大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其抗體和應用的製作方法

2023-07-21 17:09:41 1

專利名稱：大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其抗體和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種單克隆抗體雜交瘤細胞株及其單克隆抗體，特別涉及分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其單克隆抗體,細 胞株保藏編號分別為CGMCC5121、CGMCC5122及CGMCC5123，還涉及各自分泌的單克隆抗體在利用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測大豆脂肪氧化酶同功酶當中的應用，屬於生物檢測技術領域。
背景技術：
大豆中含有三種脂肪氧化酶(Lipoxygenase,簡稱Lox)同功酶即Loxl、Lox2和Lox3,它們能專一催化具有cis, cis-1, 4-戍二烯結構的多元不飽和脂肪酸通過分子加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物，即醛、酮等具有揮發性的異味物質，使大豆具有豆腥味，從而降低了豆製品的耐儲性、食用性和營養價值。通常在大豆加工過程中人們通過加熱、微波照射、改變介質的PH值、有機溶劑萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但這些方法都會不同程度地降低豆製品的營養價值，並且使得成本增高。培育脂肪氧化酶缺失品種可以從根本上解決上述問題。但在脂肪氧化酶缺失材料的選育過程中，Lox在田間不存在指示性狀，從種子外觀和農藝性狀上無法鑑別，並且田間脂肪氧化酶缺失材料選擇工作量大，因此急需一種快速、簡便、成本低、一次可以同時檢測出三種脂肪氧化酶的檢測方法。目前脂肪氧化酶的常用的檢測方法是薄層等電聚焦電泳(IEF)檢測方法，這種方法主要是通過酶染法和蛋白染色方法結合使Lox同功酶帶顯色，雖然能同時檢測出三種脂肪氧化酶，但檢測中常常會因Lox的缺失而發生其它Lox等電點正極漂移現象；另外該方法所需設備、試劑昂貴，操作要求嚴格，一般育種、倉儲單位和加工質檢部門不便操作。另外據日本Suzuki, Y 等 1992 年報導(Prodution and use ofmonolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3, Biosci Biotech.Biochem. 56:678-679):用單克隆抗體可以檢測水稻中的Lox3,這種方法雖然結果準確可靠，但檢測過程中除需要做封閉外，還需要過夜包被酶標板，因此耗時，操作起來不方便。申請號00112539. 7的專利公開了一種作物脂肪氧化酶同功酶的檢測方法，該方法具有操作簡便、結果直觀等特點。但由於它是利用脂肪氧化酶的偶聯氧化還原指示劑顯色反應的原理來進行測定的，所以它的靈敏度和特異性受到一定的限制。

發明內容
本發明的目的在於避免上述方法的缺陷，建立能分別分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的3個雜交瘤細胞株,利用這些細胞株分泌的特異性單克隆抗體來組裝可以用於同時檢測大豆中三種脂肪氧化酶同功酶的雙抗體夾心酶聯免疫吸附(DAS-ELISA)檢測試劑盒 。該試劑盒適用於對大豆中三種脂肪氧化酶的定性和定
量測定。本發明所解決的第一個技術問題是提供了一組抗大豆脂肪氧化酶同功酶的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其特徵在於所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株包括抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5121 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5122 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5123。所述的抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立方法如下①免疫抗原製備分別取單缺Loxl的大豆種子(記為Lox-1)、單缺Lox2的大豆種子五星2號(記為Lox-2)、單缺Lox3的大豆種子(記為Lox_3) (Lox_l、Lox_3可以通過國家種質庫獲得，五星2號(Lox-2)可以從市場上買到)，用鋼銼磨成豆粉，以及Sigma公司產品Soybean Lox typel_B (同時含有3種大豆脂肪氧化酶,幾乎不含其它大豆蛋白),分別與8 15倍體積的的pH為8. 0的Tris — CaCl2緩衝液混勻，浸提0. 5-1小時，4°C 12000rpm離心IOmin,,取上清備用，分別為Lox-1上清液、Lox_2上清液、Lox_3上清液、Soybean Loxtype1-B上清液；②小鼠免疫選擇4 6周齡的行動敏捷的純系BALB/C雌小鼠，分別稱量各小鼠體重並標記；取步驟①中製備的Lox-1、Lox-2、Lox-3上清液，用生理鹽水將其稀釋到蛋白含量4mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑混合後，採取皮下多點注射首次免疫小鼠，各上清液分別免疫5隻小鼠並做標記,每隻小鼠的免疫劑量為0. 4 0. 6mg ；③注射環磷醯胺溶液(CY):將步驟②中首次免疫的小鼠分別於免疫10min、24h、48h後，按照90mg/kg的量分別對小鼠進行頸背部多點注射濃度20mg/ml的環磷醯胺溶液(CY)進行消減；④效價測定及再次免疫首次免疫I周后用步驟①中製備的Soybean Loxtypel-B上清液作抗原對步驟③中的小鼠按照步驟②方法再次進行免疫，第二次免疫一周後進行第三次免疫，第三次免疫後第四天從小鼠尾部分別取血2-3滴，離心取上清，用間接酶聯免疫吸附法測定其效價(效價測定利用Soybean Lox typel_B包被),如果效價小於
1:1600,1周後對各小鼠用Soybean Lox typel-B按照步驟②方法再次進行免疫,並進行效價測定，直至血清效價達到或高於1:1600為止；⑤加強免疫3種免疫小鼠中，每種均選擇血清效價最高的小鼠在細胞融合前3天按步驟④加強免疫I次；⑥細胞融合分別取步驟⑤中的不同小鼠的脾細胞與復甦的SP2/0細胞混勻，在細胞培養板HAT培養基上分別篩選陽性雜交瘤細胞；⑦特異性陽性細胞株篩選細胞融合7 15天後，採用間接酶聯免疫吸附法，利用Soybean Lox typel_B作為檢測抗原進行陽性篩選，同時利用單缺Loxl的大豆種子(Lox-1)的豆粉上清液作為檢測抗原進行交叉檢測，上清液的0D450值與空白對照孔的0D450值之比大於2.1的即判斷為陽性孔，並且與Lox-1反應表現為陰性的孔，其中的雜交瘤細胞稱為陽性細胞株，該細胞株分泌的單克隆抗體為特異性抗Loxl的。用同樣的方法，均利用Soybean Lox typel_B作為檢測抗原進行陽性篩選,利用五星2號豆粉上清液對分泌抗Lox2的單克隆抗體進行交叉檢測,利用Lox-3豆粉上清液對分泌抗Lox3的單克隆抗體進行交叉檢測；⑧亞克隆採用有限稀釋法對步驟⑦中篩選到的3種陽性細胞株分別進行亞克隆，連續兩次亞克隆之後剔除掉假陽性細胞株，在檢測過程中均按照⑦中的方法同時進行 陽性和交叉檢測，最終可以獲得分別分泌抗Loxl、Lox2、Lox3的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明所解決的第二個技術問題是提供由權利要求1所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，其特徵在於所述的單克隆抗體包括由抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的特異性抗Loxl的單克隆抗體 '及由抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的特異性抗Lox2的單克隆抗體 '及由抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的特異性抗Lox3的單克隆抗體。上述的單克隆抗體是通過以下方法得到的將上述步驟⑧中得到的分泌Loxl、Lox2、Lox3單克隆抗體細胞株分別以(I 2) X IO6個細胞/只的量接種到經過石蠟油預處理過的不同BALB/C小鼠腹腔，誘導腹水產生抗體，經過6 8天後即可採集腹水或血清，分別得到Loxl、Lox2、Lox3單克隆抗體。本發明所解決的第三個技術問題是提供所述的單克隆抗體在檢測大豆脂肪氧化酶同功酶中的應用。本發明所解決的第四個技術問題是提供所述的單克隆抗體在製備檢測大豆脂肪氧化酶同功酶試劑盒中的應用。本發明所解決的第五個技術問題是提供一種檢測大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特徵在於包含以下步驟A、將本發明的分別抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株所分泌的各單克隆抗體分離純化；B、採用辣根酶標記步驟A純化後的單克隆抗體，分別獲得辣根酶標記的抗大豆LoxU Lox2和Lox3的單克隆抗體，作為檢測抗體，酶標後分別命名為L_1，L_2，L-3 ；C、利用大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的多克隆抗體作為固相抗體包被酶標板，B中得到的L-l，L-2，L-3作為檢測抗體，利用抗原抗體的結合反應，通過顯色與否及深淺來檢測大豆種子當中Loxl、Lox2、Lox3這3種脂肪氧化酶的缺失類型和含量。所述的步驟A中所得到的各單克隆抗體採用辛酸-硫酸銨法進行分離純化，步驟如下
①用0. 06M醋酸緩衝液將所採集的腹水或血清稀釋3-4倍，用NaOH調pH為4. 5，並記下液體體積；②在振蕩下滴加辛酸(每毫升稀釋的腹水或血清中加25ul辛酸)，室溫下攪拌30min,4°C, IOOOOrpm離心30min,棄沉澱，留上清；(加辛酸必須一滴一滴加)③過濾上清液，加入0.1M pH7. 4的PBS (每10份上清液加I份PBS)，用NaOH調pH 為 7.4，4°C放置 30min ；④研磨硫酸銨，每毫升混合液加0. 28g硫酸銨,攪拌30min, IOOOOrpm離心20min ；⑤取沉澱溶於原腹水或血清1/10體積的0. OlM PBS中，用50倍體積的0. OlMPBS緩衝液透析過夜，換液2-3次；⑥將液體從透析袋取出，4°C, IOOOOrpm離心20min,去沉澱，即為純化的單克隆抗體，濃縮後_20°C保存備用。 所述的步驟B中將抗大豆Loxl、Lox2和Lox3的單克隆抗體進行酶標製備檢測抗體的步驟如下①稱取2mg的HRP酶，溶於三蒸水中，加入新近配製的過碘酸鈉溶液，混勻後置40C，30min,加入乙醇溶液,室溫，30min,加入Img純化抗體,混勻,調pH值至9. 0,4°C過夜；②加入硼氫化鈉，混勻，置4°C 2h ;③將酶標抗體混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4°C 30min後離心，用pH7. 4磷酸鹽緩衝液透析過夜，即可。所述步驟C中大豆脂肪氧化酶多克隆抗體製備的步驟如下①免疫動物選擇與初次免疫選擇重量在2 3kg之間的純種紐西蘭大白兔，將Soybean Lox typel_B蛋白稀釋成8mg/ml作為抗原，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化後，採取背部皮下多點注射免疫兔子，每隻兔子免疫劑量為1. 6mg ；②再次免疫間隔10 14天後利用不完全付氏佐劑和濃度為8mg/ml的SoybeanLox typel-B蛋白等體積混合後按照步驟①進行再次免疫，如此進行第三次免疫；③效價測定第三次免疫後第11天從上述步驟②中免疫的大白兔耳緣靜脈取血檢測其效價，如果效價小於1:10000時，則對步驟②中大白兔再次按照步驟②免疫，如此反覆免疫直至所測效價高於1:10000為止；④多克隆抗體的製備3天後對步驟③效價最高的大白兔採用頸動脈放血法採血，分離血清，採用間接酶聯免疫吸附法測定分離血清與Loxl、Lox2、Lox3及大豆中其它蛋白的交叉，證明該血清與Loxl、Lox2、Lox3均有交叉而與大豆中其它蛋白無交叉後即得到多克隆抗體血清。所述步驟C中檢測大豆種子當中Lox-l、Lox-2、Lox_3這3種脂肪氧化酶的缺失類型和含量包括如下操作步驟①待測大豆中Lox提取液的製備將待測大豆的種子磨成豆粉，加入8 15倍體積的pH為8. 0的Tris - CaCl2緩衝液，混勻後離心取上清備用；②洗板用Tween20 — NaCl緩衝液將多克隆抗體包被的酶標板反覆洗3 4次，每次2 3min，拍幹，目的洗去未結合到板子上的多克隆抗體；③-1加樣將步驟①中製備的Lox提取液加到步驟②備好的酶標板中，同時做陽性和陰性對照，25°C 37°C放置30 90min後按照步驟②洗板；
③-2加樣將sigma公司Soybean Lox typel-B產品稀釋成80萬活力單位/ml的標準液，用了￥661120 —恥(1緩衝液按10、30、90、270、810、2430、7290、21870、65610、196830、590490,0共12個稀釋濃度進行倍比稀釋，同時將步驟①中製備的Lox提取液稀釋成10、50,100,200共4幾個濃度梯度，然後將不同稀釋濃度的標準液和Lox提取液按每個濃度100 μ L/孔分別加到步驟②備好的酶標板中，均設3次重複，37°C放置45min-60min後按照步驟②洗板；④-1加入大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_1、L_2、L-3):將大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_l、L_2、L-3)分別加入到步驟③-1已加入待測樣品的酶標板孔內，25°C 37°C放置30-90min後按照步驟②洗板；④-2加入大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_1、L_2、L-3):將大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3單克隆抗體試劑(L_l、L_2、L-3)分別 加入到步驟③-2已加入待測樣品的酶標板孔內，25°C 37°C放置30-90min後按照步驟②洗板；⑤顯色及終止將含有20%的3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺的無水乙醇底物液和pH為5. O磷酸鹽檸檬酸緩衝液底物液等體積混合，加入到所有孔中，避光放置15 20min，顯色的樣品中含有與所加單克隆抗體相對應的Lox，不顯色的樣品中則不含有與所加單克隆抗體相對應的Lox ;加入底物液體積1/2的2M H2SO4終止液終止顯色；⑥酶標儀讀數設置參數450nm，外部振搖3秒；⑦標準曲線的繪製按步驟③-2中標準液的稀釋度的log值為橫坐標，以步驟⑦中得到的OD值為縱坐標，繪製「S」形標準曲線；⑧利用「S」形標準曲線中間呈線性關係的一段，利用該線段的回歸方程以及待測樣品系列稀釋度的OD值計算出Lox的活力單位數。本發明所解決的第六個技術問題是根據上述的檢測方法提供一種檢測大豆脂肪氧化酶同功酶的試劑盒，該試劑盒包括盒體、設在盒體內的酶標板和存放在盒體內的試劑，其特徵在於盒內存放的瓶裝檢測試劑由以下試劑組成pH為8. O的Tris - CaCl2緩衝液；陽性對照試劑；陰性對照試劑；Tween20 - NaCl溶液緩衝液；由抗大豆脂肪氧化酶Loxl、LOX2、LOX3的單克隆抗體雜交瘤細胞株所分泌的各單克隆抗體分別經辣根酶標記後得到的抗大豆脂肪氧化酶同功酶L0X1、L0X2和Lox3單克隆抗體試劑；含有20%的3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺的無水乙醇底物液；pH為5. O磷酸鹽檸檬酸緩衝液底物液；2M H2SO4終止液；用雙蒸水將sigma公司Soybean Lox typel_B產品稀釋成80萬活力單位/ml得到的標準液；其中，所述的陽性對照為從普通大豆種子中提取的總蛋白。其中，所述的陰性對照為從脂肪氧化酶全缺失大豆中提取的總蛋白。相較於現有技術，本發明的優點在於1、利用Sigma公司的Soybean Lox typel-B產品作為免疫抗原誘發哺乳動物產生多克隆抗體，後將多抗隆抗體結合到酶標板上；同時在不純化大豆Lox蛋白的前提下，利用大豆脂肪氧化酶近等基因系century材料通過消減免疫法首先使用環磷醯胺將大豆中其它蛋白在實驗小鼠體內的免疫反應屏蔽掉，再用含有目的大豆Lox蛋白的混合樣品免疫實驗小鼠，誘發小鼠體內產生對Loxl、Lox2和Lox3專一的抗體,製備特異雜交瘤細胞,避開了蛋白純化這一難題；2、通過篩選陽性細胞株與交叉檢測同時進行，極大程度上降低了篩選到分別抗大豆Loxl、Lox2和Lox3的強特異性單克隆抗體的工作量；3、檢測時多克隆抗體已被結合到酶標板上，檢測過程中不需做封閉和過夜包被酶標板，因此省時，操作方便；4、利用抗原抗體的結合反應，通過顯色檢測酶的存在和酶的含量，檢測時形成「多抗+樣品+單抗」雙抗體夾心，準確可靠、特異性強； 5、樣品處理簡單，一次可以同時檢測出三種脂肪氧化酶，並且一次可以同時檢測多個樣品，適用於育種單位、倉儲單位和加工質檢部門，最適用於育種中大量品種(系)的篩選。


圖1為30個近等基因系高代材料檢測結果圖；圖2為「S」形標準曲線。涉及的菌種保藏抗大豆脂肪氧化酶Loxl的單克隆抗體雜交瘤細胞株(Loxl-E1),為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生的雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC5121，保藏日期為2011年7月26日；抗大豆脂肪氧化酶Lox2的單克隆抗體雜交瘤細胞株(LoX2-G5)，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生的雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC5122，保藏日期為2011年7月26日；抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株(LoX3-H8)，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生的雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC5123，保藏日期為2011年7月26日。
具體實施例方式下面通過實驗並結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的保護範圍。實施例1:抗大豆脂肪氧化酶同功酶的單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立1.1實驗材料大豆脂肪氧化酶全缺失材料「中特I號」購自中國農業科學院作物科學研究所；美國Century近等基因系材料國家資源庫保存號分別為Lox_l =WDDO 1483,Lox-3 :WDDO1485 ；缺Lox-2酶大豆品種「五星2號」，審定號國審豆2004005 ；BALB/C小鼠和小鼠SP2/0細胞購自軍事醫學科學院實驗動物中心(北京)；紐西蘭大白兔購自河北省實驗動物中心；
96孔聚苯乙烯酶標板購自廈門市雲鵬科技發展有限公司。1. 2化學試劑HAT培養基、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Soybean Lox typel-B均為Sigma公司產品；辣根酶(HRP)購買自北京華美轉導科技有限公司；其它所用化學試劑均購自北京鼎國生物技術有限責任公司。
1. 3試驗方法①免疫抗原製備取單缺Loxl的大豆種子、單缺Lox2五星2號大豆種子、單缺Lox-3的大豆種子(可以通過國家種質庫獲得)，用鋼銼磨成豆粉(分別磨10g)，Sigma公司產品Soybean Lox typel-B10g (同時含有3種大豆脂肪氧化酶,不含其它大豆蛋白),上述材料用8 15倍體積的pH為8. O的Tris — CaCl2緩衝液混勻，浸提I小時，4°C 12000rpm離心IOmin,取上清備用；②小鼠免疫選擇4 6周齡的行動敏捷的純系BALB/C雌小鼠15隻，分成3組(命名為a、b、c組)，每組5隻，分別編號為1、2、3、4、5號，分別稱量各小鼠體重並標記(如表I);取步驟①中製備的單缺Loxl的大豆種子、單缺Lox2五星2號大豆種子、單缺Lox-3的大豆種子的上清液分別用生理鹽水將其稀釋到蛋白含量4mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑混合後，分別採取皮下多點注射首次免疫小鼠，每隻小鼠的免疫劑量為O. 6mg，注射單缺Loxl的大豆種子(Lox-1)上清液的為a組，注射單缺Lox2的大豆種子(Lox-2)上清液的為b組，注射單缺Lox3的大豆種子(Lox-3)上清液的為c組；表1:各組小鼠體重統計表
權利要求
1.抗大豆脂肪氧化酶LOX3的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其特徵在於所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC5123。
2.由權利要求1所述的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在檢測大豆脂肪氧化酶Lox3中的應用。
4.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測大豆脂肪氧化酶Lox3試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了抗大豆脂肪氧化酶Lox3的單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏編號為CGMCC5123，本發明還公開了由該雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體及其在檢測大豆脂肪氧化酶Lox3中的應用。
文檔編號G01N33/577GK102994454SQ20121055490
公開日2013年3月27日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者張孟臣, 馬志民, 秦君, 閆龍, 李亞璞, 蔣春志, 邸銳, 唐曉東 申請人:河北省農林科學院糧油作物研究所