改變植物細胞壁組成以改善生物燃料生產和青貯飼料可消化性的方法
2023-07-21 16:33:01
改變植物細胞壁組成以改善生物燃料生產和青貯飼料可消化性的方法
【專利摘要】本發明提供使用高爾基體靶向酶核酸及其編碼蛋白質改變植物中所述非纖維素多糖表達的方法。本發明提供涉及改變植物中阿魏醯化、乙醯化和交聯，使可用於生物燃料生產的生物質和青貯飼料可消化性改善的方法和組分。本發明還提供包含所述核酸的重組表達盒、宿主細胞和轉基因植物。
【專利說明】改變植物細胞壁組成以改善生物燃料生產和青貯飼料可消化性的方法
【技術領域】
[0001]本發明整體涉及植物生物化學和分子生物學。更具體地講，其涉及酶、丁醇、乙醇、核酸以及調節它們在植物中的存在的方法。
【背景技術】
[0002]2010年，美國的乙醇生產使用了總玉米作物的大約37%。由於人口的增長帶來的全球食物需求增加，乙醇生產的當務之急是探究除穀物之外的其他原料來源。在穀物收割後，稱為秸杆的作物殘茬留在田地中。玉米植物中秸杆的比例大約與穀物相同，並且2/3的稻杆可 移除而不會顯著影響土壤有機質含量(Dhugga, (2007)Crop Sc1.47:2211-2227 (Dhugga, 2007 年，《作物科學》，第 47 卷，第 2211-2227 頁)；Graham, et al.，(2007)Agronomy Journal99:1-11 (Graham 等人,2007 年，《農藝學雜誌》，第 99 卷，第1-11 頁),Johnson Et al., (2006) Journal of Soil and Water Conservation61:120A-125A (Johnson 等人，2006 年，《水土保持雜誌》，第 61 卷，第 120A-125A 頁),Perlack,et al.,(2005)Biomass as Feedstock for a Bioenergy and Bioproducts Industry:TheTechnical Feasibility of a Billion-Ton Annual Supply.U.S.Department of Energy,Oak Ridge, Tennessee (Perlack等人,2005年，《生物質作為生物能源和生物製品行業的原料:年供應十億噸的技術可行性》，美國能源部，田納西州橡樹嶺)，Wilhelm，et al.，(2004)Agronomy Journal96:1-17 (Wilhelm 等人,2004 年,《農藝學雜誌》,第 96 卷,第 1-17 頁))。一旦從作物殘茬製備糖得以理順頁和簡化，則玉米秸杆單獨即可顯著貢獻於乙醇生產。
[0003]丁醇由於其低氧碳比及其不吸水的能力是作為生物燃料的醇的優選形式。乙醇吸水，會促使供應管道的腐蝕，而丁醇可克服該問題。液體燃料通過管道的運輸比通過機動有軌車更經濟。作物殘茬可基本上視為可用於生產這些醇(取決於哪種技術更有效)中的任何一者的糖平臺(Dhugga，2007 (Dhugga，2007年))。幾乎所有作物殘茬由細胞壁組成，所述細胞壁由嵌入半纖維素和木質素基質的纖維素微纖絲構成。還存在少量蛋白質和礦物質。草中的半纖維素主要由葡萄糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖(GAX)，即一種帶有阿拉伯糖基和葡萄糖醒酸基殘基作為側基的木聚糖主鏈(Carpita, (1996)Annual Review OfPlantPhysiology And Plant Melecular Biology47:445-476 (Carpita, 1996 年,《植物生理學和植物分子生物學年評》，第47卷，第445-476頁))構成。此外，乙醯基在木糖基殘基的第2個和第3個碳處酯化。GAX中所有木糖基殘基的大約1/2至1/3在玉米中是乙醯化的，然而，乙酸(acetate)含量在物種間變化(Dhugga, 2007 (Dhugga, 2007年))。GAX中阿拉伯糖基殘基在聞爾基體中阿魏酸化。
[0004]從玉米秸杆生產乙醇還未帶來商業利潤，主要是因為工藝中有兩個瓶頸，即預處理成本和發酵效率。預處理用於鬆弛細胞壁，並且據信斷裂木質素-木質素和木質素-多糖交聯鍵，從而增加細胞壁的碳水化合物部分與水解酶的可接近性(Dhugga，2007 (Dhugga, 2007年))。通過遺傳選擇或工程減少木質素幾乎一定會導致生物質產量的下降(Pedersen, et al.，(2005) Crop Science45:812-819 (Pedersen 等人，2005 年，《作物科學》，第45卷，第812-819頁))。本發明顯示減少細胞壁的阿魏酸含量而不對植物生物質產生不利影響是可能的。
[0005]乙酸在發酵單胞菌(Zymomonas)和酵母(yeast) 二者中是已知的發酵抑制劑(Franden, et al., (2009)Journal of Biotechnologyl44:244-259 (Franden 等人，2009 年，《生物技術雜誌》，第 144 卷，第 244-259 頁)；Ho, et al.，(1999) 「SuccessfulDesign and Development of Genetically Engineered Saccharomyces Yeasts forEffective Cofermentation of Glucose and Xylose from Cellulosic Biomass toFuel Ethanol，，Advances in Biotechnology/Engineering Vol.45, Ed.Th.Scheper,Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (Ho等人，1999年用於從纖維素類生物質至燃料乙醇的葡萄糖和木糖有效共發酵的基因工程酵母(Saccharomyces)的成功設計和開發」，《生物技術/工程進展》，第45卷，Th.Scheper編輯，施普林格出版社，柏林海德堡))。隨著乙醇行業的同步糖化發酵(SSF)趨勢，乙酸在生物質預處理後留在處理罐中，因此會干擾發酵。
[0006]半纖維素多糖首先在高爾基體中製備，然後通過胞吐作用輸出到細胞壁(Northcote and Pickett-Heaps, (1966)Biochemical Journal98:159-167(Northcote 和Pickett-Heaps，1966 年，《生物化學雜誌》，第 98 卷，第 159-167 頁)；Ray, et al.，(1976)Ber.Deutsch.Bot Ges.Bd89:121-146 (Ray等人，1976年，《德國植物學會雜誌》，第89卷，第121-146頁))。雖然通過突變遺傳學鑑定了影響細胞壁木聚糖含量的多個基因，但GAX生物合成的確切機制仍不清楚，使其成為通過影響高爾基體生物合成機制來改變細胞壁組成的挑佔戈(Scheller and Ulvskov, (2010)Hemicelluloses.Annual Review of Plant Biology,pp263-289(Scheller和Ulvskov,2010年，「半纖維素」，《植物生物學年評》，第263-289頁))。
[0007]通過幹擾單木質醇生物合成途徑下調木質素已在多個經濟作物植物中實現；然而，這伴有生物質產量下降。通過改變青貯飼料或乙醇生產的生物質來改善可消化性不足以克服生物質產量下降導致的損失(Dhugga, 2007 ；Pedersen, Vogel, andFunnell2005 (Dhugga, 2007 年；Pedersen、Vogel 和 Funnell, 2005 年))。通過改變馬鈴薯中
的果膠結構來重塑細胞壁的先前嘗試獲得了成功(Skj0t, et al.,2002( Skj0t等人,2002
年))。
[0008]阿魏醯化(從而交聯)程度以及乙醯基含量的下調提高了用於生物燃料的生物質的品質。非纖維素細胞壁多糖首先在高爾基體中合成，然後通過胞吐作用輸出到細胞壁。通過使水解酶或酯酶靶向高爾基體隔室來幹擾細胞壁基質多糖的生物合成可以是改變細胞壁組成的另一個手段。高爾基體中各組複合多糖特異性酯酶或糖苷酶的異位表達會導致細胞壁組成的改變。
【發明內容】
[0009]一般來講，本發明的目的是提供與非纖維素細胞壁多糖相關的核酸和蛋白質。本發明的目的是提供包含本發明的核酸的轉基因植物以及調節轉基因植物中本發明核酸的表達的方法，以這樣的方式來改變植物中的乙酸濃度。
[0010]因此，在一個方面，本發明涉及包含選自如下成員的分離的核酸(a)與編碼本發明多肽的多核苷酸具有特定序列同一'I"生的多核苷酸；(b)與(a)的多核苷酸互補的多核苷酸以及(C)包含特定數量來自(a)或(b)的多核苷酸的連續核苷酸的多核苷酸。分離的核酸可以是DNA。
[0011]在其他方面，本發明涉及:1)重組表達盒，包含可操作地連接至啟動子的本發明的核酸，2)重組表達盒所引入到的宿主細胞，3)包含重組表達盒的轉基因植物以及4)包含含有不止一種本發明的核酸的重組表達盒的轉基因植物，每種核酸可操作地連接至啟動子。此外，本發明還涉及通過雜交和雜化來自不同轉化體的重組盒而組合。宿主細胞和植物任選地來自玉米、小麥、大米、甘蔗、向日葵、草或大豆。
[0012]在其他方面，本發明涉及改變細胞壁組成和物理性狀的方法，包括但不限於通過引入一種或多種編碼本發明多肽的多核苷酸來雜交並提高生物質品質，所述多核苷酸在表達時導致細胞壁乙酸含量減少以及植物中的糖組成改變。本發明的另外方面包括用於處理非纖維素多糖(例如高爾基體中生成的那些)的最終用途，或者轉基因植物直接用作最終產品(例如青貯飼料)或在處理後間接用於本領域的技術人員已知的此類用途(例如但不限於乙醇和其他生物燃料)的方法和轉基因植物。另外，本領域的技術人員將認識到本發明的多核苷酸和編碼多肽可以單個或多個，在本領域中有時稱為序列或性狀「堆疊」，引入宿主細胞或轉基因植物。預期本發明涵蓋這些組分和方法。
[0013]另外的方法包括但不限於:
[0014]減少植物中的乙酸和/或阿魏酸(ferulate)含量的方法，該方法包括表達裂解乙醯基或阿魏醯基取代基的酶以及使裂解酶靶向高爾基體的一個或多個組分或操作內源性酶。此外在該方法中，其中酶是乙醯酯酶或阿魏醯酯酶。另外在該方法中，其中與不表達靶向高爾基體的酯酶的植物 相比植物生物質基本上不減少。並且在同樣的方法中，其中靶向高爾基體的酶是:乙醯酯酶、阿魏醯酯酶和/或阿拉伯糖苷酶。
[0015]還設想了包括如下步驟的前述方法:用包含編碼異源酯酶的多核苷酸的載體轉化植物細胞，使所述酶的表達靶向高爾基體，保持所述水解酶在高爾基體中的表達以及使所述植物在植物生長條件下生長。除那些方法步驟之外，該方法還通過多核苷酸的過表達改善植物的生物質組成。另外在同樣的方法中，其中:乙醇生產得到改善，轉化植物細胞還包含一種或多種編碼水解酶、酯酶、糖基轉移酶或阿拉伯呋喃糖苷酶的異源多核苷酸，與非轉化植物相比轉化植物細胞壁多糖在較高速率下降解或轉化為木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖或它們的組合，與非轉化植物相比植物細胞壁乙酸濃度下降，與非轉化植物相比植物細胞壁阿魏醯化減少，與非轉化植物相比植物細胞壁交聯減少，和/或植物選自:玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、草、草坪草、芒草、柳枝稷和可可。
[0016]還設想了通過植物中的高爾基體靶向酶調節植物組織生長的方法，包括表達包含可操作地連接至啟動子的前述方法的多核苷酸的重組表達盒。除此之外，該方法其中:植物選自:玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、草、草坪草、芒草、柳枝稷和可可，植物具有改善的青貯飼料品質和可消化性，啟動子選自葉特異性啟動子、維管元件偏好啟動子和根特異性啟動子。
[0017]本發明的實施例包括前述方法，其包括表達編碼與選自SEQ ID NO:4_18、59、62、65、68、70和71的多肽具有至少85%的序列相似性的多肽的多核苷酸。[0018]一個實施例將是前述方法的轉基因植物細胞，其中包含重組表達盒的細胞壁含量改變，所述重組表達盒包括表達編碼與選自SEQ ID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的多肽具有至少85%的序列相似性的多肽的多核苷酸，其中所述植物是:單子葉植物、雙子葉植物，其選自:玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、草、甘蔗、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、芒草、草坪草、柳枝稷和小米。
[0019]另外的實施例是調節轉基因植物中植物碳水化合物濃度的方法，該方法包括表達編碼前述方法之一的高爾基體靶向酶的重組多核苷酸。
[0020]此外，改變植物組織中的交聯和乙醯基含量，以提高植物中可用於生物燃料的生物質的品質的方法，該方法包括如下步驟:用重組表達盒轉化植物細胞，所述重組表達盒包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸，所述多核苷酸與選自SEQ ID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的酶編碼多核苷酸的全長序列具有至少85%的序列同一性；在形成植物的條件下培養植物細胞，以在植物組織中表達多肽酶；在植物組織生長條件下使轉化的植物組織生長；其中所述轉化的植物細胞中高爾基體多糖的組成改變，並且處理轉化的植物組織以獲得生物燃料。
[0021]還設想了製備用於青貯飼料或生物燃料生產的生物質的方法，該方法包括提供具有基本上較低量的乙酸或阿魏酸含量的植物組織，其中植物組織表達靶向高爾基體內隔室的重組酯酶。另一個實施例是所述相同方法，其中多肽與選自SEQ ID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的多肽具有至少85%的序列相似性。
[0022]另外的實施例將是來源於處理轉基因植物組分的方法的產物，所述組分表達編碼高爾基體靶向酶的分離的多核苷酸，所述方法包括如下步驟:使植物生長，所述植物表達可操作地連接至啟動子的與SEQ ID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的全長序列具有至少85%的序列同一性的多核苷酸，以及處理植物組分以獲得產物，所述產物是乙醇的成分。
[0023]另一個實施例是由於重組酯酶靶向高爾基體，包含減少的乙醯基或阿魏醯基含量的植物秸杆，其中酯酶催化乙醯基或阿魏醯基分子的裂解，其包括:玉米秸杆、用於生產包含丁醇和/或乙醇的生物燃料的秸杆。
[0024]另外的實施例將是減少植物組織中乙酸和/或阿魏酸總含量的方法，該方法包括表達抑制乙醯基或阿魏醯基轉移酶的表達的抑制性核苷酸分子。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1:玉米秸杆中的半纖維素多糖(葡萄糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖)結構(Dhugga,2007(Dhugga,2007 年))。
[0026]圖2:擬南芥(Arabidopsis) α -1，2_木糖基轉移酶定向GFP在轉基因植物中的表達。
[0027]圖3 =NaOH濃度和溫育時間對玉米秸杆中乙酸釋放/萃取率的影響。
[0028]圖4:使用用於乙酸定量的96道和8道移液器測定A34tl下的吸光度。
[0029]圖5:在35S啟動子的控制下表達細菌或真菌酯酶的轉基因(T1)擬南芥中的細胞
壁乙酸。
[0030]圖6:通過S2A啟動子表達乙醯酯酶的FastCorn T1事件中的莖杆乙酸含量。
[0031] 圖7:在35S啟動子的控制下表達真菌/細菌阿拉伯糖苷酶的轉基因擬南芥中的木糖/阿拉伯糖比率。
[0032]圖8:在S2A啟動子的控制下表達高爾基體靶向阿魏醯酯酶的Ttl玉米事件中的細胞壁阿魏酸含量。
[0033]圖9:成熟玉米穗軸組織的遺傳多樣性組中細胞壁乙酸含量的變化。
[0034]圖10:玉米穗軸乙酸含量的關聯遺傳學鑑定3號染色體上的強QTL。
[0035]圖11:擬南芥中推定果膠乙醯酯酶的T-DNA突變體中的細胞壁乙酸含量。插圖示出了 T-DNA插入物的圖譜定位。
[0036]圖12:在35S和S2A啟動子的控制下過表達擬南芥果膠乙醯酯酶(AT3G09410)的T0植物中細胞壁乙酸的減少。
[0037]圖13:(13A_13C)來自玉米和擬南芥的相關葡萄糖醛酸基轉移酶基因的比對。相同的殘基以粗 體文本和下劃線表示，類似的殘基以粗斜體(50%同一性)或斜體(75%同一性)標記。
【具體實施方式】
[0038]概論
[0039]A.核酸和蛋白質
[0040]除非另外指明，表1中確定的多核苷酸和多肽序列、其子序列及其功能域表示本發明的多核苷酸和多肽。表1將這些多核苷酸和多肽與其基因名和內部資料庫標識號(SEQID N0.)相互對照。本發明的核酸包含本發明的多核苷酸。本發明的蛋白質包含本發明的多肽。
[0041]表1
【權利要求】
1.一種減少植物中的乙酸、阿拉伯糖苷酶和/或阿魏酸含量的方法，所述方法包括表達裂解乙醯基、阿拉伯糖基或阿魏醯基取代基的酶以及使所述裂解酶靶向所述高爾基體的一個或多個組分或操作所述內源性酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶是乙醯酯酶、阿拉伯糖苷酶或阿魏醯酯酶。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述植物生物質與不表達靶向所述高爾基體的所述酯酶的植物相比基本上不減少。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶向高爾基體的酶是乙醯酯酶。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶向酶是阿魏醯酯酶。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶向高爾基體的酶是阿拉伯糖苷酶。
7.根據權利要求1所述的方法，所述方法包括: a.用包含編碼異源性酯酶的多核苷酸的載體轉化植物細胞； b.使所述酶的所述表達靶向所述高爾基體； c.保持所述水解酶在所述高爾基體中的表達；以及 d.使所述植物在植物生長條件下生長。
8.根據權利要求7所述的方法，其通過所述多核苷酸的過表達改善所述植物生物質的組成。
9.根據權利要求7所述的方法，其提高了乙醇產量。
10.根據權利要求7所述的方法，其中所述轉化植物細胞還包含一種或多種編碼水解酶、酯酶、糖基轉移酶或阿拉伯糖苷酶的異源性多核苷酸。
11.根據權利要求7所述的方法，其中與未轉化植物相比，所述轉化植物細胞壁多糖以較高的速率降解或轉化為葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖或它們的組合。
12.根據權利要求7所述的方法，其中與未轉化植物相比，所述植物細胞壁乙酸濃度減少。
13.根據權利要求7所述的方法，其中與未轉化植物相比，所述植物細胞壁阿魏醯化減少。
14.根據權利要求7所述的方法，其中與未轉化植物相比，所述植物細胞壁阿拉伯糖含量減少。
15.根據權利要求7所述的方法，其中與未轉化植物相比，所述植物細胞壁交聯減少。
16.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物選自:玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、草、草坪草、芒草、柳枝稷和可可。
17.一種在植物中用高爾基體靶向酶調節植物組織生長的方法，所述方法包括表達重組表達盒，所述重組表達盒包含可操作地連接至啟動子的根據權利要求7所述的多核苷酸。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述植物選自:玉米、大豆、高粱、卡諾拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、小米、花生、甘蔗、草、草坪草、芒草、柳枝稷和可可。
19.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物具有改善的青貯飼料品質和可消化性。
20.根據權利要求7所述的方法，其中所述啟動子選自葉特異性啟動子、維管元件偏好啟動子和根特異性啟動子。
21.根據權利要求7所述的方法，包括表達編碼與選自SEQID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的多肽具有至少85%序列相似性的多肽的多核苷酸。
22.根據權利要求7所述的轉基因植物細胞，其具有改變的細胞壁含量，包含重組表達盒包括表達編碼與選自SEQ ID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的多肽具有至少85%的序列相似性的多肽的多核苷酸。
23.根據權利要求7所述的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
24.根據權利要求7所述的轉基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
25.根據權利要求21所述的轉基因植物，其中所述植物選自:玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉油菜、草、甘蔗、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、芒草、草坪草、柳枝稷和小米。
26.—種調節轉基因植物中植物碳水化合物濃度的方法，所述方法包括表達編碼根據權利要求1所述的高爾基體靶向酶的重組多核苷酸。
27.改變植物組織中所述交聯和乙醯基含量，以提高植物中可用於生物燃料的生物質的品質的方法，所述方法包括: a.用重組表達盒轉化植物細胞，所述重組表達盒包含可操作地連接至啟動子的多核苷酸，所述多核苷酸與選自SEQ ID NO:4-18、59、62、65、68、70和71的酶編碼多核苷酸的全長序列具有至少85%的序列同一性， b.在形成植物的條件下培養所述植物細胞，以在所述植物組織中表達所述多肽酶； c.在植物組織生長條件下使所述轉化植物組織生長；其中所述轉化植物細胞中所述高爾基體多糖的組成被改變；以及 d.處理所述轉化植物組織以獲得生物燃料。
28.一種製備用於青貯飼料或生物燃料生產的生物質的方法，所述方法包括提供具有基本上較低量的乙酸或阿魏酸含量的植物組織，其中所述植物組織表達靶向所述高爾基體內隔室的重組酯酶。
29.根據權利要求27所述的方法，其中所述多肽包含與選自SEQID NO:4_18、59、62、65,68,70和71的多肽的至少85%的序列相似性。
30.一種來源於所述處理轉基因植物組分的方法的產物，所述組分表達編碼高爾基體靶向酶的分離的多核苷酸，所述方法包括: a.使植物生長，所述植物表達可操作地連接至啟動子的與SEQID NO:4-18、59、62、65、68,70和71的所述全長序列具有至少85%的序列同一性的多核苷酸；以及 b.對所述植物組分進行加工以獲得產品。
31.根據權利要求29所述的產物，所述產物是乙醇組分。
32.一種由於所述重組酯酶靶向所述高爾基體，包含減少的乙醯基或阿魏醯基含量的植物秸杆，其中所述酯酶催化所述乙醯基或阿魏醯基分子的所述裂解。
33.根據權利要求32所述的植物秸杆是玉米秸杆。
34.根據權利要求32所述的植物秸杆用於製備包含丁醇的生物燃料。
35.根據權利要求32所述的植物秸杆用於製備包含乙醇的生物燃料。
36.一種減少植物組織中所述乙酸和/或阿魏酸總含量的方法，所述方法包括表達抑制所述乙醯基或阿魏醯基轉移酶表達的抑制性核苷酸分子。
【文檔編號】C12N9/18GK103906835SQ201280052590
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年10月24日 優先權日:2011年10月25日
【發明者】K.D.德胡格加, D.多爾德, R.古普塔, A.P.桑德胡, C.R.西蒙斯 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司