左旋二酮還原酶基因及其用途的製作方法

2024-03-02 13:31:15 1

專利名稱：左旋二酮還原酶基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼新型酶，即左旋二酮(levodione)還原酶的DNA，含有所述DNA的表達載體，含有所述DNA的重組載體，導入所述DNA的微生物，以及使用所述微生物由(6R)-2,2,6-三甲基-1,4-環己二酮(下文稱之為左旋二酮)生產(4R,6R)-4-羥基-2,2,6-三甲基環己酮(下文稱之為actinol)的方法。actinol是天然光活性化合物，如玉米黃質的有用的手性構件。
1998年8月19目提交的歐洲專利申請98115564.1公開了製備actinol的方法，所述方法包括使左旋二酮與微生物接觸，所述微生物選自纖維單胞菌屬，棒桿菌屬，動性球菌屬和節桿菌屬，並能選擇性地將左旋二酮不對稱地還原為actinol；從反應混合物中回收所得actinol。已證實，此方法中最好的菌株之一是水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)，已根據布達佩斯條約，於1998年8月4日，以F.Hoffmann-La Roche AG(地址為Grenzacherstrasse 124,CH-4070 Basel，瑞士)的名義將該菌株保藏於日本通產省國立生物科學和人類技術研究所。
1999年2月1日提交的歐洲專利申請99102037.1描述了一種新的酶，即左旋二酮還原酶，該酶對左旋二酮起作用以產生actinol，該酶分離自水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)。該酶的特徵在於下列物理-化學特性1)左旋二酮還原酶催化左旋二酮區域-和立體選擇性地還原為actinol；2)據估計，酶的相對分子量為142,000-155,000±10,000Da，該酶由4個分子量為36,000±5,000Da的均一亞單位組成；3)pH7.0時的最適溫度是15-20℃，最適pH為7.5；4)酶需要NAD+或NADH為輔因子，並能被單價陽離子，如K+,Na+,Cs+,Rb+和NH4+高度激活。
本發明涉及編碼新型酶，即左旋二酮還原酶的DNA序列，所述酶可用於製備actinol，而actinol是生產玉米黃質的重要中間體。
更具體地，分離的DNA序列的特徵在於(a)所述核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的所述酶，或(b)所述核苷酸序列編碼所述酶的變體，所述變體選自(ⅰ)等位基因變體或(ⅱ)具有一個或多個胺基酸添加，插入，缺失和/或取代但仍具有相同類型的酶活性的酶。需特別指出的是，上述分離的DNA序列可以得自水生棒桿菌的基因，並選自(ⅰ)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(ⅱ)核苷酸序列，因遺傳密碼的簡併性，其所編碼的左旋二酮還原酶具有與核苷酸序列(ⅰ)所編碼的酶相同的胺基酸序列；和(ⅲ)核苷酸序列，其在標準雜交條件下能與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列的互補序列雜交。
本發明還提供了含有編碼左旋二酮還原酶之序列的重組DNA，該重組DNA可通過本發明上述分離DNA的基因重組來獲得。優選該重組DNA為載體的形式。所述重組DNA可含有調節區，如啟動子和終止子以及上述基因的開放閱讀框。
本發明還提供了所述重組DNA轉化宿主生物體的用途。便利的重組DNA形式可以是載體。被重組DNA轉化的宿主生物體可用於改良actinol的生產方法。因此，本發明還提供了這種重組生物體。
本發明還提供了利用生物生產actinol的方法，所述方法包括將本發明的重組DNA導入適當的宿主生物體，並在底物左旋二酮的存在下培養所得重組生物體。
此外，本發明還提供了利用生物生產actinol的方法，所述方法包括將上述重組DNA導入適當的宿主生物體，並在底物左旋二酮的存在下培養所得重組生物體。因此，本發明的一個方面是生產actinol的方法，所述方法的特徵在於在有助於生產actinol的條件下培養上述重組生物體。此方法可用於actinol的生物生產。
下面將更詳細地描述本發明。
1．定義本文所用「左旋二酮還原酶」指的是在NADH的存在下，能催化左旋二酮區域-和立體選擇性地轉變為actinol的多肽。1999年2月1日提交的歐洲專利申請99102037.1描述了左旋二酮還原酶的物理-化學特性。通過下述方法可製備出本發明的左旋二酮還原酶在需氧條件下，在含水營養培養基中培養適當的微生物，破碎微生物細胞，從破碎的微生物細胞的無細胞提取物中分離和純化左旋二酮還原酶。已發現很多種微生物能催化所述轉變，包括纖維單胞菌屬，棒桿菌屬，動性球菌屬和節桿菌屬。酶的優選菌株是水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)。
本文所用「等位基因」是核酸序列中的至少一個突變所致的另一種基因形式。等位基因可導致結構或功能被改變或不變的經改變的mRNA或多肽。任何給定的基因可不具有，或具有一個或多個等位基因形式。常見的可產生等位基因的突變變化一般是由核苷酸的天然缺失，添加或取代所引起的。這些類型的突變中的每一種可以單獨地，或者與其它突變聯合，一次或多次地出現於給定序列。本文所用的左旋二酮還原酶的「變體」指的是一個或多個胺基酸有所改變的胺基酸序列。變體可具有「保守的」改變，其中取代的胺基酸具有類似的結構或化學特性，如用異亮氨酸取代亮氨酸。更罕見的是，變體可具有「非-保守的」改變，如用色氨酸取代甘氨酸。類似的微不足道的改變也包括胺基酸缺失或插入，或包括這兩者。本文所用的「缺失」指的是胺基酸或核苷酸序列中的改變，其中分別缺少一個或多個胺基酸或核苷酸殘基。本文所用的「插入」或「添加」指的是胺基酸或核苷酸序列中的改變，相對於天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個胺基酸或核苷酸殘基。本文所用的「取代」指的是分別用不同的胺基酸或核苷酸取代一個或多個胺基酸或核苷酸。
「表達載體」包括能表達其所包含的DNA序列的載體，在所述載體中，所述DNA序列與能實現其表達的其它序列可操作相連。儘管沒有明確地提及，但不言而喻的是，表達載體必須能在宿主生物體中複製，或者以附加體的形式複製，或者作為染色體DNA的整合部分複製。顯然，如果不能複製，這些載體將不能被有效應用。總之，還給出了「表達載體」的功能性定義。一般說來，可用於DNA重組技術的表達載體經常是「質粒」的形式。質粒指的是環狀雙鏈DNA分子或環狀單鏈DNA分子，其含有得自絲狀噬菌體的複製起點。這些以載體形式存在的DNA分子不與染色體相連。其它常用的有效載體是噬菌體和非-環狀DNA。在本說明書中，「質粒」和「載體」經常可以互換使用。然而，本發明還欲包括其它形式的表達載體，所述載體行使等同的功能，並且是已知的，或以後會為人所知。
「重組宿主細胞」，「宿主細胞」，「細胞」，「細胞培養物」等可以互換使用，用於指已經或將被本發明的重組載體轉化的個體細胞，細胞系，細胞培養物和收集的細胞。該術語也包括最初接受載體的細胞的後代。
「轉化」指的是任何改變宿主DNA含量的過程。
術語「標準雜交條件」指的是本領域技術人員得到特定信號所用的條件。所述條件可在從低度嚴緊條件(6×SSC,50℃；過夜；室溫下用6×SSC洗滌)至優選的中度嚴緊條件(6×SSC,65℃；過夜；30℃下用6×SSC洗滌)至最優選的高度嚴緊條件(6×SSC,75℃；過夜；37℃用6×SSC洗滌2次)的範圍內變化。或者，通過同源性的百分比測定相似性水平。為了測定同源性，通過適當的電腦程式將待檢查的兩個序列互相對比。通過使用程序的標準條件，權利要求所要求的序列與本申請公開的序列的同源性百分比至少為40％，優選至少為60％，更優選至少為80％。
用單字母或三字母名稱定義胺基酸縮寫胺基酸A=Ala=丙氨酸V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸I=Ile=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬醯胺Q=Gln=穀氨醯胺 D=Asp=天冬氨酸E=Glu=穀氨酸K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸H=His=組氨酸以下是本發明所用材料的供應商列表。
a．Invitrogen:1600 Faraday Avenue,Carlsbad,CA92008，美國b．Amersham Pharmacia Biotech:SE-751 84 Upsara，瑞典c．Toyobo:2-2-8 Dojimahama,Kita-ku,Osaka，日本d．Takara Shuzo:2-15-10 Nihonbashi,Chuo-ku,Tokyo，日本e．Promega:2800 Woods Hollow Road,Madison,WI，美國f．BIO101:2251 Rutherford Rd.,Carlsbad,CA92008，美國g．PE Biosystems:850 Lincoln Center Drive,Foster City,CA 94404，美國h．Shimadzu:1 Nishinokyo,Kuwabaracho,Nakagyo-ku,Kyoto，日本
i．Shinwa Chemical Industries:50 Keishocho,Fushimi-ku,Kyoto，日本j．Wako Pure Chemicals:3-1-2 Doshoumachi,Chuo-ku,Osaka，日本k．Oriental Yeast:3-6-10 Shodosawa,Itabashi-ku,Tokyo，日本1．Amano Pharmaceuticals:1-2-7 Nishiki,Naka-ku,Nagoya，日本2．左旋二酮還原酶基因編碼本發明的左旋二酮還原酶的基因是含有核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列編碼的多肽具有將左旋二酮轉變為actinol的酶活性。所述基因的代表性例子是左旋二酮還原酶基因，該基因可克隆自水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)。該基因是含有核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列編碼的多肽含有序列表的SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。
DNA序列可克隆自水生棒桿菌菌株AKU611(FERM BP-6448)，或另一個相關的生物體，因此，該序列可以是例如，DNA序列的左旋二酮還原酶編碼區的等位基因變體或種的變體。本發明範圍內還包括具有不同核苷酸添加，插入，缺失和/或取代，導致多肽編碼相同或功能等同的左旋二酮還原酶的DNA序列衍生物。編碼的蛋白質也含有胺基酸殘基的添加，缺失，插入和/或取代，它們可產生沉默突變，並導致功能等同的左旋二酮還原酶。
如上所述，左旋二酮還原酶基因產物，即本發明的左旋二酮還原酶具有將左旋二酮轉變為actinol的酶活性。編碼該酶活性的基因仍是未知的。另一方面，通過使用左旋二酮還原酶基因，可以使諸如大腸桿菌等微生物將左旋二酮轉變為actinol。
3．DNA的獲得本發明提供了編碼左旋二酮還原酶的分離的DNA序列，所述酶在微生物中參與左旋二酮至actinol的轉變。本發明的所述DNA也指基因組DNA，其含有參與所需基因表達的調節序列，如啟動子和終止子，還指在其5』和3』非翻譯區域側翼中的短片段之間僅含有開放閱讀框的cDNA。
通過下列步驟可得到本發明所用的左旋二酮還原酶基因，重組表達載體和重組生物體(1)從可提供本發明的左旋二酮還原酶的微生物中分離染色體DNA，用該染色體DNA構建基因文庫；(2)通過菌落-或噬斑-雜交，PCR克隆，Southern印跡雜交等從染色體DNA中克隆左旋二酮還原酶基因；
(3)通過常規方法測定上文所得左旋二酮還原酶基因的核苷酸序列，構建含有並有效表達左旋二酮還原酶基因的重組表達載體；(4)通過轉化，轉導，轉接合和電穿孔構建重組生物體，所述生物體攜有位於重組表達載體或染色體上的左旋二酮還原酶基因。
用於分離或克隆編碼本發明左旋二酮還原酶的DNA的技術是本領域已知的，這些技術包括從基因組DNA中的分離。通過使用簡併的聚合酶鏈反應(下文稱之為PCR)可從這類基因組DNA中克隆本發明的DNA序列。
為了克隆左旋二酮還原酶基因，必須了解左旋二酮還原酶的胺基酸序列。為此，可純化左旋二酮還原酶蛋白，並通過常規方法(Biosci.Biotechnol.Biochem,62,280-285,1998)測定部分胺基酸序列。不必測定完整的胺基酸序列。一旦鑑定出適當的胺基酸序列，可根據所述部分胺基酸序列的有關資料合成寡核苷酸以用作PCR引物。在本發明中，用於通過PCR克隆左旋二酮還原酶基因的引物基於得自下列屬的純化左旋二酮還原酶之內部肽片段的胺基酸序列，所述屬包括但不限於棒桿菌屬，纖維單胞菌屬，動性球菌屬和節桿菌屬，在最優選的實施方案中，得自水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)。通過用所述引物和水生棒桿菌染色體DNA模板進行PCR擴增，產生左旋二酮還原酶的DNA片段(部分DNA序列)。擴增的DNA片段可用作探針以克隆編碼完整水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)左旋二酮還原酶的基因組片段。
將經上述PCR得到的部分DNA片段標記之後用作探針，篩選在適當宿主中的噬菌體載體或質粒載體中構建的基因組文庫，由染色體克隆含有編碼區以及調節區，如啟動子或終止子的完整基因。通常，作為宿主菌株的大腸桿菌和大腸桿菌載體，噬菌體載體，如λ噬菌體載體，質粒載體或酵母載體常被用於構建文庫和隨後的基因操作，如測序，限制性消化，連接等。從質粒或噬菌體文庫中鑑定所需克隆最好由探針來實現，以使所需基因能在適當的嚴緊條件下與具有所需基因的一部分的探針雜交。本發明在pYES2中構建水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的基因組文庫。在本發明中，根據廠商(Amersham Pharmacia Biotech)提供的方法，用辣根過氧化物酶(下文稱之為HRP)而不是常規的32P標記物標記用作探針的PCR-擴增片段。通過使用經HRP-標記，並具有所需基因的一部分的DNA片段為探針，篩選由水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的染色體構建的基因組文庫。挑選雜交菌落並用於進一步的研究。分離出陽性菌落之後，將插入片段亞克隆至便於測序的適當質粒載體。在本發明中，將陽性載體中的插入片段亞克隆至pUC18載體。
通過眾所周知的方法，如雙脫氧鏈-終止法(美國國家科學院院報，74,5463-5467,1977)測定目的基因的核苷酸序列。
可根據本領域眾所周知的方法，使用本發明的分離的DNA序列從不同屬或種的其它菌株中鑑定和克隆編碼具有左旋二酮還原酶活性之多肽的DNA。
4．DNA構建體和微生物的轉化本發明還涉及含有編碼左旋二酮還原酶之序列的重組DNA，優選為載體和/或質粒。所述重組DNA載體和/或質粒可含有調節區，如啟動子和終止子以及上述DNA的開放閱讀框。
可使用本領域技術人員眾所周知的方法構建表達載體，所述載體含有編碼左旋二酮還原酶的序列和適當的轉錄和翻譯調節元件，包括有利於表達核苷酸序列的編碼序列或所述表達所必需的所有組分，例見Ausubel F.M等，1989，最新分子生物學方法，John wiley Sons，紐約。也可使用特定的起始和終止信號以更有效地翻譯編碼左旋二酮還原酶的序列。
可以多種方式操作編碼左旋二酮還原酶的分離的DNA序列以提供多肽的表達。對編碼所述左旋二酮還原酶的核苷酸序列進行操作後再將其插入載體較為合適或是必需的，這取決於表達載體。利用克隆方法修飾核苷酸序列的技術是本領域眾所周知的。
可利用多種表達載體/宿主系統包含和表達編碼左旋二酮還原酶的序列。它們包括但不限於被重組噬菌體，質粒或粘粒DNA表達載體轉化的微生物，如細菌；被酵母表達載體轉化的酵母；被病毒表達載體或細菌表達載體轉化的植物細胞系統；或動物細胞。可根據左旋二酮還原酶的用途選擇表達載體。例如，當需要大量左旋二酮還原酶時，可使用能介導導入的DNA序列高水平表達的載體。這類載體包括但不限於大腸桿菌克隆和表達載體，如pBluescriptⅡ和pUC18。
被編碼本發明的左旋二酮還原酶的DNA序列轉化的宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。宿主細胞的選擇在很大程度上取決於編碼多肽的基因及其來源。適當的原核宿主細胞具體可以是細菌細胞，例如大腸桿菌，其可用於提供高水平的蛋白質表達。為了過量表達所需的酶，可使用有望用於高水平表達的適當啟動子系統。這類啟動子包括但不限於lac或T7表達系統。
5．通過重組生物體生產actinol本發明還提供了所述重組DNA，載體或質粒轉移宿主生物體的用途。使用重組DNA得到的重組生物體能過量表達編碼左旋二酮還原酶的DNA序列。被重組DNA轉化的宿主生物體可用於actinol的生產方法。因此，本發明還提供了這類重組生物體/轉化的宿主。
6．通過重組生物體生產左旋二酮還原酶本發明還涉及生產左旋二酮還原酶的方法，所述方法包括在有助於生產所述酶的條件下培養上述重組生物體，本發明還涉及酶本身。也可在適於表達和從細胞培養物中回收蛋白質的條件下培養被編碼左旋二酮還原酶的核苷酸序列轉化的宿主細胞。
可在營養培養基中培養重組生物體，所述培養基含有糖類，如葡萄糖和蔗糖，醇，如乙醇和甘油，脂肪酸，如油酸和硬脂酸或其酯，或油，如菜油和豆油作為碳源；硫酸銨，硝酸鈉，蛋白腖，胺基酸，玉米浸出汁，麥麩，酵母提取物等作為氮源；硫酸鎂，氯化鈉，碳酸鈣，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀等作為無機鹽來源；麥芽膏，肉汁浸膏等作為其它營養來源。可在需氧條件下進行培養，一般在3-9的中性pH下，以10至40℃的溫度培養1至7天。
重組細胞產生的左旋二酮還原酶可以分泌，也可以包含在細胞內，這取決於所用序列和/或載體。然後可通過常規方法從培養基或宿主細胞中分離左旋二酮還原酶。
培養後從重組細胞中分離和純化左旋二酮還原酶的實施方案如下所述(1)通過離心或過濾從液體培養物肉湯中收集細胞；(2)用水，生理鹽水或具有適當pH的緩衝液洗滌收集的細胞；(3)將經洗滌的細胞懸浮於緩衝液中，並通過勻漿器，超聲發生器，弗式壓碎器或用溶菌酶處理等破碎細胞，得到破碎細胞的溶液；(4)從破碎細胞的無細胞提取物中分離和純化左旋二酮還原酶。
證實了酶活性之後，使用經表達的左旋二酮還原酶蛋白產生抗純化酶的抗體。在菌株改良，培養條件的最優化等多項研究中使用如此製備的抗體鑑定相應酶的表達。
實施例在下文所述實施例中使用下列材料和方法菌株水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)大腸桿菌DH5α:[φ80δlacZΔM15,F-,λ-,Δ(lacZYA-argFV169),hsdR17(rK-,mK+),recAl,endAl,supE44,deoR,thi-1,gyrA96,relAl](Toyobo,Osaka,日本)。大腸桿菌JM109:[recAl,endAl,gyrA96,thi,hsdR17(rK-,mK+),mcrB+,supE44,relAl,Δ(lac-proAB),F′(traD36,proAB,lacIq,lacZΔM15),λ-](Toyobo,Osaka，日本)。
載體pYES2(Invitrogen)pGEM-T(Promega)pUC18(Toyobo)引物T-7引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′SP6引物5′-TACGATTTAGGTGACACTAT-3′M13引物M4:5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′M13引物RV:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′培養基於30℃在培養基(pH7.0)中將水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)需氧培養20小時，所述培養基含有1％葡萄糖，1.5％蛋白腖，0.3％K2HPO4,0.1％酵母提取物，0.2％NaCl和0.02％MgSO47H2O。在LB培養基或添加有水解酪蛋白胺基酸的M9培養基(pA-3，分子克隆，1989，冷泉港實驗室出版社)中培養含有水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)左旋二酮還原酶基因的大腸桿菌轉化子，所述LB培養基由10g胰蛋白腖，10g氯化鈉和5g酵母提取物(pH7.2)/升組成。
酶和化合物限制性內切核酸酶和其它DNA-修飾酶得自Takara Shuzo和Toyobo。Taq DNA聚合酶Ex taq和Ex taq緩衝液購自Takara Shuzo。ECL直接核酸標記和檢測系統購自Amersham Pharmacia Biotech。
方法根據分子克隆實驗室手冊，第2版(冷泉港實驗室出版社，1989)實施分子遺傳學的一般方法。
使用基因組分離試劑盒(BIO101)從水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)中分離染色體DNA。
用熱循環儀(PE Biosystems)進行聚合酶鏈反應(PCR)。使用AppliedBiosystems 381A型自動合成儀(PE Biosystems)，通過亞磷醯胺法合成簡併PCR引物。
使用雙脫氧鏈-終止法(美國國家科學院院報，74,5463-5467,1977)進行核苷酸序列分析。自動測序儀(377A型DNA測序儀，PE Biosystems)使用了Taq染料引物測序試劑盒。
通過在340nm下，用分光光度法測定NADH含量的光吸收值依賴於左旋二酮的降低即可測定左旋二酮還原酶活性。標準的2.5ml試驗混合物含有5μmol左旋二酮(終濃度，2.0mM),0.8μmol NADH,500μmol磷酸鉀緩衝液(pH7.0)和酶。一個單位的酶活性被定義為每分鐘催化1μmol NADH氧化的酶量。
使用裝配有火焰離子化檢測儀的ShimadzuGC-14B型GC(氣相層析)，於160℃(等溫)使用HR-20M毛細管柱(0.25mm,30m；Shinwa ChemicalIndustries)，以He為載氣，1ml/min為流速定量分析左旋二酮和actinol的含量。在這些條件下，分別在6.8,15.6和15.9分鐘洗脫出左旋二酮，actinol和(4S,6R)-羥基-2,2,6-三甲基環己酮(actinol的非對映體)。
根據1999年2月1日提交的歐洲專利申請99102037.1中描述的方法純化左旋二酮還原酶。在應用環境微生物，62,2303-2310,1996所述的條件下，用賴氨醯內肽酶(Wako Pure Chemicals)消化純化的酶。通過在μRPC C2/C18柱(Amersham Pharmacia Biotech)上進行反相高效液相層析來分離肽，所述柱與Smart系統(小規模的蛋白質純化系統；Amersham Pharmacia Biotech)相連。用含有0.1％三氟醋酸的0至80％乙腈線性梯度洗脫肽。
通過按前人所述(Biosci.Biotechnol.Biochem,62,280-285,1998)，用476A型脈衝液體蛋白質測序儀(PE Biosystems)進行自動化的Edman降解以測定部分胺基酸序列。將所得部分胺基酸序列與登錄在SWISS-PROT(版本37.0+/06-14,99年6月發布)，PIR(版本60.0,99年3月發布)和PRF(版本99-05,99年5月發布)蛋白質資料庫中的蛋白質序列相比較。通過使用Blast(分子生物學雜誌，215,403-410,1990)和Fasta(美國國家科學院院報85,2444-2448,1988)程序進行序列對比。
提供下列實施例以進一步闡明本發明。這些實施例僅闡明而不以任何方式限制本發明的範圍。
實施例1水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的部分胺基酸序列使用476A型脈衝液體蛋白質測序儀(PE Biosystems)進行自動化的Edman降解以測定純化的水生棒桿菌左旋二酮還原酶的N-末端胺基酸序列。該序列類似於其它短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族酶的NH2-末端胺基酸序列，所述酶的例子包括假單胞菌菌株KKS102的二苯基-2,3-二氫-2,3-二醇脫氫酶(Biochem.Biophys.Res.Commun,202,850-856,1994)。另外，此NH2-末端胺基酸序列含有G-X-X-X-G-X-G，它在SDR家族蛋白質的NH2-末端區域是高度保守的。下列胺基酸序列得自左旋二酮還原酶的N-末端表1N-末端胺基酸序列TATSSPTTRFTDRVVLITGGGSGLGRATAVRLAAEGAKLSSVD(SEQ ID No.:3)用賴氨醯內肽酶消化左旋二酮還原酶蛋白，通過Smart系統(AmershamPharmacia Biotech)分離所得消化物。分離肽(K-1,K-2和K-3)，用蛋白質測序儀分析這些肽的胺基酸序列。K-1,K-2和K-3序列示於表2。當使用序列相似性檢索程序Blast和Easta將這些序列與3個蛋白質序列資料庫(PIR,PRF和SWISS-PROT)中的序列相比較時，K-1和K-2序列分別顯著類似於皆屬於SDR家族的少動鞘氨醇單胞菌2,5-二氯-2,5-環己二烯-1,4-二醇脫氫酶(細菌學雜誌，176,3117-3125,1994)和流感嗜血桿菌3-氧代醯基-[醯基-載體蛋白]還原酶(流感嗜血桿菌Rd完整-基因組隨機測序和裝配，科學，269,495-512,1995)的部分胺基酸序列。然而，K-3與SDR家族任何其它蛋白質都沒有顯著的相似性。
表2K-1,K-2和K-3的部分胺基酸序列肽K-1:HGVVGLTRNSAVEYGRYGIRINAIA(SEQ ID No.:4)肽K-2:RYGEAPEIAAVVAFLLSDDASYVNA(SEQ ID No.:5)肽K-3:AAVLETAPDAEVLTT(SEQ ID No.:6)實施例2構建基因組DNA文庫通過使用基因組分離試劑盒(BIO101)製備水生棒桿菌AKU611(FERMBP6448)的染色體DNA。用Sau3AI部分消化水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的染色體DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分級分離經消化的染色體DNA。將佔優勢的2-3kb DNA片段(500ng)與經BamHⅠ-消化的pYES2載體(200ng)混合，於16℃，在體外使用Ligation high(Toyobo)連接30分鐘，使用連接混合物轉化感受態大腸桿菌DH5α細胞(Toyobo)。於37℃，在含有氨苄青黴素的LB瓊脂平板上平鋪和培養感受態的大腸桿菌DH5α細胞過夜。得到文庫(2,242個菌落)。
實施例3通過PCR擴增克隆左旋二酮還原酶基因組DNA擴增水生棒桿菌AKU611(FERM BP6448)的部分左旋二酮還原酶基因根據水生棒桿菌AKU611(FERM BP6448)左旋二酮還原酶肽的內部肽片段的胺基酸序列(表2)設計併合成簡併的寡核苷酸引物。如表3所示，根據肽K-2的胺基酸序列YGEAPEI合成引物2-23(+)和2-23(-)，根據肽K-1的胺基酸序列AVEYGRY合成引物1-19(+)和1-19(-)。引物1-19(+)和1-19(-)含有一個肌苷組成成分。
表3用於克隆左旋二酮基因的引物序列2-23(+)；5′-TAYGGNGARGCNCCNGARAT-3′(SEQ ID No.:7)2-23(-)；5′-ATYTCNGGNGCYTCNCCRTA-3′(SEQ ID No.:8)1-19(+)；5′-GCNGTNGARTAYGGNMGITA-3′(SEQ ID No.:9)1-19(-)；5′-TAICKNCCRTAYTCNACNGC-3′(SEQ ID No.:10)(R=A或G,K=G或T,Y=C或T,M=A或C,N=A,C,G或T)使用熱循環儀(PE Biosystems)通過PCR擴增基因組DNA。使用100ng水生棒桿菌AKU611(FERM BP6448)的染色體DNA為模板，5μM各種簡併引物，各為312μM的dATP,dCTP,dGTP和dTTP,2.5U(終濃度)Ex Taq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶，和2μl EX Taq緩衝液(Takara Shuzo)進行PCR反應(20μl)。於95℃將反應物保溫5分鐘之後加入Taq聚合酶(2.5 U)，然後按下述將反應循環進行25次95℃,30秒，42℃,30秒和72℃,2分鐘。檢測多種引物組合，其中的一個組合導致顯著的帶[2-23(-)和1-19(+)]。使用瓊脂糖凝膠電泳分離和純化反應產物。在經凝膠純化的PCR產物的3』末端添加腺嘌呤尾，並與pGEM-T載體連接。使用連接混合物轉化感受態大腸桿菌DH5α。培養轉化子，然後提取質粒。使用得自T載體的引物T-7和SP6，通過自動測序儀測定核苷酸序列。由序列可以看出，PCR產物由172bp核苷酸(表4)組成，推定的胺基酸序列與天然左旋二酮還原酶蛋白的內部胺基酸序列一致。
表4PCR擴增片段的DNA和推定的胺基酸序列102030 40GCAGTCGAGTATGGGCGGTACGGCATCCGCATCAACGCCATCGCCCCCA V E Y G R Y G I R I N A I A P506070 8090GGCGCCATCTGGACGCCGATGGTCGAGAACTCGATGAAGCAGCTCGACG A I W T P M V E N S M K Q L D100 110 120 130 140CCGGAGAACCCCCGCAAGGCCGCCGAGGAGTTCATCCAGGTCAACCCCP E N P R K A A E E F I Q V N P150 160 170TCCAAGCGCTACGGCGAAGCCCCAGAGA(SEQ ID No.:11)S K R Y G E A P E實施例4克隆水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的左旋二酮還原酶基因組基因(1)使用PCR擴增的產物為探針克隆水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的左旋二酮還原酶基因組基因使用PCR擴增的172bp片段從基因組DNA文庫中篩選左旋二酮還原酶基因組基因。通過熱處理使PCR擴增的172bp片段變性，然後根據廠商說明，使用ECL直接核酸標記和檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech)，用辣根過氧化物酶(HRP)標記變性的片段。將實施例2中所述的文庫(2,242個菌落)轉移至Hybond N+，即帶正電的尼龍膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，通過含有0.5 M NaOH的緩衝液使其變性和固定。用HRP-標記的PCR片段與膜雜交，雜交之後，洗滌膜，通過化學發光檢測系統檢測膜上的陽性克隆。從基因組文庫的2,242個菌落(重組體)中得到25個陽性克隆。
為了研究這些克隆中是否含有左旋二酮還原酶的基因片段，以及選擇陽性克隆，用1-19(+)和2-23(-)為引物，25個克隆中的每一個為模板進行PCR。反應混合物(20μl)含有0.5μM每種引物，10ng模板(25個克隆中的每一個)，各為312μM的dNTP,2.5U(終濃度)Ex Taq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶，和2μl EX Taq緩衝液(Takara Shuzo)。所用PCR條件是96℃,1分鐘，接著按下述將反應循環進行25次95℃,30秒，55℃,30秒和72℃,1分鐘。結果，第27號克隆攜有約為8.5kb的DNA片段，其含有約2.7kb插入的DNA，選擇該克隆進行進一步的分析。
(2)第27號克隆的核苷酸測序使用引物步行(walking)技術，用自動測序儀進行DNA測序。引物pYES2(+)和pYES2(-)得自pYES2，引物2-23(-),27-2(-)和27-1(-)得自內部肽片段，使用這些引物進行DNA測序。對pYES2(+)一側的約260bp核苷酸和pYES2(-)一側的約820bp核苷酸進行測序，所用引物示於表5。
表5引物序列pYES2(+)；5′-GCCAGTGTGATGGATATCTGCAG-3′(SEQ ID No.:12)pYES2(-)；5′-GGATCGGACTACTAGCAGCTG-3′(SEQ ID No.:13)27-2(-)；5′-TAATCGGTCATGCACCCGTGTC-3′(SEQID No.:14)27-1(-)；5′-AGACCGAGCTGGTCGAGGCTCT-3′(SEQ ID No.:15)為了更詳細地分析核苷酸序列，用SacⅠ消化第27號克隆以進行亞克隆和DNA測序。使用瓊脂糖凝膠電泳分離和純化大小為7.5kb和1kb的2個片段。使用Ligation high經自身連接使包括1.6kb插入DNA的7.5kb片段環化，使用Ligation high(Toyobo)將1kb的片段與經SacⅠ消化的pUC18載體連接。使用各個連接混合物轉化大腸桿菌JM109細胞。於37℃，在LB瓊脂平板上平鋪和培養大腸桿菌JM109細胞過夜。通過自動測序儀測定所得各個轉化子的核苷酸序列。
(3)1kb片段的核苷酸測序使用M13載體的引物M4和RV和得自該片段序列的引物SUB27(+)測定核苷酸序列，所用引物示於表6。
表6引物序列SUB27(+)；5′-ACTACCAGAACAGCATCGTCGA-3』(SEQ ID No.:16)1kb片段的核苷酸序列與第27號克隆的pYES2(-)側核苷酸序列一致。此片段中存在推定開放閱讀框(下文稱之為ORF)的一部分(441bp)。
(4)7.5kb片段的核苷酸序列使用pYES2的引物pYES2(+),pYES2(-)，得自此片段序列的引物P-2(+),P-3(+),P-4(+),SUB No.1(-),SUB No.2(-),SUB No.3(-),P-4(-)和P-3(-)對7.5kb片段的1.6kb插入DNA進行DNA測序。所用引物示於表7。
表7引物序列P-2(+)；5′-TTCATCGAGTTCTCGACCATCG-3′(SEQ ID No.:17)P-3(+)；5′-TGAACGACTCGGTCGGGTTCTG-3′(SEQ ID No.:18)P-4(+)；5′-AGACGTCGACGAGGGAGAGCTT-3′(SEQ ID No.:19)SUB No.1(-)；5′-TCACGTCCGTCCTCGTCGTCCT-3′(SEQ ID No.:20)SUB No.2(-)；5′-TGACTTCGGCACCGCGTGGCTC-3′(SEQ ID No.:21)SUB No.3(-)；5′-AAGTCGTTCCGGTGCACGTACA-3′(SEQ ID No.:22)P-4(-)；5′-CTCCCCATGACCGCAACCAGCT-3′(SEQ ID No.:23)P-3(-)；5′-CAGAACCCGACCGAGTCGTTCA-3′(SEQID No.:24)對1.6kb插入DNA的核苷酸序列分析證實該DNA含有708bp缺乏C-末端區域的左旋二酮還原酶基因。我們發現此片段的核苷酸序列含有內部肽(F27),N-末端和第一個Met的核苷酸序列。也有人提出第一個Met上遊存在SD序列。為了克隆全長ORF，使用708bp片段設計探針。
(5)使用708-kb片段為探針構建基因組文庫並篩選全長左旋二酮還原酶基因使用基因組分離試劑盒(BIO101)製備水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的染色體DNA。用SacⅠ部分消化水生棒桿菌AKU611(FERM BP6448)的染色體DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分級分離經消化的染色體DNA。將佔優勢的4kb DNA片段(500ng)與經SacⅠ-消化的pYES2載體(200ng)混合，於16℃，在體外使用Ligation high(Toyobo)連接30分鐘，使用連接混合物轉化感受態大腸桿菌DH5α細胞(Toyobo)。於37℃，在含有氨苄青黴素的LB瓊脂平板上平鋪和培養感受態的大腸桿菌DH5α細胞過夜。得到文庫(974個菌落)。使用實施例4(4)所得的708bp片段從基因組DNA文庫中篩選左旋二酮還原酶基因組基因。通過熱處理使708bp片段變性，然後根據廠商說明，使用ECL直接核酸標記和檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech)，用辣根過氧化物酶(HRP)標記變性的片段。將文庫(974個菌落)轉移至Hybond N+，即帶正電的尼龍膜(Amersham Japan)上，通過含有0.5 M NaOH的緩衝液使其變性和固定。用HRP-標記的PCR片段與膜雜交，雜交之後，洗滌膜，通過化學發光檢測系統檢測膜上的陽性克隆。從基因組文庫的974個菌落(重組子)中得到50個陽性克隆。
為了進一步選擇陽性克隆，用pYES2(+),pYES2(-),2-23(-)和第一Met(+)為引物，50個克隆中的每一個為模板進行PCR。反應混合物(20μl)含有0.5μM各種引物，10ng模板(50個克隆中的每一個)，各為312μM的dNTP,2.5U(終濃度)Ex Taq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶，和2μl EX Taq緩衝液(TakaraShuzo)。所用PCR條件是95℃,1分鐘，接著按下述將反應循環進行25次95℃,30秒，55℃,30秒和72℃,1分鐘。結果，一個陽性克隆含有約3kb插入的DNA，選擇該克隆進行測序。
使用P-3(-)和P-2-2(-)為引物對新分離的克隆進行DNA測序。引物P-2-2(-)的序列示於表8。
表8引物序列P-2-2(-)；5′-GAACTCGATGAAGCAGCTCGAC-3′(SEQ ID No.:25)對此克隆的DNA序列分析揭示出804bp左旋二酮還原酶基因區域，該區域編碼267個胺基酸的蛋白質(SEQ ID No.:1)。終止密碼子TGA存在於探針序列下遊約100bp的位置處。經DNASIS計算出左旋二酮還原酶的分子量(27.9KDa)。
將推定的胺基酸序列與其它蛋白質序列相比較，發現與少動鞘氨醇單胞菌UT26的2,5-DDOL-脫氫酶(LinC)具有高水平的同一性(37％)。
實施例5在大腸桿菌中表達左旋二酮還原酶基因並由左旋二酮產生actinol(1)構建攜有左旋二酮還原酶基因的重組DNA使用基因組分離試劑盒(BIO101)製備水生棒桿菌AKU611(FERM BP-6448)的染色體DNA。另一方面，根據表9所示的左旋二酮還原酶基因N末端胺基酸序列的上遊區域和C末端胺基酸序列的下遊區域設計和合成寡核苷酸引物。在兩個引物中構建EcoRⅠ位點以使左旋二酮還原酶基因包含在構建表達載體所用的EcoRⅠ片段中。
表9為左旋二酮還原酶基因上遊和下遊所設計的引物序列上遊5′-CACGACGAATTCGCGCGGATCCTGCGGACCTGC-3′(SEQ ID No.:26)下遊5′-CCGTGACTTAAGCAGCCATGTCCGCAGCCT-3′(SEQ ID No.:27)使用熱循環儀(PE Biosystems)擴增目的DNA片段。使用5ng包括全長左旋二酮還原酶基因的質粒DNA為模板，250nM各種引物，各為0.2mM的dATP,dCTP,dGTP和dTTP,1U(終濃度)Ex Taq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶，和2μlEX Taq緩衝液(Takara Shuzo)進行PCR反應(20μl)。於94℃將反應混合物保溫1分鐘之後，按下述將反應循環進行25次98℃,20秒，70℃,2分鐘和72℃,4分鐘。分離反應產物，用EcoRⅠ限制性酶切割。將所得EcoRⅠ片段與經EcoRⅠ消化的pUC18載體連接，所得重組DNA被稱為pUC3-6和pUC3-5。在pUC3-6中，按與pUC18的lac啟動子相反的方向插入左旋二酮還原酶基因。另一方面，在pUC3-5中，按與pUC18的lac啟動子相同的方向插入左旋二酮還原酶基因。
(2)在大腸桿菌中表達左旋二酮還原酶基因使用重組DNA pUC3-5和pUC3-6轉化大腸桿菌JM109。在3ml添加有50μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中培養所得轉化子大腸桿菌JM109/pUC3-5和大腸桿菌JM109/pUC3-6。將10μl上述培養物接種於10ml與上述相同的培養基中，37℃保溫過夜。由此培養物中取出5ml培養肉湯，離心以分離細胞。通過這些方法，製備出大腸桿菌JM109/pUC3-5和大腸桿菌JM109/pUC3-6的樣品細胞。
於30℃將反應混合物(1ml)(下述組分的濃度為終濃度)振蕩24小時，所述混合物由細胞，100mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0),0.6mg/ml NAD+(OrientalYeast),31.2單位/ml葡萄糖脫氫酶(Amano Pharmaceuticals),5％(w/v)D-葡萄糖和0.5％(w/v)左旋二酮組成。反應之後，用1ml乙酸乙酯提取反應混合物並濃縮。通過氣相層析[柱HR-20M(Shinwa Chemical Industries)0.25 mmφx30m，柱溫度160℃(恆溫)，注射器溫度250℃，載氣He(ca.1 ml/min)]分析提取物。產物的產率和光學純度簡述於表10。
表10由左旋二酮產生actinol菌株 轉變產率光學純度(％)(actinol的％e.e.)大腸桿菌JM109/pUC3-567.6 34.5大腸桿菌JM109/pUC3-622.7 85另外，使用添加有水解酪蛋白胺基酸的M9培養基製備大腸桿菌JM109/pUC3-5和大腸桿菌JM109/pUC3-6細胞，在相同條件下使用這些細胞進行上述反應，結果示於表11。
表11由左旋二酮產生actinol菌株 轉變產率光學純度(％)(actinol的％e.e.)大腸桿菌JM109/pUC3-5 28 88.1大腸桿菌JM109/pUC3-6 31.787.6
序列表110Wada,Masaru120左旋二酮還原酶基因及其用途130左旋二酮還原酶1401411602170PatentIn Ver.2.12101211267212PRT213水生棒桿菌4001Met Thr Ala Thr Ser Ser Pro Thr Thr Arg Phe Thr Asp Arg Val Val1 510 15Leu Ile Thr Gly Gly Gly Ser Gly Leu Gly Arg Ala Thr Ala Val Arg20 25 30Leu Ala Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ser Leu Val Asp Val Ser Ser Glu35 40 45Gly Leu Glu Ala Ser Lys Ala Ala Val Leu Glu Thr Ala Pro Asp Ala50 55 60Glu Val Leu Thr Thr Val Ala Asp Val Ser Asp Glu Ala Gln Val Glu65 70 75 80Ala Tyr Val Thr Ala Thr Thr Glu Arg Phe Gly Arg Ile Asp Gly Phe85 90 95Phe Asn Asn Ala Gly Ile Glu Gly Lys Gln Asn Pro Thr Glu Ser Phe100 105 110Thr Ala Ala Glu Phe Asp Lys Val Val Ser Ile Asn Leu Arg Gly Val115 120 125Phe Leu Gly Leu Glu Lys Val Leu Lys Ile Met Arg Glu Gln Gly Ser130135 140Gly Met Val Val Asn Thr Ala Ser Val Gly Gly Ile Arg Gly Ile Gly145150 155160Asn Gln Ser Gly Tyr Ala Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly Leu Thr165 170 175Arg Asn Ser Ala Val Glu Tyr Gly Arg Tyr Gly Ile Arg Ile Asn Ala180 185190Ile Ala Pro Gly Ala Ile Trp Thr Pro Met Val Glu Asn Ser Met Lys195200205Gln Leu Asp Pro Glu Asn Pro Arg Lys Ala Ala Glu Glu Phe Ile Gln210215 220Val Asn Pro Ser Lys Arg Tyr Gly Glu Ala Pro Glu Ile Ala Ala Val225230235240Val Ala Phe Leu Leu Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Val Asn Ala Thr Val245250255Val Pro Ile Asp Gly Gly Gln Ser Ala Ala Tyr2602652102211804212DNA213水生棒桿菌4002atgaccgcaa ccagctcccc cacgacccgc ttcaccgacc gcgtcgtgct catcaccggc 60ggcggctccg gcctcggccg tgcgaccgcc gtccgtctcg ccgccgaggg cgcgaagctc 120tccctcgtcg acgtctcctc cgagggactc gaggcctcga aggccgccgt gctcgagacc 180gcccccgacg ccgaggtcct caccaccgtc gccgacgtct cggacgaggc ccaggtcgag 240gcctacgtca ccgccaccac cgagcgcttc ggccgcatcg acggcttctt caacaacgcc 300ggcatcgagg gcaagcagaa cccgaccgag tcgttcaccg ccgccgagtt cgacaaggtc 360gtctcgatca acctgcgcgg cgtgttcctc ggcctcgaga aggtcctgaa gatcatgcgc 420gagcagggct ccggcatggt cgtcaacacg gcgagcgtcg gcggcatccg cggcatcggc 480aaccagtccg gctacgccgc cgccaagcac ggggtcgtcg gtctcacccg caactccgcc 540gtcgagtacg gccgctacgg catccgcatc aacgccatcg cccccggcgc catctggacg 600ccgatggtcg agaactcgat gaagcagctc gacccggaga acccccgcaa ggccgccgag 660gagttcatcc aggtcaaccc ctccaagcgc tacggcgagg cgcccgagat cgccgcggtc 720gtcgccttcc tgctgtccga cgacgcctcg tacgtcaacg ccacggtcgt cccgatcgac 780ggcgggcagt ccgccgcgta ctga80權利要求
1．分離的DNA，其含有編碼具有左旋二酮還原酶活性之酶的核苷酸序列。
2．根據權利要求1的分離的DNA，其含有編碼具有左旋二酮還原酶活性之酶的核苷酸序列，所述酶具有下列物理-化學特性1)所述左旋二酮還原酶催化左旋二酮區域-和立體選擇性地還原為actinol；2)酶的相對分子量據估計為142,000-155,000±10,000Da，由4個分子量為36,000±5,000Da的均一亞單位組成；3)pH7.0時的最適溫度是15-20℃，最適pH為7.5；4)酶需要NAD+或NADH為輔因子，並能被單價陽離子，如K+,Na+,Cs+,Rb+和NH4+高度激活。
3．根據權利要求1和2的分離的DNA，其特徵在於1)所述核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的所述酶，或2)所述核苷酸序列編碼所述酶的變體，所述變體選自(ⅰ)等位基因變體或(ⅱ)具有一個或多個胺基酸添加，插入，缺失和/或取代但仍具有相同類型的酶活性的酶。
4．根據權利要求1和2的分離的DNA，其特徵在於所述核苷酸序列是1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；2)一種核苷酸序列，因遺傳密碼的簡併性，其所編碼的左旋二酮還原酶具有與核苷酸序列(ⅰ)所編碼的酶相同的胺基酸序列；和3)一種核苷酸序列，其在標準雜交條件下能與(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列的互補序列雜交。
5．載體或質粒，其含有權利要求1至4中任一項所述的DNA。
6．宿主細胞，其被權利要求1至4中任一項所述的DNA或權利要求5所述的載體或質粒轉化或轉染。
7．多肽，其由權利要求1至4中任一項所述的DNA所編碼。
8．生產權利要求1至4中任一項所述的多肽的方法，所述方法包括在有助於生產所述酶的條件下培養權利要求6所述的轉化宿主細胞。
9．生產actinol的方法，所述方法包括使左旋二酮與權利要求7所述的多肽接觸。
全文摘要
本發明涉及用於製備actinol的基因材料，例如含有編碼具有左旋二酮還原酶活性之酶的核苷酸序列的分離的DNA，由這類DNA編碼的多肽，重組生物體等。這些新的基因材料可得自棒桿菌屬，纖維單胞菌屬，動性球菌屬和節桿菌屬等。本發明還提供了生產actinol的方法。
文檔編號C12P7/26GK1316517SQ0110334
公開日2001年10月10日 申請日期2001年2月1日 優先權日2000年2月1日
發明者清水坂由, 和田克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司