愈傷組織誘導培養基及其製備方法、使用方法與流程
2023-07-21 02:31:27 1
本發明涉及植物組織培養的技術領域，更具體地說，涉及一種愈傷組織誘導培養基及其製備方法、使用方法。
背景技術：
綠蘿(學名:Epipremnum aureum)，屬於天南星科麒麟葉屬植物，大型常綠藤本，生長於熱帶地區，常攀援生長在雨林的巖石和樹幹上，其纏繞性強，氣根發達，可以水培種植。
綠蘿是非常優良的室內裝飾植物之一，攀藤觀葉花卉。蘿莖細軟，葉片嬌秀。在家具的櫃頂上高置套盆，任其蔓莖從容下垂，或在蔓莖垂吊過長後圈吊成圓環，宛如翠色浮雕。這樣既充分利用了空間，淨化了空氣，又為呆板的櫃面增加了線條活潑、色彩明快的綠飾，極富生機，給居室平添融融情趣。形態特徵：綠蘿藤長數米，節間有氣根，隨生長年齡的增加，莖增粗，葉片亦越來越大。葉互生，綠色，少數葉片也會略帶黃色斑駁，全緣，心形。它的花語「守望幸福」也增加了其可觀賞度。
環保學家發現，一盆綠蘿在8～10平方米的房間內就相當於一個空氣淨化器，能有效吸收空氣中甲醛、苯和三氯乙烯等有害氣體。綠蘿不但生命力頑強，而且在室內擺放，其淨化空氣的能力不亞於常春藤和吊蘭。新鋪的地板非常容易產生有害物質。由於綠蘿能同時淨化空氣中的苯、三氯乙烯和甲醛，因此非常適合擺放在新裝修好的居室中。
綠蘿還具有很好的藥用價值，具有活血散瘀的功效。可以治療跌打損傷。
植物組織培養中要用到各種培養基。培養基是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配製的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。不同培養基可根據實際需要，添加一些自身無法合成的化合物，即生長因子。
但是目前，還沒有專門適合於綠蘿組織培養的培養基，嚴重影響了對綠蘿這種經典材料的研究。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於克服現有技術的缺陷，提供了一種愈傷組織誘導培養基，培養基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂粉，以及第一基礎培養基MS培養基；
第一基礎培養基MS培養基pH值為5.5-5.8；
第一基礎培養基MS培養基以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/4，微量元素為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，並添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、穀氨酸150mg/L。
在某些實施方式中，如權利要求1所述的愈傷組織誘導培養基，所述6-苄氨基腺嘌呤的濃度為2.0mg/L、萘乙酸的濃度為0.2mg/L、蔗糖20-30g/L、瓊脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基的製備方法，包括以下步驟：
步驟一：將6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、瓊脂粉分別滅菌，3-5℃保存備用；
步驟二：第一基礎培養基MS培養基溶解，加入6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、瓊脂粉溶液，製得愈傷組織誘導培養基；
步驟三：將定容好的的培養基PH調到5.5-5.8。
步驟四：將配製好的培養基進行高溫滅菌，製得第一愈傷組織誘導培養基。
在某些實施方式中，所述步驟一中的滅菌方法為抽濾滅菌或高溫滅菌；滅菌完成後20-25℃放置。
在某些實施方式中，所述步驟三中高溫滅菌的溫度為121℃，滅菌時間為30min。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基，培養基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、水解酪蛋白、蔗糖、瓊脂粉，以及第二基礎培養基MS培養基；
第二基礎培養基MS培養基pH值為5.5-5.8；
第二基礎培養基MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，並添加精氨酸100mg/L、天冬氨酸50mg/L、穀氨酸200mg/L。
在某些實施方式中，所述6-苄氨基腺嘌呤的濃度為3.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤0.1mg/L、吲哚丁酸的濃度為0.1mg/L、蔗糖20-30g/L、萘乙酸0.2mg/L、瓊脂粉7g/L。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基的使用方法：將綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成小段，將其接種於愈傷組織誘導培養基中誘導形成愈傷組織後接種於愈傷組織的繼代培養基中增殖獲得緻密愈傷組織。
在某些實施方式中，所述誘導增殖的步驟包括：
步驟一：利用第一愈傷組織誘導培養基在溫度為23～25℃、溼度為50～65％的條件下，黑暗培養5～15天後給予1500～20001x光照繼續培養，15～25天得到初期綠蘿愈傷組織；
步驟二：將初期綠蘿愈傷組織轉接於第二愈傷組織誘導培養基在溫度為25～28℃、溼度為50～65％條件下，暗培養一周後給予光照條件20001x，繼續培養，加速愈傷組織的形成。
在某些實施方式中，所述綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成小段；小段的長度為2～3cm；常規消毒後用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10～15分鐘。
本發明提供的愈傷組織誘導培養基相對於現有技術的有益效果是：愈傷組織一方面可研究植物生長發育及分化的機制、遺傳變異規律，對植物遺傳育種具有特殊意義。
另一方面可用於大規模工廠化生產有用化合物，或用於細胞培養篩選工業、農業、醫藥生產上有用的無性系，或用於原生質體培養中的原生質體來源等。實踐證明，愈傷組織培養不僅是一種植物快繁的新手段，同時也是植物改良，種質保存和有用化合物生產的理想途徑。本發明利用愈傷組織誘導培養基進行綠蘿的生產，通過組織培養技術對綠蘿頂芽或帶節莖段進行培養與快速繁殖，繁育處的綠蘿種苗品質優良，為綠蘿規模化生產提供了較好的技術支持。
實驗結果表明組織培養的綠蘿無菌苗，可大量節約母本地，縮短生產周期，避免或減小天氣等不良因素引起的病蟲害。
同時，以該愈傷組織誘導培養基誘導綠蘿頂芽或帶節莖段為繁殖材料更容易誘導成功。
愈傷組織誘導培養基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、瓊脂粉，以及基礎培養基MS培養基。
其中，6-苄氨基腺嘌呤有味6-BA。是人工合成的細胞分裂素。6-BA具有抑制植物葉內葉綠素、核酸、蛋白質的分解，保綠防老；將胺基酸、生長素、無機鹽等向處理部位調運等多種效能。
其中，萘乙酸(1-NapHthaleneacetic acid)，簡稱NAA。萘乙酸是促進植物根系生長的植物生長調節劑，也是萘乙醯胺的中間體。萘乙酸具有促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根，增加坐果，防止落果，改變雌、雄花比率等。萘乙酸可經葉片、樹枝的嫩表皮、種子進入到植物體內，隨同營養流輸導到作用部位。通常用於小麥、水稻、棉花、茶、桑、番茄、蘋果、瓜類、馬鈴薯、林木等，是一種良好的植物生長刺激素。
其中，蔗糖為細胞的分裂、擴大、增至提供必要的能量。
瓊脂粉是從植物裡提取出來的藻膠。瓊脂因為有特殊的膠凝性質，尤其有顯著的穩固性、滯度和滯後性，並且易吸收水分，有特殊的穩定效應；具有增量劑、增稠劑、乳化劑、膠凝劑、穩定劑、賦形劑、助懸劑、水分保持劑等功效。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基，培養基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、水解酪蛋白、蔗糖、瓊脂粉，以及第二基礎培養基MS培養基。
其中，吲哚丁酸促進植物主根生長，提高發芽率，成活率。用於促使插條生根。
吲哚丁酸可以作為植物主根生長促進劑，常用於木本和草本植物的浸根移栽，硬枝杆插，能加速根的生長，提高植物生根的百分率，也可用於植物種子的浸種和拌種，可提高發芽率和成活率。高濃度吲哚丁酸也可促進部分組培苗的增殖。
綜上所述，本發明提供的愈傷組織誘導培養基其具有上述諸多的優點及價值，並在同類產品中未見有類似的方法公開發表或使用而確屬創新，產生了好用且實用的效果，較現有的技術具有增進的多項功效，從而較為適於實用，並具有廣泛的產業價值。
附圖說明
應當理解的是，以下附圖僅示出了本申請的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。
圖1為誘導出的綠蘿莖段膨大體；
圖2為誘導出的綠蘿愈傷組織。
具體實施方式
下面結合具體實施例的方式對本發明的權利要求做進一步的詳細說明，在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發明。
但是本發明能夠以很多不同於在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
提供了一種愈傷組織誘導培養基，培養基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂粉，以及第一基礎培養基MS培養基；
第一基礎培養基MS培養基pH值為5.5-5.8；
第一基礎培養基MS培養基以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/4，微量元素為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，並添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、穀氨酸150mg/L。
上述，需要理解的是，MS培養基為組織的生長提供所需的碳源,氮源,水,無機物和生長因子。
可以理解的是，6-苄氨基腺嘌呤有味6-BA。是人工合成的細胞分裂素。6-BA具有抑制植物葉內葉綠素、核酸、蛋白質的分解，保綠防老；將胺基酸、生長素、無機鹽等向處理部位調運等多種效能。
可以理解的是，萘乙酸(1-NapHthaleneacetic acid)，簡稱NAA。萘乙酸是促進植物根系生長的植物生長調節劑，也是萘乙醯胺的中間體。萘乙酸具有促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根，增加坐果，防止落果，改變雌、雄花比率等。萘乙酸可經葉片、樹枝的嫩表皮、種子進入到植物體內，隨同營養流輸導到作用部位。通常用於小麥、水稻、棉花、茶、桑、番茄、蘋果、瓜類、馬鈴薯、林木等，是一種良好的植物生長刺激素。
可以理解的是，蔗糖為細胞的分裂、擴大、增至提供必要的能量。
可以理解的是，瓊脂粉是從植物裡提取出來的藻膠。瓊脂因為有特殊的膠凝性質，尤其有顯著的穩固性、滯度和滯後性，並且易吸收水分，有特殊的穩定效應；具有增量劑、增稠劑、乳化劑、膠凝劑、穩定劑、賦形劑、助懸劑、水分保持劑等功效。
在本發明實施例中，所述6-苄氨基腺嘌呤的濃度為2.0mg/L、萘乙酸的濃度為0.2mg/L、蔗糖20-30g/L、瓊脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基的製備方法，包括以下步驟：
步驟一：將6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、瓊脂粉分別滅菌，3-5℃保存備用；
步驟二：第一基礎培養基MS培養基溶解，加入6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、噻苯隆、2,4-二氯苯氧乙酸、瓊脂粉溶液，製得愈傷組織誘導培養基；
步驟三：將定容好的的培養基PH調到5.5-5.8。
步驟四：將配製好的培養基進行高溫滅菌，製得第一愈傷組織誘導培養基。
在本發明實施例中，所述步驟一中的滅菌方法為抽濾滅菌或高溫滅菌；滅菌完成後20-25℃放置。
在本發明實施例中，所述步驟三中高溫滅菌的溫度為121℃，滅菌時間為30min。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基，培養基原料包括6-苄氨基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、水解酪蛋白、蔗糖、瓊脂粉，以及第二基礎培養基MS培養基；
第二基礎培養基MS培養基pH值為5.5-5.8；
第二基礎培養基MS培養基是以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：1～5mg/L、3～6mg/L、0.5～2mg/L、0.5～3mg/L，並添加精氨酸100mg/L、天冬氨酸50mg/L、穀氨酸200mg/L。
上述，可以理解的是，吲哚丁酸促進植物主根生長，提高發芽率，成活率。用於促使插條生根。
吲哚丁酸可以作為植物主根生長促進劑，常用於木本和草本植物的浸根移栽，硬枝杆插，能加速根的生長，提高植物生根的百分率，也可用於植物種子的浸種和拌種，可提高發芽率和成活率。高濃度吲哚丁酸也可促進部分組培苗的增殖。
在本發明實施例中，所述6-苄氨基腺嘌呤的濃度為3.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤0.1mg/L、吲哚丁酸的濃度為0.1mg/L、蔗糖20-30g/L、萘乙酸0.2mg/L、瓊脂粉7g/L。
本發明還提供了一種愈傷組織誘導培養基的使用方法：將綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成小段，將其接種於愈傷組織誘導培養基中誘導形成愈傷組織後接種於愈傷組織的繼代培養基中增殖獲得緻密愈傷組織。
上述，愈傷組織一方面可研究植物生長發育及分化的機制、遺傳變異規律，對植物遺傳育種具有特殊意義。
另一方面可用於大規模工廠化生產有用化合物，或用於細胞培養篩選工業、農業、醫藥生產上有用的無性系，或用於原生質體培養中的原生質體來源等。實踐證明，愈傷組織培養不僅是一種植物快繁的新手段，同時也是植物改良，種質保存和有用化合物生產的理想途徑。本發明利用愈傷組織誘導培養基進行綠蘿的生產，通過組織培養技術對綠蘿頂芽或帶節莖段進行培養與快速繁殖，繁育處的綠蘿種苗品質優良，為綠蘿規模化生產提供了較好的技術支持。
需要理解的是，組織培養的綠蘿無菌苗，可大量節約母本地，縮短生產周期，避免或減小天氣等不良因素引起的病蟲害。
同時，以該愈傷組織誘導培養基誘導綠蘿頂芽或帶節莖段為繁殖材料更容易誘導成功。
在本發明實施例中，所述誘導增殖的步驟包括：
步驟一：利用第一愈傷組織誘導培養基在溫度為23～25℃、溼度為50～65％的條件下，黑暗培養5～15天後給予1500～20001x光照繼續培養，15～25天得到初期綠蘿愈傷組織；
步驟二：將初期綠蘿愈傷組織轉接於第二愈傷組織誘導培養基在溫度為25～28℃、溼度為50～65％條件下，暗培養一周後給予光照條件20001x，繼續培養，加速愈傷組織的形成。
在本發明實施例中，所述綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成小段；小段的長度為2～3cm；常規消毒後用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10～15分鐘。
為了便於理解本發明，下面結合實施例來進一步說明本發明的技術方案。申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細工藝設備和工藝流程，但本發明並不局限於上述詳細工藝設備和工藝流程，即不意味著本發明應依賴上述詳細工藝設備和工藝流程才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
實施例1
愈傷組織誘導培養基誘導增殖的步驟包括：將綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成2cm小段，常規消毒後用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10分鐘；
步驟一：利用第一愈傷組織誘導培養基在溫度為23℃、溼度為50％的條件下，黑暗培養10天後給予1500x光照繼續培養，20天得到初期綠蘿愈傷組織；
步驟二：將初期綠蘿愈傷組織轉接於第二愈傷組織誘導培養基在溫度為25℃、溼度為50％條件下，暗培養一周後給予光照條件20001x，繼續培養，加速愈傷組織的形成；
其中，第一愈傷組織誘導培養基中包括6-苄氨基腺嘌呤的濃度為2.0mg/L、萘乙酸的濃度為0.2mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，以及第一基礎培養基MS培養基；
第一基礎培養基MS培養基pH值為5.5；
第一基礎培養基MS培養基以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/4，微量元素為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：1mg/L、3mg/L、0.5mg/L、0.5mg/L，並添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、穀氨酸150mg/L。
實施例2
愈傷組織誘導培養基誘導增殖的步驟包括：將綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成4cm小段，常規消毒後用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡10分鐘；
步驟一：利用第一愈傷組織誘導培養基在溫度為25℃、溼度為65％的條件下，黑暗培養15天後給予21000x光照繼續培養，25天得到初期綠蘿愈傷組織；
步驟二：將初期綠蘿愈傷組織轉接於第二愈傷組織誘導培養基在溫度為28℃、溼度為65％條件下，暗培養一周後給予光照條件20001x，繼續培養，加速愈傷組織的形成；
其中，第一愈傷組織誘導培養基中包括6-苄氨基腺嘌呤的濃度為2.0mg/L、萘乙酸的濃度為0.2mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，以及第一基礎培養基MS培養基；
第一基礎培養基MS培養基pH值為5.8；
第一基礎培養基MS培養基以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/4，微量元素為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：5mg/L、6mg/L、2mg/L、3mg/L，並添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、穀氨酸150mg/L。
實施例3
愈傷組織誘導培養基誘導增殖的步驟包括：將綠蘿莖段消毒後在無菌條件下切割成3cm小段，常規消毒後用可溶性聚乙烯吡硌烷酮2g/L浸泡15分鐘；
步驟一：利用第一愈傷組織誘導培養基在溫度為25℃、溼度為65％的條件下，黑暗培養10天後給予2000lx光照繼續培養，25天得到初期綠蘿愈傷組織；
步驟二：將初期綠蘿愈傷組織轉接於第二愈傷組織誘導培養基在溫度為26℃、溼度為60％條件下，暗培養一周後給予光照條件2000lx，繼續培養，加速愈傷組織的形成；
其中，第一愈傷組織誘導培養基中包括6-苄氨基腺嘌呤的濃度為2.0mg/L、萘乙酸的濃度為0.2mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂粉7g/L、噻苯隆0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，以及第一基礎培養基MS培養基；
第一基礎培養基MS培養基pH值為5.8；
第一基礎培養基MS培養基以MS培養基為基礎，在其它成分不變的條件下調整大量元素的含量為原量的1/4，微量元素為原量的1/2，調整肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的含量分別為：3mg/L、4mg/L、1.5mg/L、1.5mg/L，並添加精氨酸50mg/L、天冬氨酸100mg/L、穀氨酸150mg/L。