一種寡核苷酸探針的設計方法及其應用的製作方法

2023-05-27 07:47:36

專利名稱：一種寡核苷酸探針的設計方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種寡核苷酸探針的設計方法，利用該方法設計的寡核苷酸探針可有 效區分單核苷酸多態性。本發明的寡核苷酸探針的設計方法可應用於包括基因晶片的製備 在內的所有探針設計的領域。
背景技術：
單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種，佔所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500 1000個 鹼基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。預計今後SNP將在下列領域發揮重要作用(1)進行簡單和複雜疾病的遺傳連 鎖分析(linkage analysis)及關聯分析(association analysis) ； (2)在「藥物基因組 學」(pharmacogenomics)研究中，可通過檢測SNP的遺傳多態性標記揭示人群中不同個體 對不同藥物的敏感性差異的根本原因。⑶也可用於法醫研究的罪犯身份的鑑別、親子鑑定 等，此外在器官移植中供體和受體間的配對選擇及物種進化的研究中都將具有重要意義。通過設計特異性的探針檢測SNP能夠達到比較高的靈敏度和特異性，但是單核苷 酸突變對探針設計要求極高，怎樣快速有效的設計能正確區分單核苷酸突變的探針，一直 是學術界和企業研究者點關注的問題。Loakes D等人(Loakes D，et al. NucleicAcids Res. 1994,22(20) :4039-43)提出 5-Nitroindole 作為鹼基類似物，隨後 David Loakes 等人(David Loakes, et al. Nucleic Acids Res. 1995，23 (13) :2361-6)進一步提出用 3-Nitropyrrole和5_nitroindole作為測序和PCR類似物，在此基礎上Guo Z等人報導 (Guo Z，et al. NatBiotechnol. 1997,15(4) :331-5)的研究結果是一個裡程碑式的成就， 要點有如下幾個(1)單核苷酸是最難區分的，而兩個或兩個以上的核苷酸則能夠有效的 區分；( 單核苷酸突變檢測存在位置依賴性，具體的說，突變位置在探針中間區分能力最 強，而越往探針兩端區分能力越低；C3)在探針序列中設置鹼基類似物形成人工錯配，可 以有效的提高單核苷酸區分能力。隨後，有多篇更進一步的研究報導。通過構建的模型 (Pozhitkov AE, et al. BMC Bioinform 2002 ；3 9 ；Held GA, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2003 ； 100 :7575-80)來選擇設計探針的合理性得到廣泛的關注，然而，其它的研究者 卻發現，理論的模擬與實驗結果仍存在大的差異(Naef F,et al. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys,2003 ；68 :011906 ；Mei R et al. Proc Natl Acad SciUSA,2003 ； 100 11237-42)，也就是說，探針設計仍然神秘，理論研究還沒有達到實際應用的深度。即便如 此，Held GA 等人(Held GA, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2003 ； 100 :7575-80)還是認 為探針設計需要遵循一定的原則，模式仍然是有效的，而探針突變位點處於探針中間位置 是必須遵循的。3-Nitropyrrole和5-nitroindole作為鹼基類似物在一些實驗中並沒有被 證實廣泛的有效'性，因此，BurgnerD 等人(Burgner D, et al. Nucleotides Nucleic
3Acids. 2004,23(5) =755-65)提出另一個解決的途徑，具體的說，在探針中直接添加鹼基類 似物以期達到能夠通常於所有SNPs探針設計的方法。此後，關於探針設計及理論的研究仍 不斷的出現在各種研究性期刊及專利資料庫，從一個側面證實Burgner D等人的方法並沒 有取得一個通用的效果。2007年DF Qualley 博士的一個報導(http ://66. 102. 1. 104/ scholar ？ q = cache :rGEh8ixkw60J :scholargoogle. com/+ % 22Synthesis+and+Surve y+of+Non-natural+Bases+in+Nucleic+Acids+% 22&hl = en)提出，將鹼基的氫鍵形成部 位封閉，使該類似物不能與靶基因的任何鹼基形成結合，這樣就在探針與靶基因間形成一 個結合空洞從而與突變基因配合，相當於雙鹼基突變。這一方法的一個不足之處在於封 閉鹼基需要特殊的反應增加了合成成本，而且在商業合成公司並不能完成相應的服務，因 此尚無法進行有效的推廣。最近的另一篇報導(Hwang GT, Nucleic Acids Res. 2009Jun 10. [Epub ahead ofprint])則提供了另一個解決的思路對鹼基的芳香環進行不同部位的 修飾及多個部分的修飾，最終發現摻入d34DMPy作為人工突變能夠達到最佳的效果，然而 這一結論與DF Qualley博士的方法面臨同樣的問題，即僅能在實驗室實現而無法進入商業 應用階段。基因晶片是九十年代發展起來的一項前沿生物技術。它融合了生命科學、化學、微 電子技術、計算機科學、統計學和生命信息學等多種學科的最新技術。基因晶片又稱寡核苷 酸晶片或DNA晶片，通過把大量的DNA片斷以可尋址的方式，高密度地固定到尼龍膜，玻璃 片和矽片等載體上，利用核酸鹼基之間的配對，用來進行樣品DNA高通量、並行的分析信息 的工具。基因晶片的最大優勢是高通量、並行分析。而正是這一優點，也成為基因晶片最大 的弱點，除了要區分單核苷酸突變外，大量的探針還要在同一條件下並行檢測，這對探針設 計就提出了更高的要求。例如S Choi等人(S Choi，et al. US PatentApp. 11/335, 229)公 開了一種障礙DNA及人工錯配探針(hurdle DNA and artificially mismatched probe)的 方法，該方法需要兩條探針來實現一個位點的檢測，由於通常只是一條探針即可檢測一個 位點，這樣探針的數量必須增加一倍，無疑對探針的點樣和高密度晶片的製備增添了很大 的困難，儘可能實現一條探針就有效的檢測一個位點，這仍然是實際應用過程的考慮因素。至此，探針設計似乎進入到一個永遠止境的人工改造及尋找一種萬能方法的迷 途。本發明正是基於這樣一個技術瓶頸，提出一種新的探針設計方法，可以較快的設計出有 效區分單核苷酸突變的探針。

發明內容
本發明的目的是提供一種寡核苷酸探針的設計方法，利用該方法設計的寡核苷酸 探針可有效區分單核苷酸多態性。單核苷酸突變的區分效果取決於探針在同源性序列中的區分能力，這也直接決定 了基因晶片(微陣列)實驗結果的準確性。從最初的Southern Blot探針到Microarray 探針，幾十年間大量的研究者對探針的設計方法進行了大量的理論研究和實驗證實，通 常認為有較高區分能力的探針具備以下特徵(1)探針自身沒有髮夾結構；( 探針突變 位點設計在探針的中部；C3)GC含量在40-60% ;(4)探針與探針之間沒有嚴重的互補配 對，以此為基本理論，衍生出了多種預測模型，其中，被廣泛認同的是鄰位雜交預測模型 (nearestneighbor hybridization potential)，通常認為，探針的雜交溫度比鄰位雜交預測溫度低3-25°C，有多個以此為模型的探針設計軟體，如:melting(Le Novere,2001)或 mfold(Zuke r，2003)，由於探針的區分能力低，理論預測不準確仍是主要的瓶頸。因此，探 針的設計方法通常是低於理論預測值5-20°C設計多條探針，然後通過實驗進行篩選。最近 (Xu Q, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2009,106(7) :2289-94.)就報導了通過基因晶片 設計探針矩陣從而篩選探針的研究結果。本發明所提供的探針的設計方法如下1)根據待檢測靶基因的特異性核酸序列合成探針。要求探針覆蓋待檢測的鹼基， 長度為14 30個鹼基，探針序列可以是靶基因序列的正義鏈或其反向互補序列；2)探針序列在模板內應當沒有較高相似性，否則容易導致錯配。探針序列避免出 現3個以上的連續的鹼基。3)探針序列的GC含量一般為40 60%，過高或過低都不利於特異性檢測。4)探針序列內避免形成3個以上的髮夾結構。5)單鹼基突變的探針，突變位點儘可能的處於探針中間，至少處於探針的倒數第 二個鹼基以內。6)優選的位置為探針的倒數第二個至第四個鹼基進行人工增加或減少，而突變的 鹼基處於探針的另一端，但不處於末端，通常位置為第三到鹼基數中間。7)本發明所提供的探針設計方法，優選的探針長度為14 30bp。依據本發明提供的方法所設計的探針具有較強的區分能力，從而大大減少了探針 的篩選工作量。本發明的探針設計方法，一個優選的實施方案是其中探針人工增加鹼基，包括以 下步驟(1)根據增加鹼基的兩側，若為T (A) *T (A)，則添加的鹼基(*)為G或C ；(2)根據增加鹼基的兩側，若為G(C)*G(C)，則添加的鹼基(*)為A或T;(3)根據增加鹼基的兩側，若為T㈧*G(C)，則添加的鹼基(*)為T或A;(4)根據增加鹼基的兩側，若為G(C)*T(A)，則添加的鹼基(*)為T或A。本發明的探針設計方法，一個優選的實施方案是其中探針人工減少鹼基，包括以 下步驟(1)根據減少鹼基的兩側，若為T (A) *T (A)，則減少的鹼基(*)為G或C ；(2)根據減少鹼基的兩側，若為G(C)*G(C)，則減少的鹼基(*)為A或T;(3)根據減少鹼基的兩側，若為T(A)*G(C)，則減少的鹼基(*)為T或A;(4)根據減少鹼基的兩側，若為G(C)*T(A)，則減少的鹼基(*)為T或A。本發明的探針設計方法的應用領域非常廣泛，凡是用到探針設計的領域均可適 用，其中包括基於尼龍膜的基因晶片和基於玻片的基因晶片，但不僅局限於基因晶片領域 的應用。本發明與Burgner D等人的方法最大的創新之處在於沒有使用鹼基類似物，而是 使用A/T/G/C，而且鹼基選擇性的使用能夠使區分效果達到最佳；同時利用人工增加或者 減少鹼基，無需特殊的試劑，能夠與普通的探針相同的程序合成，因而不需要增加額外的成 本。利用本方法設計的探針與傳統的探針相比，靈敏度上無明顯差異，而特異性優於傳統探 針。基於以上原因，本發明的方法能夠在實際應用中得以推廣。本發明提出的缺失鹼基的方法在已公開的資料中尚未見相關報導。


圖1本發明的探針和傳統探針檢測MDRI基因C-4T和A61G位點結果對比。其中 A為C-4T正常，A61G正常；B為C-4T純合子突變，A61G正常；C為C-4T正常，A61G純合子突變。圖2本發明的探針和傳統探針檢測β地中海貧血⑶沈和⑶43位點結果對比。其 中1為⑶沈正常，⑶43正常；2為⑶沈純合子突變，⑶43正常；3為⑶沈正常，⑶43純合
子突變。
具體實施例方式本發明實施方式的描述，旨在通過舉例說明更好地理解本發明的本質，而不是限 制本發明。實施例1檢測MDRI基因SNPs的基因晶片的探針設計多藥耐藥基因(multi-drug resistance gene，MDRI)位於人第 7 號染色體 q21. 1， 以C-4T為例說明探針的設計方法。下面為MDRIC-4T位點的序列(LOCUS :AY910577)1 CTCTGGCTTC GACGGGGGAC TAGAGGTTAG TCTCACCTCC AGCGCGCCTG AGGCTCATGC61 ATTTGGCTAA TGAGCTGCGG TTTCTCTTCA GGT ^GGGATG GATCTTGAAG GGGACCGCAA121 TGGAGGAGCA AAGAAGAAGA ACTTTTTTAA ACTGAACAAT AAAAGGTAAC TAGCTTGTTT181 CATTTTCATA GTTTACATAG TTGCGAGATT TGAGTAATTT ATTTCTAGCC TCCAGCTCTG241 AAATAAATGA CATGTTGTTG TTTTTAATTA TTTTTAAGAA ACGCAAGCTA GCCTTTGGAA301 TCAATATCCC TGCTTAGAGC AGAAGTTTGT TGGCTGAGTG GAGCACAGCA TATGCATTTT在上述的序列中，g為發生突變的位點，即野生型(Normal)為C，突變型 (Mutation)為Τ。探針設計時突變位點與人工插入位點分布於探針的兩端，最佳的位點同 時考慮探針設計的一般原則，包括退火溫度(Tm)、GC%含量、鹼基數量及探針的二級結 構，使用本發明的方法，設計的野生型探針序列為5』-AGGTCGGGATGGATAC-3』 (SEQ IDNO 2)、 5『-AGGTCGGGATGGATCT-3『 (SEQ IDNO 3)；突變型探針序列為 5，_AGGTTGGGATGGAGTC_3，(SEQ ID NO 5)、5，-AGGTTGGGATGGATCT3，(SEQ IDNO :6)。A61G位點的探針設計方法可參照 C-4T。實施例2玻片載體的基因晶片檢測MDRI基因C_4T和A61G位點利用實施例1設計的探針製備玻片載體的基因晶片檢測MDRI基因SNPs，並與文獻 報導的探針製備的基因晶片進行對比。多藥耐藥基因(multi-drug resistance gene，MDRI)位於人第 7 號染色體 q21. 1， 它的蛋白產物P-GP是ABC運輸系統的重要一員，屬於ABCBl家族。MDRI基因表達水平可作 為預測化療效果的一個參考指標，通過檢測MDRI基因多態性來預測腫瘤患者的化療療效 成為一種可行的臨床檢測手段。使用的PCR引物序列分別為IF :5，TTGGCTAATGAGCTGCGGTTTCTC 3，(SEQ ID NO 25)；IR :5，cy3-GATTCCAAAGGCAGCTTGCGTTTC 3，(SEQ ID NO :26)。上述序列的擴增片段為MObp，檢測外顯子2的兩個SNPs位點C_4T、A61G。本發明與文獻報導探針的一個區別在於使用人工錯配探針，從而進一步提高探針的區分單核苷酸能力。使用的探針如下表所示
檢測位點文獻報導探針序列 (林莉,等.生物技術通訊,2006,17(3): 332-4)本發明方法設計探針序列
權利要求
1.一種寡核苷酸探針的設計方法，其特徵在於該設計方法包括1)要求探針覆蓋待檢測的鹼基，長度為14 30個鹼基，探針序列為靶基因序列的正義 鏈或其反向互補序列；2)探針序列在模板內沒有較高相似性，探針序列避免出現3個以上的連續的鹼基；3)探針序列的GC含量為40 60%；4)探針序列內避免形成3個及以上的鹼基形成的髮夾結構；5)單鹼基突變的探針，突變位點儘可能的處於探針中間，至少處於探針的倒數第二個 鹼基以內；6)在探針的倒數第二個至第四個鹼基進行人工增加或減少，而突變的鹼基處於探針的 另一端，但不處於末端，通常位置為第三到鹼基數中間。
2.根據權利要求1的寡核苷酸探針的設計方法，其特徵還在於其中探針人工增加鹼 基，包括以下步驟1)根據增加鹼基的兩側，若為T(A) *T (A)，則添加的鹼基(*)為G或C ；2)根據增加鹼基的兩側，若為G(C)*G(C)，則添加的鹼基(*)為A或T;3)根據增加鹼基的兩側，若為T㈧*G(C)，則添加的鹼基⑷為T或A；4)根據增加鹼基的兩側，若為G(C)*T(A)，則添加的鹼基(*)為T或A。
3.根據權利要求1的寡核苷酸探針的設計方法，其特徵還在於其中探針人工減少鹼 基，包括以下步驟1)根據減少鹼基的兩側，若為τ(A) *T (A)，則減少的鹼基(*)為G或C ；2)根據減少鹼基的兩側，若為G(C)*G(C)，則減少的鹼基(*)為A或T;3)根據減少鹼基的兩側，若為T(A)*G(C)，則減少的鹼基(*)為T或A；4)根據減少鹼基的兩側，若為G(C)*T(A)，則減少的鹼基(*)為T或A。
全文摘要
本發明涉及一種寡核苷酸探針的設計方法，利用該方法設計的寡核苷酸探針可有效區分單核苷酸多態性。本發明的寡核苷酸探針的設計方法可應用於包括基因晶片的製備在內的所有探針設計的領域。本方法沒有使用鹼基類似物，而是使用A/T/G/C，同時採取了人工添加或者減少鹼基的方式。從檢測效果來看，利用本發明方法設計的探針在特異性方面要優於傳統探針，而靈敏度上兩者無明顯差異。
文檔編號C12N15/10GK102102122SQ20091021407
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者張帆, 林炳生, 程鋼, 陳華雲 申請人:中山大學達安基因股份有限公司