普通菸草類異黃酮還原酶基因及其應用的製作方法

2024-03-25 17:54:05

專利名稱：普通菸草類異黃酮還原酶基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，涉及一種菸草基因，還涉及該基因的應用。
背景技術：
菸草是雙子葉植物綱管花目茄科菸草屬植物。菸草屬(Nicotiana)有60多個種，2個栽培種中普通菸草(又稱紅花菸草，Nicotiana tabacum)佔據主要面積，黃花菸草(Nicotiana rustica)的面積很小。栽培菸草按菸葉品質特點、生物學性狀和栽培調製方法等可分為烤菸、曬煙、晾煙、白肋煙、香料煙和黃花煙六個類型，其中烤菸是栽培最廣的普通菸草。我國烤菸種植面積和總產量均居世界第一位。作為一種葉用經濟作物，烤菸的栽培技術有別於其它大田作物，不僅要求有一定的菸葉產量，而且更注重菸葉品質。菸葉品質決定菸葉的可用性，直接影響捲菸商品的色、香、味和商品價值，也關係到菸農的經濟效益，是菸草行業的生命和出發點。為使在未來的國內外市場競爭中立於不敗之地，滿足國內外捲菸企業對優質菸葉不斷增長的需求，必須提高菸葉品質和安全性。菸鹼(又稱尼古丁，nicotine)是影響菸葉品質和安全性的最主要因素之一。適量的菸鹼將給吸食者以適當的生理強度和好的香氣與吃味，導致中樞神經適度的興奮和鬆弛，使人精神振奮、心情舒暢、情緒穩定；過量的菸鹼則刺激性過強，有害身體健康。此外,菸鹼含量還要與菸草中其它化學成分含量保持比例協調，才能產生好的綜合質量，例如水溶性糖與菸鹼的比例常用來評價菸草的勁頭和舒適程度。因此，適宜的菸鹼含量是優質低害菸葉生產所追求的目標，也是擺在菸草科技工作者面前的一項緊迫任務。目前公認的優質低害烤菸菸葉化學成分為總糖18% -22%，還原糖16% -18%,還原糖/總糖比彡O. 9，總氮1.5% -3.5%，蛋白質7% -9%，菸鹼1.5% -3. 5%，還原糖/菸鹼比8-12，氮鹼比為I或略小於1，鉀彡2%，氯彡1%，鉀/氯比>4。我國烤菸菸葉的外觀質量目前己經基本達到或接近國際優質菸葉標準，但菸葉化學成分的協調性不夠，尤其是中上部菸葉，突出表現為菸鹼含量偏高，衡量菸葉化學成分協調性的主要指標(還原糖/菸鹼比、氮鹼比)不符合優質菸葉的標準。因此，降低中上部菸葉的菸鹼含量，改善菸葉化學成分的協調性，以增加菸葉的工業可用性，提高菸葉的安全性，是菸草品質改良的重點。在常規技術措施降鹼作用有限的條件下，用基因工程的手段將編碼菸鹼合成的限速酶或具有調解功能的酶的基因導入菸草中，培育低菸鹼優質菸草品種，是一條很有前景的新途徑。目前知道腐胺-N-甲基轉移酶(PMT)和喹啉酸磷酸核糖轉移酶(QPT)是菸鹼2個中間體生物合成中的最大限速酶，其他底物或酶在某些情況下具有調節作用，但對其調控機制缺乏深入了解。菸鹼的合成是由煙酸與吡咯環結合而完成的，這個過程由菸鹼合成酶所催化，目前尚未能對此酶進行分離和定性，因此關於菸鹼最終合成的機理以及調節機制尚不清楚。此外，菸草目前多作為模式作物而不是目的植物用於基因工程研究，雖然抗性植物基因工程的研究成果可以直接應用於菸草的抗性育種，但品質改良基因工程的研究成果大多對菸草品質育種意義不大，這是因為，一方面對菸草自身生理代謝的分子機制缺乏深入的研究，另一方面菸草不同於常規農作物，其品質優劣主要取決於菸草內菸鹼、糖、酸、醇、脂、色素、無機物等物質的綜合作用。因此，有必要進行菸草菸鹼生物合成相關基因的克隆並轉化菸草進行功能驗證，對菸草菸鹼生物合成的分子機制進行深入的研究，為菸草品質的基因工程改良提供新的策略，推進低菸鹼優質菸草的分子育種。另外，經全國菸草侵染性病害調查，菸草真菌性病害在中國已發現28種，約佔全球已知菸草侵染性病害的47.5%，所造成的經濟損失佔菸草侵染性病害所致總損失的37. 8%，居各類病害之首。而且近年來菸草真菌性病害有加重趨勢，嚴重影響菸草產質量和種煙收益。在當前烤菸生產上，病蟲害的防治仍在很大程度上依賴於化學藥劑，農藥施用量過大、施用次數偏多，且多以高毒農藥為主(特別是殺蟲劑)，濫用農藥現象嚴重，這給烤菸生產帶來了不小的副作用，主要表現在以下幾個方面增加生產成本；使病原菌發生生理小種變化或害蟲產生抗藥性，造成病害的大發生；破壞生態平衡，殺死天敵，降低天敵的自然控制作用；增加農藥殘留，降低菸葉安全性。因此，挖掘與菸草抗真菌病害有關的功能防衛基因，通過遺傳工程修飾進行菸草抗病性改良，增強菸草對真菌性病害的防衛能力，以降低農藥施用量，提高菸葉的安全性，對於菸草行業的可持續健康發展具有重要的理論和現實意義。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於對普通菸草類異黃酮還原酶(NtIRL)基因家族進行克隆並轉化菸草進行功能分析，為優質菸草的基因工程育種提供新的策略和工具。為達到上述目的，本發明採用RACE技術，以普通菸草高菸鹼品種龍裡紅花煙的根總RNA為材料，克隆了 NtIRL基因家族的全長cDNA和基因組序列，對其進行了系統的生物信息學分析，揭示了普通菸草中NtIRL基因家族的成員數，闡明了這些成員在普通菸草各個組織器官中的表達特徵，構建了正義和反義植物表達載體，並通過遺傳轉化完成了功能分析。研究結果顯示，普通菸草類NtIRL基因家族有NtIRLl和NtIRL2共2個成員，NtIRLl和NtIRL2的基因組序列分別為1946bp和2089bp，全長cDNA序列分別為1257bp和1261bp，在cDNA的79-101 Ibp處均有一個933bp的開放閱讀框(ORF)，均編碼由310個胺基酸組成的蛋白質。NtIRLl和NtIRL2的基因組序列、mRNA序列、編碼區序列的一致性分別為84. 9%,95.1 %、96. 9%，編碼區一致性遠遠高於非編碼區，證明了編碼區的保守性；編碼蛋白序列的一致性和相似性分別為95. 5%和97. 4%，說明在胺基酸水平上也存在高度保守性。NCBI Blastn同源分析表明，NtIRLl的mRNA對應於已報導的NtA622mRNA (Genbank登錄號D28505)，基因組序列對應於已報導的NsA622基因(Genbank登錄號AB071165)，NtIRL2則為本發明新克隆。它們與來自大豆等植物的異黃酮還原酶(IFR)基因具有顯著的同源性，與其它植物的苯基香豆滿苄基醚還原酶(PCBER)基因有著一定的的同源性，與其它類型的還原酶也存在核心區段的同源性。儘管NtIRLl和NtIRL2的同源性很高，但二者在表達的時空特性上發生了明顯的分化。NtIRLl在根中表達量最高，莖中有適當表達，蕾中有弱表達，在葉、花、蒴果和開花後20天的種子等器官中完全不表達；NtIRL2具有更強的組織特異性，在根中表達最強，在莖中有極弱的表達，在蕾、葉、花、蒴果和開花後20天的種子等器官中均不表達；NtIRL2在根中的轉錄水平明顯高於NtIRLl。本發明採用SacI/BamHI雙酶切定向克隆方式，分別將NtIRLl和NtIRL2基因組序列正向插入到植物表達載體pCambia2301G中，由CaMV35S啟動子驅動，構建了 2個正義植物表達載體pNtIRLl和pNtIRL2 ;將NtIRLl和NtIRL2全長cDNA中的共保守片段NtIRLA反向插入到植物表達載體pCambia2301G中，由CaMV35S啟動子驅動，構建了 I個NtIRL基因家族成員共抑制的反義植物表達載體pNtlRLA。將上述正義和反義植物表達載體分別轉化農桿菌，獲得了攜帶相應植物表達載體的農桿菌工程菌株，進一步利用農桿菌介導的葉盤法轉化普通菸草。結果顯示，超量表達和抑制表達NtIRL基因的轉基因菸草均未出現明顯的外型變化，具有正常的植株形態和生長特徵，菸葉顏色與未轉基因煙株相比也無明顯差別，但是，超量表達NtIRLl或NtIRL2的轉基因株系的菸葉菸鹼含量絕大多數較未轉基因煙株有不同程度的提高，抑制表達NtIRL基因的轉基因株系的菸葉菸鹼含量均較未轉基因煙株有不同程度的下降，而且轉基因菸草葉片菸鹼含量變化情況與NtIRL基因在根系中的表達豐度成正相關，說明NtIRLl和NtIRL2基因都能夠編碼有活性的菸鹼合成相關酶，在菸草菸鹼的生物合成代謝途徑中有著重要作用。此外，轉NtIRL基因植株通過菸鹼積累的改變還影響了其抗病表現，超量表達NtIRLl或NtIRL2基因，菸鹼含量增高，煙株抗黑脛病能力增強；抑制NtIRL基因的表達，菸鹼含量降低，煙株抗立枯病能力減弱；說明菸草次生代謝物中的菸鹼也是具有防禦功能的植保素類物質，可以增強煙株抵抗真菌病害的能力。根據上述研究結果，本發明提出如下技術方案1.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的開放閱讀框序列，如SEQ ID No. 10中第79-1011位核苷酸所示。2.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的全長cDNA序列，如SEQ ID No. 10所
/Jn ο3.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的基因組序列，如SEQ ID No. 12所示。4.含有NtIRL2基因開放閱讀框序列或基因組序列的正義植物表達載體。進一步，所述正義植物表達載體是將SEQ ID No. 12所示的NtIRL2基因組序列正向插入載體pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位點之間，替換其中的gus基因而得；所述載體pCambia2301G是用HindIII和EcoRI雙酶切從pBI 121質粒上切下gus基因表達盒，再將其連接到經同樣雙酶切的pCambia2301載體上而得。5.含有NtIRL基因家族成員共保守片段的反義植物表達載體，所述NtIRL基因家族成員為NtIRLl和NtIRL2 ;所述NtIRLl基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 9所示；所述NtIRL2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示。進一步，所述反義植物表達載體是將NtIRL基因家族成員共保守片段NtIRLA反向插入載體pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位點之間，替換其中的gus基因而得；所述NtIRL基因家族成員共保守片段NtIRLA的核苷酸序列如SEQ ID No. 9中第1-1179位核苷酸所示；所述載體pCambia2301G是用HindIII和EcoRI雙酶切從pBI121質粒上切下gus基因表達盒，再將其連接到經同樣雙酶切的pCambia2301載體上而得。6.含有上述正義植物表達載體的微生物轉化體。7.含有上述反義植物表達載體的微生物轉化體。8.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2在普通菸草菸鹼含量和抗真菌病害方面的分子育種中的應用。進一步，所述真菌病害為黑脛病和立枯病。
9.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRLl在普通菸草菸鹼含量和抗真菌病害方面的分子育種中的應用，所述NtIRLl基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 9所示，基因組序列如 SEQ ID No. 11 所示。進一步，所述真菌病害為黑脛病和立枯病。本發明的有益效果在於本發明對NtIRL基因家族進行了克隆，明確了 NtIRL基因家族的成員，發現了新基因Nt IRL2，對Nt IRL基因家族成員Nt IRLI和Nt IRL2進行了系統的生物信息學分析，闡明了這些成員在普通菸草各個組織器官中的表達特徵，並構建正義和反義植物表達載體，通過遺傳轉化菸草證實了 NtIRL基因家族成員NtIRLl和NtIRL2都編碼有活性的菸鹼合成相關酶，在菸草菸鹼的生物合成代謝途徑中有著重要作用，並參與植株的抗真菌病害防禦，從而為普通菸草菸鹼含量和抗真菌病害方面的遺傳工程修飾和分子育種提供了重要的靶基因，通過轉基因手段進行NtIRL基因的分子調控有助於菸草菸鹼修 飾和抗病性改良。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中圖1為龍裡紅花煙的基因組DNA，其中I泳道為DNAMarker，2、3泳道為基因組DNA。圖2為龍裡紅花煙的各器官總RNA，其中I泳道為DNA Marker, 2-8泳道依次為根、莖、葉、花、蕾、蒴果和開花後20天種子的總RNA。圖3為龍裡紅花煙的總cDNA，其中I泳道為DNAMarker，2泳道為獲得的總cDNA。圖4為NtIRL基因家族的3丨cDNA末端擴增，其中I泳道為DNA Marker, 2、3泳道分別為3' cDNA末端的巢擴產物。圖5為NtIRL基因家族3' cDNA末端單克隆的PCR檢測，其中M泳道為DNAMarker，1-23泳道分別為3' cDNA末端單克隆。圖6為NtIRL基因家族的5丨cDNA末端擴增，其中I泳道為DNA Marker, 2、3泳道分別為5' cDNA末端的一擴產物。圖7為NtIRL基因家族V cDNA末端單克隆的PCR檢測，其中I泳道為DNAMarker, 2-7泳道分別為5 ^ cDNA末端單克隆。圖8為NtIRL基因家族的全長cDNA擴增，其中I泳道為DNAMarker，2、3泳道分別為PCR擴增產物。圖9為NtIRL基因家族的全長基因組序列擴增，其中I泳道為DNA Marker, 2、3泳道分別為基因組序列PCR擴增產物。圖10為NtIRLl基因的核苷酸序列及其推導的胺基酸序列，其中起始密碼子ATG和終止密碼子TAG用粗體加下劃線標記，內含子用灰色背景標記，可變轉錄起始位點和可變加尾位點用斜粗體加下劃線標記，推測的加尾信號用波浪線標記，NADPH結合保守域GGTGYIG用邊框標記，底物結合通用保守胺基酸殘基K135用邊框加灰色背景標記，預測的NmrA保守域19 T239用下劃線標記。圖11為NtIRL2基因的核苷酸序列及其推導的胺基酸序列，其中起始密碼子ATG和終止密碼子TAG用粗體加下劃線標記，內含子用灰色背景標記，可變轉錄起始位點和可變加尾位點用斜粗體加下劃線標記，推測的加尾信號用波浪線標記，NADPH結合保守域GGTGYIG用邊框標記，底物結合通用保守胺基酸殘基K135用邊框加灰色背景標記，預測的NmrA保守域19 T239用下劃線標記。圖12為NtIRL家族蛋白與其它植物PIP蛋白的序列多重比對，其中與NADPH結合的「GxxGxxG」保守結合域用方框標記，部分植物IFR蛋白和PLR蛋白的特異插入位點用下波浪線標記，一致性序列中推斷與輔因子結合的胺基酸殘基用陰影加方框標記，推斷與底物結合的胺基酸殘基用粗體加下劃線標記。圖13為NtIRL家族蛋白與其它植物PIP蛋白的系統發育樹。圖14為NtIRLl和NtIRL2蛋白的二級結構，其中長、中長、短和最短豎線分別代表α螺旋、延伸鏈、β轉角和隨機捲曲。圖15為NtIRLl和NtIRL2蛋白的三級結構。圖16為NtIRL基因家族成員數的鑑定，其中圖A為探針標記結果，圖B為酶切結果，圖C為Southern blot雜交結果。圖17為NtIRLl和NtIRL2基因在普通菸草各器官中表達的RT-PCR檢測，其中Ro為根，St為莖，Le為葉，Fl為花，Bu為蕾，Ca為蒴果,20D為開花後20天的種子。圖18為NtIRLl基因家族成員正義植物表達載體pNtIRLl和pNtIRL2的T-DNA元件圖。圖19為NtIRLl基因家族成員正義植物表達載體pNtIRLl和pNtIRL2的BamHI/SacI雙酶切鑑定。圖20為NtIRLl基因家族成員反義植物表達載體pNtlRLA的T-DNA元件圖。圖21為NtIRLl基因家族成員反義植物表達載體pNtlRLA的PCR鑑定。圖22為NtIRLl基因家族成員反義植物表達載體pNtlRLA的SacI/BamHI雙酶切鑑定。圖23為NtIRLl基因家族成員正義和反義植物表達載體轉化農桿菌後的菌液PCR檢測。圖24為採用農桿菌介導的葉盤法將NtIRL基因家族成員轉化普通菸草，其中A為抗性芽的生長，B為抗性芽生根培養，C為水培煉苗，D為移栽轉基因苗。 圖25為轉基因菸草植株的⑶S活性組織化學染色檢測，其中A為紅花大金元超量表達NtIRLl基因抗Kan單株根系⑶S染色，CK為未轉化的菸草，其餘為紅花大金元轉基因植株；B為紅花大金元超量表達NtIRL2基因抗Kan單株根系⑶S染色，CK為未轉化的菸草，其餘為紅花大金元轉基因植株；C為大伏煙反義抑制抗Kan單株根系GUS染色，CK為未轉化的菸草，其餘為大伏煙轉基因植株；D為龍裡紅花煙反義抑制抗Kan單株根系GUS染色，CK為未轉化的菸草，其餘為龍裡紅花煙轉基因植株。圖26為紅花大金元超量表達NtIRLl基因抗Kan苗的PCR檢測，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK+為陽性對照(農桿菌工程菌株LBA4404-pNtIRLl菌液)，CK—為陰性對照煙株，I 15為隨機挑選的紅花大金元轉基因植株。圖27為紅花大金元超量表達NtIRL2基因抗Kan苗的PCR檢測，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK+為陽性對照(農桿菌工程菌株LBA4404-pNtIRL2菌液)，CK—為陰性對照煙株，I 18為隨機挑選的紅花大金元轉基因植株。
圖28為大伏煙反義抑制抗Kan苗的PCR檢測，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK+為陽性對照(農桿菌工程菌株LBA4404-pNtIRLA菌液)，CK_為陰性對照煙株，I 22為隨機挑選的大伏煙轉基因植株。圖29為龍裡紅花煙反義抑制抗Kan苗的PCR檢測，其中M為DNA標準分子量DL2000, CK+為陽性對照(農桿菌工程菌株LBA4404-pNtIRLA菌液)，CK_為陰性對照煙株，I 22為隨機挑選的龍裡紅花煙轉基因植株。圖30為紅花大金元轉NtIRLl基因植株中NtIRLl表達 的RT-PCR分析，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK為陰性對照煙株，8和22為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株，29為⑶S染色陰性但PCR檢測陽性的轉基因煙株，2、3、7、11、18、50、51、59、61和62為GUS染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖31為紅花大金元轉NtIRL2基因植株中NtIRL2表達的RT-PCR分析，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK為陰性對照煙株，40和76為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株，75為⑶S染色陰性但PCR檢測陽性的轉基因煙株，28、34、42、44、49、51、60、62、70和79為GUS染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖32為大伏煙反義抑制轉基因植株中NtIRLl基因表達的RT-PCR分析，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK為陰性對照煙株，20和37為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株，86和93為⑶S染色陰性但PCR檢測陽性的轉基因煙株，1、8、13、40、70、74、78和80為GUS染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖33為大伏煙反義抑制轉基因植株中NtIRL2基因表達的RT-PCR分析，其中M為DNA標準分子量DL2000，CK為陰性對照煙株，20和37為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株，86和93為⑶S染色陰性但PCR檢測陽性的轉基因煙株，1、8、13、40、70、74、78和80為GUS染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖34為紅花大金元轉NtIRLl基因植株的Southern blot檢測，其中CK為陰性對照煙株，8為GUS染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株，2、3、11、12、18、24、47、56和62為GUS染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖35為大伏煙反義抑制轉基因植株的Southern Blot檢測，其中CK為陰性對照煙株，37為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株，1、6、7、8、13、19、21、30和40為⑶S染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖36為紅花大金元轉NtIRLl基因植株菸葉菸鹼含量變化分析，其中CK為陰性對照，8為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株；2 62 (除8)為⑶S染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖37為紅花大金元轉NtIRL2基因植株菸葉菸鹼含量變化分析，其中CK為陰性對照，40為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株；I 82 (除40)為⑶S染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖38為大伏煙反義抑制轉基因植株菸葉菸鹼含量變化分析，其中CK為陰性對照，37為⑶S染色和PCR檢測雙陰性的轉基因煙株；1 95 (除37)為⑶S染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。圖39為龍裡紅花煙反義抑制轉基因植株菸葉菸鹼含量變化分析，其中CK為陰性對照，I 30為⑶S染色和PCR檢測雙陽性的轉基因煙株。
圖40為紅花大金元超量表達NtIRLl基因植株(左)與未轉基因植株(右)的表型比較。圖41為紅花大金元超量表達NtIRL2基因植株(左)與未轉基因植株(右)的表型比較。圖42為大伏煙反義抑制轉基因植株(左)與未轉基因植株(右)的表型比較。圖43為龍裡紅花煙反義抑制轉基因植株(右)與未轉基因植株(左)的表型比較。圖44為紅花大金元超量表達NtIRLl轉基因植株的抗病性變化，其中I 6為紅花大金元超量表達NtIRLl基因植株，7 11為陰性對照植株。圖45為紅花大金元超量表達NtIRL2轉基因植株的抗病性變化，其中I 4為紅 花大金元超量表達NtIRL2基因植株，5 7為陰性對照植株。圖46為大伏煙反義抑制NtIRL基因家族成員轉基因植株的抗病性變化，其中CKl、CK2和CK3為陰性對照植株，I 5為大伏煙反義抑制轉基因植株。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的具體實施例進行詳細的描述。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中使用的普通菸草中菸鹼品種紅花大金元，普通菸草高菸鹼品種大伏煙和龍裡紅花煙由貴州省菸草科學研究院提供，田間常規種植。小量植物組織RNA抽提試劑盒、小量膠回收試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產品。GeneRacer Kit為Invitrogen公司產品。LA Taq DNA聚合酶、pMD18_T載體為寶生物工程(大連)有限公司產品。PCRDIG Probe Synthesis Kit 為 Roche 公司產品。RNA PCR Kit Ver. 3. O 為 TaKaRa 公司產品。測序工作委託上海英竣生物工程技術服務有限公司完成。載體pCambia2301G由柴友榮構建(植物抗大麗輪枝菌受體類蛋白基因及甘露糖結合型凝集素基因的克隆與表達.西南農業大學，2003)，是用HindIII和EcoRI雙酶切從pBI121質粒上切下其gus基因表達盒(3032bp)，回收後連接到經同樣雙酶切的pCambia2301載體上即得，其含有一個NPTII基因表達框和兩個CaMV35S啟動的植物表達框，一個表達⑶S基因，可實現Kan和⑶S活性的雙標記篩選，另一個表達框中的gus基因可用來替換成目的基因，實現外源基因的表達。一、NtIRL基因家族克隆及分子特徵1、基因組總DNA和總RNA的提取取龍裡紅花煙植株嫩葉，用CTAB法提取基因組總DNA。所得DNA進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，並稀釋200倍後採用分光光度法測量0D26(1、0D28(1、0D23(i等值。結果顯示，所得基因組總DNA完整性好，RNA消化較完全，純度較高，可用於PCR擴增及Southern雜父。分別取龍裡紅花煙植株的根、莖、葉、蕾、花、蒴果和開花後20天的種子，用小量植物組織RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，並用DNase I去除其中含有的DNA。所得各器官總RNA經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，質量好，特徵條帶清晰，無明顯RNA降解，無DNA汙染；經分光光度法檢測，純度較好，能夠滿足RACE操作及半定量RT-PCR檢測的要求。
2、總cDNA的獲得取龍裡紅花煙的根總RNA，用GeneRacer Kit去磷酸化和去mRNA帽子結構後，與寡核苷酸RNA Oligo連接，用GeneRacer Oligo dT引物進行反轉錄，獲得第一鏈cDNA ;然後，以所得第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer5』引物和GeneRacer3』引物，以LA Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，獲得總cDNA。PCR程序為94°C預變性4min ;然後94°C變性lmin，68°C退火併延伸6min,共28個循環；最後72°C延伸lOmin。所得總cDNA經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，呈現出大小在200bp IOkb之間的拖帶，重心區域在500bp 4kb之間，核心區域在1. 5kb左右，說明反轉錄完全，得到了高質量的總cDNA。3、NtIRL基因家族3' cDNA末端的克隆以龍裡紅花煙總cDNA為模板，用基因特異性引物NtIRL_31(SEQ ID No.1)和GeneRacer3』引物(SEQ ID No. 2)進行NtIRL基因家族:V RACE末端的一擴反應，PCR程序為94°C預變性4min ;然後94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共28個循環；最 後72°C延伸lOmin。然後，以一擴產物為模板，用基因特異性引物NtIRL_32 (SEQ ID No. 3)和GeneRacer3』巢式引物(SEQID No. 4)進行NtIRL基因家族3' RACE末端的巢式反應，PCR程序與一擴反應相同。巢擴產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4)，擴出了一條大小約500bp的條帶，與目的片段的預期長度相符。用小量膠回收試劑盒切膠回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，進行氨苄青黴素抗性和藍白斑篩選。取多個白斑單克隆，進行插入片段的PCR檢測(圖5)，結果顯示這些單克隆的插入片段存在一定的長度多態性。從PCR陽性單克隆中挑選一批具有長度多態性的代表性單克隆進行測序，對測得序列進行Blast分析，結果顯示，這些插入片段與林菸草NsA622基因(GenBank登錄號AB071165)的同源性最高，代表了 NtIRL基因家族的2條不同3' cDNA末端，長度分別為480bp和484bp (不計poly dA)，且每個基因都存在兩種以上的可變性加尾位點。4、NtIRL基因家族5' cDNA末端的克隆以龍裡紅花煙總cDNA為模板，用GeneRacer5』弓丨物(SEQ ID No. 5)和基因特異性引物NtIRL-51 (SEQ ID No. 6)進行NtIRL基因家族5' RACE末端的一擴反應，PCR程序與3' RACE末端的一擴反應相同。一擴產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖6)，擴出了一條大小約500bp的條帶，與目的片段的預期長度相符，因此無需進行巢擴反應。用小量膠回收試劑盒切膠回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，進行氨苄青黴素抗性和藍白斑篩選。取多個白斑單克隆，進行插入片段的PCR檢測(圖7)，結果顯示這些單克隆的插入片段長度一致，不存在多態性。選取PCR陽性單克隆進行測序，將測得序列去除5'末端人工接頭序列後進行Blast分析，結果顯示，這些插入片段與林菸草NsA622基因的同源性最高，代表了 NtIRL基因家族的2條不同5' cDNA末端，長度均為417bp (不計5'末端人工接頭序列)。5、NtIRL基因家族全長cDNA的克隆根據上述NtIRL基因家族5' cDNA末端和3' cDNA末端的序列信息，設計正向引 FNtIRL (SEQ ID No. 7)和反向引物RNtIRL (SEQ ID No. 8)。以龍裡紅花煙第一鏈cDNA為
模板，用FNtIRL引物和RNtIRL引物，PCR擴增NtIRL基因家族全長cDNA。PCR程序為94°C預變性4min ;然後94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共35個循環；最後72°C延伸lOmin。所得PCR產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖8)，擴出了與預期大小相符的約1. 2kb的條帶。用小量膠回收試劑盒切膠回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，進行氨苄青黴素抗性和藍白斑篩選。取多個白斑單克隆進行測序，將測得序列與5' cDNA末端序列和3' cDNA末端序列進行多重比對，結果發現2條不同的全長cDNA序列，長度分別為1257bp和1261bp (不計poly dA)，分別命名為NtIRLl (SEQ IDNo.9)和 NtIRL2(SEQ ID No. 10)。6、NtIRL基因家族全長基因組序列的克隆以龍裡紅花煙的基因組總DNA為模板，用FNtIRL引物(SEQ ID No. 7)和RNtIRL引物(SEQ IDNo. 8) PCR擴增NtIRL基因家族全長基因組序列，PCR程序與全長cDNA擴增相同。所得PCR產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖9)，擴出了與預期大小相符的約1. 9kb的條帶。用小量膠回收試劑盒切膠回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，進行氨苄青黴素抗性和藍白斑篩選。取多個白斑單克隆進行測序，分析測得序列，結果發現2條不同的全長基因組序列，長度分別為1946bp和2089bp (不計poly dA)，分 別命名為 NtIRLl gene (SEQ IDNo. 11)和 NtIRL2 gene (SEQ ID No. 12) 序列比對表明，它們在外顯子區與全長cDNA序列不一致。7、NtIRL基因家族及其推導的蛋白分子特徵分析ORF的查找與翻譯、分子量計算等在Vector NTI Advance 9. O上進行。GenbankBLAST和蛋白序列的Q)D搜索在NCBI (www. ncb1. nlm. nih. gov)上進行，推導的NtIRL蛋白的結構預測在冊w. expasy. org、www. softberry. com等網絡提供的軟體平臺上進行。(I)NtIRLI和NtIRL2基因的核苷酸序列分析NtIRLl基因的核苷酸序列及其推導的胺基酸序列如圖10所示。NtIRLl基因組全長為1946bp，由4個內含子和5個外顯子組成，除第2個內含子的剪切方式為GC/AG外，其它內含子均遵循標準的AG/GT…AG/AT剪切方式。NtIRLlcDNA全長為1257bp，在79-1011bp處有一個933bp的0RF，5'非編碼區(5' UTR)為78bp，3'非編碼區(3' UTR)為246bp。基因組序列的 dA、dG、dT、dC 含量分別為 32. 53%U6. 96%,32. 43%,18. 09% ；cDNA 序列的 dA、dG、dT、dC 含量分別為 30. 87%、19. 97%,29. 44%、19. 73%，符合低 dG+dC 含量的典型特徵。ORF的dG+dC含量為41. 37%，5' UTR和:V UTR的dG+dC含量分別為39. 74%和33. 33%，內含子 1、2、3、4 的 dG+dC含量分別為 25. 11%,24. 55%,33. 01%,27. 41%，非編碼區特別是3' UTR和4個內含子的dG+dC含量明顯低於編碼區。該基因在3』UTR中沒有典型的poly㈧加尾信號AATAAA JSA177ciATAAT1775和A192tlATGAA1925可能是非典型的加尾信號。NtIRL2基因的核苷酸序列及其推導的胺基酸序列如圖11所示。NtIRL2基因組全長為2089bp，由4個內含子和5個外顯子組成，除第2個內含子的剪切方式為GC/AG外，其它內含子均遵循標準的AG/GT…AG/AT剪切方式。NtIRL2cDNA全長為1261bp，在79-1011bp處有一個 933bp 的 0RF，5' UTR 為 78bp，3' UTR 為 250bp。基因組序列的 dA、dG、dT、dC含量分別為 32. 93%U6. 61%,33. 08%U7. 38%, cDNA 序列的 dA、dG、dT、dC 含量分別為32. 08%,19. 53%,29. 25 %、19. 14%，符合低 dG+dC 含量的典型特徵。ORF 的 dG+dC 含量% 41. 16%,UTR 和 3' UTR 的 dG+dC 含量分別為 38. 46%和 31. 60%，內含子 1、2、3、4的dG+dC含量分別為22. 46%,26. 54%,30. 15%,27. 35%，非編碼區特別是3，UTR和4個內含子的dG+dC含量明顯低於編碼區。該基因在3』UTR中沒有典型的poly(A)加尾信號AATAAA，但A1910ATAAT1915和A2063ATGA A2068可能是非典型的加尾信號。
將NtIRL基因家族2個成員進行同源性比對，結果顯示，NtIRLl和NtIRL2的基因組序列一致性為84. 9%，mRNA序列一致性為95. 1%，編碼區一致性為96. 9%，編碼區一致性遠遠高於非編碼區，證明了編碼區的保守性。對NtIRLl和NtIRL2的基因組序列和全長cDNA序列進行Blastn同源分析。結果見表1，它們與菸草屬A622基因具有最高的同源性，NtIRLl的mRNA對應於已報導的NtA622mRNA，其基因組序列對應於已報導的NsA622基因，NtIRL2則為本發明新克隆；它們與來自大豆、歐洲白樺、西洋梨、苜蓿、鷹嘴豆、擬南芥、大麥、蓮花、馬鈴薯、豌豆的IFR基因具有顯著的同源性，與來自黑楊、鐵杉、火炬松、連翹、北美白松的PCBER基因也具有較高的同源性，屬於SDR基因家族PIP亞家族成員，很可能對菸草的次生代謝有重要影響，並參與植物的防禦反應。表INtIRL基因與其它植物PIP家族成員的核苷酸序列同源分析
JmMfJlΖΓΓ7MllRUNifRa
GcnBank iJ__cDNA — 0RF cDNA"" ORF
MA622(D28505) _ ΜΨ.mlmvmii(X)% ~ I(X)fIf 96fc
NsA622(ABmilb5)__煙 ψ. Nivmiana sxtresuis__1(X)% 100% W:k 979
GmfFR(AFH)Iim__kGlycine max__ft 1.1% (、7.(y% 61.2Ψν 68.0%
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PsPCREmDQ49\515)Pimis sirajyus46.73 63·' 47.2% 64.4%(2) NtIRLl和NtIRL2基因推導的蛋白胺基酸序列分析NtIRLl和NtIRL2基因都編碼由310個胺基酸組成的蛋白質，理論分子量(Mw)分別為34. 652kDa和34. 650kDa，等電點(pi)分別為5. 58和5. 78。NtIRLl蛋白的胺基酸組成中，異亮氨酸的含量最高(9. 03%)，其次是亮氨酸(8. 71%)，含量最低的是半胱氨酸和色氨酸(均為O. 65%)。NtIRL2蛋白的胺基酸組成中，也是異亮氨酸的含量最高(9.03%)，其次是亮氨酸和賴氨酸(均為8. 39% )，含量最低的是半胱氨酸和色氨酸(均為O. 65% )。兩個NtIRL蛋白中酸性胺基酸的數目(分別佔胺基酸總數的12. 90%和12. 58% )均略多於鹼性胺基酸(分別佔胺基酸總數的11. 29%和10. 97% )，都為弱酸性蛋白。通過序列比對發現，NtIRLl和NtIRL2蛋白在胺基酸水平上有著很高的同源性，一致性和相似性分別高達95. 5%和97. 4%，說明蛋白水平存在高度保守性。NCBI BLASTp分析(表2)表明，NtIRLl和NtIRL2蛋白的胺基酸序列與菸草屬A622蛋白的同源性最高，一致性均在95%以上；與來自西洋梨、大豆、歐洲白樺、擬南芥、馬鈴薯、大麥、蓮花、苜蓿、鷹嘴豆、豌豆的IFR蛋白有著廣泛的同源性，一致性分別為50% 66%和50% 67%，相似性分別為68% 80%和69% 81% ;與來自連翹、黑楊、鐵杉、北美白松、大麻、火炬松的PCBER蛋白有著一定的同源性，一致性分別為58 % 63 %和59 % 64 %，相似性分別為75 % 79 %和77 % 79 %;與來自北美香柏的PLR蛋白有較低的同源性，一致性分別為47%和50%，相似性分別為66%和67% ;說明在進化系統中NtIRL與IFR的關係比PCBER和PLR更近。表2NtIRL蛋白與其它植物PIP蛋白的胺基酸序列同源分析
權利要求
1.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的開放閱讀框序列，如SEQID No. 10中第79-1011位核苷酸所示。
2.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的全長cDNA序列，如SEQID No. 10所示。
3.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的基因組序列，如SEQID No. 12所示。
4.含有權利要求1或3所述序列的正義植物表達載體。
5.根據權利要求4所述的正義植物表達載體,其特徵在於所述正義植物表達載體是將普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRL2的基因組序列正向插入載體pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位點之間，替換其中的gus基因而得；所述載體pCambia2301G是用HindIII和EcoRI雙酶切從pBI121質粒上切下gus基因表達盒，再將其連接到經同樣雙酶切的pCambia2301載體上而得。
6.含有普通菸草類異黃酮還原酶基因家族成員共保守片段的反義植物表達載體，所述普通菸草類異黃酮還原酶基因家族成員為NtIRLl和NtIRL2 ;所述NtIRLl基因的全長cDNA序列如SEQ IDNo. 9所示；所述NtIRL2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示。
7.根據權利要求6所述的反義植物表達載體，其特徵在於所述反義植物表達載體是將普通菸草類異黃酮還原酶基因家族成員共保守片段NtIRLA反向插入載體pCambia2301G的BamHI和SacI多克隆位點之間，替換其中的gus基因而得；所述普通菸草類異黃酮還原酶基因家族成員共保守片段NtIRLA的核苷酸序列如SEQ ID No. 9中第1-1179位核苷酸所示；所述載體pCambia2301G是用HindIII和EcoRI雙酶切從pBI121質粒上切下gus基因表達盒，再將其連接到經同樣雙酶切的pCambia2301載體上而得。
8.含有權利要求4或5所述正義植物表達載體或權利要求6所述反義植物表達載體的微生物轉化體。
9.權利要求1至3任一項所述序列在普通菸草菸鹼含量和抗真菌病害方面的分子育種中的應用。
10.普通菸草類異黃酮還原酶基因NtIRLl在普通菸草菸鹼含量和抗真菌病害方面的分子育種中的應用，所述NtIRLl基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 9所示，基因組序列如SEQ ID No. 11 所示。
全文摘要
本發明公開了普通菸草類異黃酮還原酶(NtIRL)基因家族新成員NtIRL2，其開放閱讀框序列如SEQ ID No.10中第79-1011位核苷酸所示，對NtIRL基因家族成員NtIRL1和NtIRL2進行了系統的生物信息學分析，闡明了NtIRL1和NtIRL2基因在普通菸草各個組織器官中的表達特徵，構建了正義和反義植物表達載體，通過遺傳轉化證實NtIRL1和NtIRL2基因都編碼有活性的菸鹼合成相關酶，在菸草菸鹼的生物合成代謝途徑中有著重要作用，並參與煙株的抗真菌病害防禦，可用於調節普通菸草的菸鹼含量和抗病性改良，有助於低菸鹼、高抗真菌病害優質菸草的基因工程育種。
文檔編號C12N1/21GK103014029SQ201210584279
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者陳偉, 柴友榮, 李智勇, 潘文杰, 雷波, 王三根 申請人:貴州省菸草科學研究院