上相應於血管內空間)轉移到外容器，β半衰期指相反方向的反向分布。
HES濃度和藥物動力學參數過程表明高分子量變體(HES 900/0.42和HES 500/0.42)比低分子量HES(HES 130/0.42)具有更長的血漿停留時間。因此，與低分子量對照相比，高分子量變體中AUC明顯更大，α半衰期明顯更長；因此，高分子量HES類型的去除率明顯低於低分子量HES。
然而，令人驚訝和先前完全不可能知道的中或高分子量HES(HES200/0.5；HES 200/0.6；HES 450/0.7)，在本發明的高分子量變體和低分子量對比溶液(參見

圖1)間，″在灌輸後24小時″時血漿濃度沒有相關差異。這意味著在灌輸後的階段內，本發明的高分子量羥乙基澱粉具有比低分子量對比HES明顯長的血漿停留時間，這對容量效率很關鍵，但與先前已知的高分子量HES相比，它們沒有在循環中積聚的趨勢。相反，本發明的HES變體，象低分子量對比HES一樣，灌輸後循環24小時，基本上完全消失。
表4
表4濃度對時間曲線下的面積(AUC)，去除率(CL)，在豬中灌輸20ml/kg的6％HES 130/0.42，6％HES 500/0.42和6％HES 900/0.42後的α和β半衰期(t1/2α和t1/2β)。
使用Student未配對t測試在HES 500和HES 900間進行顯著性測試，並與HES 130/0.42比較；*p＜0.01；**p＜0.001。
與低分子量物質(HES 130/0.42)，高分子量HES物質(HES 500/0.42和HES 900/0.42)表現出更大的濃度對時間曲線下的面積(AUC)，相應於血管內空間中的更長停留時間，明顯更長的初始血漿半衰期(t1/2α)和明顯更低的去除率。
圖1表明在豬中灌輸20ml/kg的各HES溶液之後，低分子量HES(HES 130/0.42)和高分子量HES(HES 500/0.42和HES 900/0.42)在血漿中的濃度過程。開始時，與HES 130/0.42相比(也參見表4藥物動力學參數)，HES 500/0.42和HES 900/0.42從血管內空間的去除更慢；然而，在去除結束階段，即灌輸結束後24h，在血漿濃度間不再有相關差異(平均濃度低於0.2g/l，在測定限制的範圍內)。
因此，已經發現，一方面本發明的羥乙基澱粉與現有低分子量參照溶液(HES 130/0.42)相比具有更長的初始血漿半衰期，但是另一方面，其可在灌輸後24小時內從循環中去除，就象低分子量對比製劑一樣容易，這一點很有利。
此外，進行的凝結分析(血漿凝結測試，凝血彈性描記法，測定vWF濃度)得到出乎意料的結果，因為結果完全不同於以前用高分子量HES製劑所得到的結果。儘管與低分子量HES溶液相比，中分子量和具有更明顯程度的高分子量羥乙基澱粉經常先前在抑制凝結能力方面表現出更強的血凝物損害(J.Treib等人，Intensive Care Med.(1999)，pp.258～268；R.G.Strauss等人，Transfusion(1988)，pp.257-260)，但是在本發明的高分子量HES製劑和已知的低分子量對比溶液間沒有發現明顯差異(參見表5)。
表5
表5表明在豬中分別灌輸20ml/kg的6％HES 130/0.42，6％HES500/0.42和6％HES 900/0.42後，血漿凝結參數凝血素時間(PT)，活化部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)，血管性血友病因子功能活性(vWFfunctional)和血管性血友病因子抗原濃度(vWF antigenic)的時間過程以及凝血彈性描記法的凝結指數(CI)的時間過程。使用兩側ANOVA，在HES 500/0.42和HES 900/0.42間進行統計顯著性測試(溶液和時間效果的相互作用)，分別與HES 130/0.42比較。儘管在血漿中具有較高分子量，較高濃度和較長停留時間(參見圖1和表4)，但是本發明的高分子量HES物質(HES 500/0.42和HES 900/0.42)不會象低分子量HES(HES130/0.42)一樣有任何高程度地影響血凝物。
換句話說，儘管通過增大分子量得到了更長的血漿停留時間，但是本發明的羥乙基澱粉沒有表現出已知高分子量溶液的缺點，如損害血凝物。
此外，在動物實驗研究中令人驚訝地發現，與低分子量HES和已知的高分子量羥乙基澱粉相比，本發明的高分子量羥乙基澱粉不會增大血液和血漿粘度。在低剪切力下，在本發明的羥乙基澱粉中比低分子量HES具有更低的粘度(參見表6血漿粘度)。
表6
表6表明在豬中分別灌輸20ml/kg的6％HES 130/0.42，6％HES500/0.42和6％HES 900/0.42後，低和高剪切力下的血漿粘度(γ＝1/s和γ＝128/s)的時間過程。使用兩側ANOVA，在HES 500/0.42和HES900/0.42間進行統計顯著性測試(溶液和時間效果的相互作用)，分別與HES 130/0.42比較，在高分子量HES物質(HES 900和HES 500)和低分子量HES(HES 130)間沒有任何差異。在低剪切力下，在血漿粘度中溶液和時間效果的相互作用在高分子量HES物質(HES 500/0.42和HES900/0.42)中比低分子量HES(HES 130/0.42)更低。然而，這是由於時間原因而不是溶液作用。在高剪切力下，沒有差異；特別地，血漿粘度在高分子量HES物質(HES 900/0.42和HES 500/0.42)間沒有比低分子量HES(HES 130/0.42)更高。
因此，血漿粘度在本發明的HES溶液中沒有增大。血漿粘度沒有增大的事實是令人驚訝的，因為公開在US-A-5,502,043(比較例3)中的可相比分子量為500,000的羥乙基澱粉中血漿粘度增大。如果粘度沒有增大，這將導致未受擾亂的毛細灌注(大循環)和向組織改進的營養氧供應。
除了上述體內研究外，也進行體外研究，其中特別測試了C2/C6比對血凝物的影響，即使用凝血彈性描記法。為此，製備低MS(0.4)和低(3∶1)，中(7∶1)或高(12∶1)C2/C6比的三種高分子量HES溶液(Mw800kD)，並檢測如下。從30個男性和女性外科患者(排除標準已知的凝結紊亂，用血凝物抑制劑處理，手術之前的5天內吸收乙醯基水楊酸或其他非膽固醇類抗炎藥物)，在麻醉開始階段採集血液樣品。在每一血液樣品中，用凝血彈性描記法測量凝結，即未稀釋的血液和用三種HES溶液(HES 800/0.4/3∶1；HES 800/0.4/7∶1和HES 800/0.4/12∶1)的每一種體外血液稀釋(20％，40％和60％)。與體內研究中相同，測定的參數是凝結指數(CI)，綜合了凝血彈性描記法的各部分功能。CI值的平均值(±SD)列於下表7中，即偏離未稀釋血液樣品的CI。
表7
在所有血液稀釋階段，相對於天然血液而言，CI下降較少，即血凝物影響越小，用於血液稀釋的HES的C2/C6比越低。血液稀釋系列間的溶液作用具有顯著差異(p＜0.05；ANOVA)。結果表明，羥乙基澱粉的C2/C6比降低有利於對血凝物的影響，即在這種情況下，與高C2/C6比相比，低C2/C6比抑制血凝物更小。因這使用HES溶液，所以這很重要，尤其是在創傷或手術引起的出血後作為血漿代用品，在這種情況下，不必須抑制血凝物加到血液損失中。上述研究結果進一步表明，HES溶液的C2/C6比對血凝物具有固有影響，與HES的其他分子參數和其在循環中的行為無關。這在以前是未知的。
權利要求
1.一種羥乙基澱粉，其平均分子量Mw大於或等於500,000，特徵在於摩爾取代的MS為0.25-0.5，和C2/C6比為2-小於8。
2.如權利要求1所述的羥乙基澱粉，特徵在於所述摩爾取代的MS為0.35-0.5，優選為0.39-小於或等於0.45，特別是大於0.4到0.44。
3.如權利要求1和2中任一項所述的羥乙基澱粉，特徵在於所述平均分子量為大於600,000到1,500,000，優選620,000-1,200,000，更優選700,000-1,000,000。
4.如權利要求1-3任一項所述的羥乙基澱粉，特徵在於所述C2/C6比為2-7，優選2.5-小於或等於7，更優選2.5-6，再更優選4-6。
5.如權利要求1～4中任一項所述的羥乙基澱粉，特徵在於從蠟質玉米澱粉中得到。
6.一種藥劑，含有如權利要求1～5中任一項所述的羥乙基澱粉。
7.如權利要求6所述的藥劑，特徵在於是水溶液或膠體水溶液形式。
8.如權利要求6或7中任一項所述的藥劑，特徵在於所述羥乙基澱粉濃度達到20％，優選0.5-15％，更優選2-12％，特別是4-10％，例如，6％。
9.如權利要求6-8中任一項所述的藥劑，特徵在於還含有氯化鈉，優選濃度為0.9％。
10.如權利要求6-9中任一項所述的藥劑，特徵在於還包括調節血漿的電解質。
11.如權利要求6-10中任一項所述的藥劑，特徵在於是緩衝溶液形式和/或含有能夠代謝的陰離子的溶液形式。
12.如權利要求6-11中任一項所述的藥劑，特徵在於是高滲溶液形式。
13.如權利要求6-12中任一項所述的藥劑，特徵在於經滅菌過濾或熱滅菌。
14.如權利要求6-13中任一項所述的藥劑，特徵在於是容量代用品。
15.如權利要求6-14中任一項所述的藥劑，特徵在於含有藥學活性成分或活性成分組合物。
16.如權利要求6-15中任一項所述的藥劑，用於製備血漿代用品或血漿增容劑的用途。
17.一種製備羥乙基澱粉的方法，優選製備如權利要求1-5中任一項所述的羥乙基澱粉，特徵在於(i)使懸浮於水中的澱粉，優選玉米澱粉，與環氧乙烷反應；和(ii)使用酸、優選鹽酸，部分水解得到的澱粉衍生物，直到羥乙基澱粉達到所需的平均分子量範圍。
18.如權利要求17所述的方法，特徵在於將鹼化劑，優選NaOH，加到所述懸浮於水中的澱粉中。
19.如權利要求17或18中任一項所述的方法，特徵在於鹼化劑加到所述懸浮澱粉中，所述的量要使鹼化劑與澱粉的摩爾比大於0.2，優選為0.25-1，特別是0.3-0.8。
20.如權利要求17-19中任一項所述的方法，特徵在於還包括如下步驟(iii)滅菌過濾，和可選擇地(iv)超濾。
21.如權利要求6-15中任一項所述的藥劑，用於保持血量正常和/或用於改進大循環和微循環和/或用於改進營養氧供應和/或用於穩定血液動力學和/或用於改進容量效率和/或用於降低血漿粘度和/或用於提高耐貧血症性和/或用於在被擾亂的血液供應和動脈、特別是外周動脈閉塞性疾病中進行血液稀釋、特別是治療性血液稀釋中的用途。
22.一種藥盒，各自包括(i)如權利要求1-5中所述的羥乙基澱粉；(ii)無菌鹽溶液，優選氯化鈉溶液；和可選擇地(iii)藥學活性成分或活性成分組合物。
23.如權利要求22所述的藥盒，特徵在於各成分(i)，(ii)和可選擇地(iii)位於多隔室袋中的分開的隔室內。
全文摘要
本發明公開了一種羥乙基澱粉，其製備方法，含有這種羥乙基澱粉的藥劑，這種藥劑用於製備容量代用品，血漿代用品或血漿增容劑的用途，以及這種藥劑用於保持血量正常和/或用於改進大循環和微循環和/或用於改進營養氧供應和/或用於穩定血液動力學和/或用於改進容量效率和/或用於降低血漿粘度和/或用於提高耐貧血症性和/或用於在被擾亂的血液供應，和動脈、特別是外周動脈閉塞性疾病中進行血液稀釋、特別是治療性血液稀釋中的用途。
文檔編號A61K47/36GK1926155SQ200580006765
公開日2007年3月7日 申請日期2005年3月1日 優先權日2004年3月1日
發明者麥可·博爾, 安德烈亞斯·菲施, 多納特·R·施潘 申請人:B·布朗·梅爾松根有限公司