用於防治糖尿病的動物胰腺提取物的製作方法

2023-05-27 07:43:46 1

專利名稱：：用於防治糖尿病的動物胰腺提取物的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種動物胰腺提取物，以及該動物胰腺提取物的藥物用途。
背景技術：
：糖尿病是以血葡萄糖水平增高為特徵的代謝性疾病群。糖尿病以其危害大、難治癒、費用高等特點，已經成為影響國人身心健康的重大疾病。糖尿病的誘發因素包括遺傳、病毒感染、自身免疫、器官移植、飲食因素、不良情緒等。糖尿病的發病率越來越高，目前全球糖尿病患者已達1.8億左右，專家預測到2025年將超過3億，其中75%在印度、中國等發展中國家。據統計，世界上糖尿病發病率為3%至5%，50歲以上的人均發病率為10%。其中絕大部分是II型糖尿病者。在全球範圍內，每10秒就有一個人死於糖尿病，同時在這10秒內又有2個人罹患糖尿病。全球每30秒就有一人因糖尿病而截肢。每年患糖尿病的人數增加700萬，而且多數集中在亞洲。在發達國家，糖尿病是成年人失明和視力障礙的主要原因。每年死於糖尿病的人數遠遠高於死於愛滋病的人數。在發展中國家，35-64歲的年齡段中，每10個人至少有一人死於糖尿病。據世界衛生組織預測，到2025年全世界糖尿病患者將達到3億人，其中2.3億人在發展中國家。我國已成為糖尿病大國，全國糖尿病患者總數達4000萬，居世界第二，僅次於印度，發病率約為5%;我國成人糖尿病發病率已超過11%。並以每年100萬的速度遞增。其中，I型糖尿病患者佔10%，II型糖尿病患者佔90%。與20世紀80年代的0.7%相比，增長了5倍。現在，我國每天有3000個新發的糖尿病患者(每28秒一個)，糖尿病花費188億人民幣。報導指出，一個國家的人均GDP達到700至1700美元時，正是糖尿病的高發期，中國目前正處於這一階段。我國在2004年國家中長期科技發展戰略中，已將糖尿病列為"需要重點防治的專項重大疾病"。廣東的糖尿病患病人數亦已超過300萬。2008的調查數據顯示，廣州市糖尿病患病率為6.13%，高於全省3.5%和全國2.9%的平均水平。廣東省衛生廳疾控處提供的數據顯示，以目前廣州1千多萬人口計算，糖尿病準患者數量至少在90萬人左右。對於糖尿病的防治，應該預防與治療相結合。控制和減少患病率，減少其死亡率和致殘率為重點。治療糖尿病藥物可以通過不同方式如促進葡萄糖利用、保護胰島P細胞、促進胰島素穩定分泌和抑制a-糖苷酶活性等來達到防治糖尿病的目的。其中部分藥物是從多方面、多靶點綜合產生藥效。目前，糖尿病的藥物治療主要有(l)胰島素，一直是糖尿病治療的主要藥物，可以直接調節人體的血糖水平；(2)磺脲類，主要通過剌激胰島素分泌而發揮作用；(3)雙胍類，抑制糖原異生及糖原分解，增加外周組織對葡萄糖的攝取和利用；糖苷酶抑制劑，通過抑制小腸黏膜上皮細胞表面的糖苷酶，延緩碳水化合物的吸收；(4)噻唑烷二酮，胰島素增敏劑，通過增加外周組織對胰島素的敏感性、改善胰島素抵抗而降低血糖；(5)甲基甲胺苯甲酸衍生物，是近年開發的非磺脲類胰島素促分泌劑。3近幾年的研究顯示，無論是I型還是II型糖尿病患者，都存在不同程度的胰腺13細胞功能損傷。但是，目前仍然缺乏保護胰腺P細胞、促進|3細胞再生修復、延緩或者逆轉糖尿病重症化而且毒副作用小的藥物。而動物胰腺，是一個調控機體糖代謝功能和產生大量活性生物分子的寶庫。本項目研製的乳豬胰腺小分子活性多肽，為目前社會上龐大的糖尿病病人群體提供一個有效的防治手段。
發明內容本發明的目的在於提供一種胰腺提取物，適用於各型糖尿病的預防和治療。本發明所述的一種用於防治糖尿病的動物胰腺提取物，是從幼齡小豬的新鮮胰臟中提取的分子量不超過10000道爾頓的小分子量活性物質溶液，提取液為澄清液體，pH值為6.0-7.O，每1ml提取液中含多肽不少於15mg，不含胰島素。本發明的另一目的是提供所述的動物胰腺提取物的提取方法。本發明所述的動物胰腺提取物的提取方法，包括以下步驟A.初處理對每個小豬胰腺外觀、性狀目檢，不合格者棄去。將合格的小豬胰腺去除脂肪組織後，以純水洗淨至無血水，切碎；B.勻漿將切碎的小豬胰腺用注射用水清洗一次，瀝去水份，稱重，用膠體磨勻漿，將勻漿液和注射用水在25t:以下按質量比為l:1.l加入高剪切勻漿機中循環5分鐘，收集勻漿液，置-10°C以下保存；C.粗濾將凍存至少7天的勻漿液取出，流水解凍後，放入水浴中攪拌加熱至80-85t:，放入300目濾布自然過濾，收集濾液，置於l(TC以下冰水中攪拌冷卻，同時滴加鹼液調節pH值至6.5±0.5°C，得粗濾液；D.精濾將粗濾液過分子量為10000道爾頓的超濾膜，收集超濾液，置於-l(TC以下保存；E.濃縮將凍存不少於IO天的超濾液用自來水解凍，底部殘渣用300目濾紙過濾，濾液與上清液合併，然後用分子量10000道爾頓的中空纖維柱進行反滲透濃縮；F.分裝將濃縮液過分子量為10000道爾頓的中空纖維柱，再過0.22iim的微濾膜除菌，然後分裝，得本發明所述的胰腺提取物，置-l(TC以下保存。本發明的又一目的是提供所述的胰腺提取物用於製備預防與治療糖尿病的藥物的用途。本發明所述的動物胰腺提取物，是以糖尿病發生的源頭器官胰腺為靶點，選擇動物胰腺為原料，通過現代工藝提取得到的小分子活性多肽類物質。經實驗證明，能夠從分子水平保護和修復受損的胰腺P細胞，可以營養和促進胰腺13細胞的穩定和再生，維持胰島素的穩定分泌，達到降糖的作用，從而適用於各型糖尿病的預防和治療，尤其包括治療重症糖尿病、防止輕型糖尿病的重症化、預防器官移植後糖尿病、減少抗排斥藥物不良反應等，以及適用於逆轉或延遲重症糖尿病的發生和發展，防止糖尿病的各種併發症。圖1是本發明所述的胰腺提取物對於糖尿病模型大鼠的實驗中顯示實驗起點和終點大鼠體重變化的比較圖表；圖中，並列的兩柱中，左柱代表每一組的起點體重百分數，右柱代表每一組的終點體重百分數。"-l"代表注射STZ造模前一天，"144"代表注射STZ造模後的觀察天數，"129"代表開始給藥治療後的觀察天數；圖中，PE為胰腺提取物；pHGF為促肝細胞生長素。圖2是本發明所述的胰腺提取物對於糖尿病模型大鼠的實驗中顯示單位面積胰島總數的比較圖表；圖中，PE為胰腺提取物；pHGF為促肝細胞生長素。具體實施例方式實施例一小豬胰腺小分子多肽的提取和鑑定1.原材料動物雜種豬，豬齡在20周左右，合法屠宰廠宰殺，具有動物產品檢疫合格證明。原材料的採集和運輸均在低溫20-25t:條件下處理完成。2.胰腺質量控制2.1重量完整的小豬胰腺(帶少量脂肪組織)，平均重量為120±30克。2.2外觀、性狀胰腺表面光潔，色澤新鮮，灰白色，無異味，無包裹結節，剖面無異常。2.3揮發性鹽基氮測定按1%比例隨機抽取豬胰腺，每個胰腺切取10g，按國家標準GB/TS009.44-2003微量擴散法檢查揮發性鹽基氮的方法進行限量檢測，應符合國家標準GB16869-2005，確保小豬胰腺的新鮮程度。3.胰腺小分子多肽的提取3.1小豬胰腺初處理對每個小豬胰腺外觀、性狀目檢，不合格者棄去；逐個稱重，超重者棄去。將合格的小豬胰腺去除脂肪組織後，以純水洗淨至無血水，切碎。3.2勻漿將切碎的小豬胰腺用注射用水清洗一次，瀝去水份，稱重，用膠體磨勻漿，將勻漿液和注射用水在25t:以下按質量比為l:1.l加入高剪切勻漿機中循環5分鐘，收集勻漿液，置-10°C以下保存。3.3加熱、粗濾將凍存至少7天的勻漿液取出，流水解凍後，放入水浴中攪拌加熱至80-85t:，放入300目濾布自然過濾，收集濾液，置於l(TC以下冰水中攪拌冷卻，同時滴加鹼液調節pH值至6.5±0.5°C，得粗濾液。3.4精濾將粗濾液過分子量為10000道爾頓的超濾膜，收集超濾液，置於-l(TC以下保存。3.5濃縮將凍存不少於10天的超濾液用自來水解凍，底部殘渣用300目濾紙過濾，濾液與上清液合併，然後用分子量10000道爾頓的中空纖維柱進行反滲透濃縮。3.6分裝將濃縮液過分子量為10000道爾頓的中空纖維柱，再過0.22ym的微濾膜除菌，然後分裝，得本發明所述的胰腺提取物，置-l(TC以下保存。實施例二本發明所述的動物胰腺提取物對於糖尿病動物模型的影響1.大鼠糖尿病造模材料Wistar大鼠，雄性，200±10g，購買自南方醫科大學實驗動物中心試劑和器材鏈脲佐菌素(STZ，Sunland公司，美國)；微量血糖測定儀(5D-2型，北京怡成生物電子技術有限公司)；動物稱重電子天平(G&G，美國)。方法收到符合條件Wistar大鼠，適應性飼養一周後，禁食過夜，空腹腹腔注射STZ(30mg/kg)造模(方法參考文獻李才主編，人類疾病動物模型的複製，人民衛生出版社，2008年第一版；糖尿病動物模型，p345.)。注射STZ—周后，檢測隨機血糖，超過16.7mmol/L者選定為糖尿病大鼠。未實施幹預的糖尿病大鼠，造模後三個月零七天觀察到大鼠出現腹部潰瘍和眼球白內障。2.實驗大鼠分組tableseeoriginaldocumentpage6注第二組至第四組是注射STZ造模的糖尿病大鼠。PE為胰腺提取物；pHGF為促肝細胞生長素，它是一個源於肝臟的提取藥物，本實驗中作為陰性對照。3.給藥方案第三組，PE低劑量組；PE給藥劑量為30mg/mLX0.5mL=15mg/只；第四組，PE高劑量組；PE給藥劑量為30mg/mLX2mL=60mg/只。第五組，pHGF組；pHGF的給藥劑量為2mg/mLXlmL=2mg/只。第一期為1個月，每天給藥一次；第二期為3個月，隔天給藥一次。造模51天後，開始出現死亡；接下來的近一個月，全部十隻共死亡8隻；死亡率80%;集中在兩個時間段死亡。其中一組4/5集中在9天內陸續死亡；另一組4/5集中在3天內死亡。4.結果分析4.i實驗大鼠空腹血糖與隨機血糖濃度比較測定時間2009年4月21日，測定實驗大鼠禁食空腹血糖；2009年4月22日，測定實驗大鼠餐後隨機血糖；血糖測定方法1.禁食方法前一天下午5:30開始，撤除實驗大鼠飼料，禁食不禁水；2.當天上午8:30開始測定實驗大鼠空腹血糖；3.血糖測定1).按照怡成公司提供的說明書使用血糖測定儀；62).鼠尾取血方法採用手術剪刀橫切鼠尾末端，然後推壓鼠尾至出現血滴；3).用怡成血糖測定儀測定每隻大鼠的鼠尾末梢血的血糖濃度。4.完成血糖測定後，立即恢復實驗大鼠餵食。結果見下表表一實驗大鼠空腹血糖與隨機血糖濃度比較tableseeoriginaldocumentpage7注pHGF為促肝細胞生長素上述實驗，相當於兩點法的糖耐量試驗。從上表的實驗數據可以看出，陰性對照藥物pHGF和糖尿病模型組的糖代謝能力很差，即使經過過夜的禁食，也不能顯著降低血糖水平，因此，這兩組實驗大鼠始終處於一種高血糖狀態；而PE治療組大鼠，通過PE的治療，在一定程度上恢復了胰島的功能，因此，能夠將進食後空腹血糖降低到接近正常水平。上表數據結論通過與正常組，模型對照組和陰性藥物的實驗比較，可以看出，PE有明顯改善糖尿病大鼠的糖代謝能力，說明在一定程度上恢復了胰腺胰島的功能。4.2實驗大鼠的體重變化測定時間2008年11月27日進行糖尿病造模前全部實驗大鼠體重測定；2009年04月21日全部實驗大鼠體重測定，結束本期實驗測定方法用電子天平(lOOOg:0.lg，美國雙傑牌)逐一稱重每隻實驗大鼠，並按照大鼠編號，記錄體重數值。測定本期實驗起點與實驗終點這兩個時間點的體重，進行比較。計算方法體重％=實驗組大鼠平均體重/正常組平均體重X100%實驗結果見圖一。由於造模的糖尿病大鼠具有類似於臨床病人典型的"三多一少"症狀，即吃得多、飲得多、拉得多、體重減少，因此體重是糖尿病大鼠的一個非常敏感的檢測指標。由上圖可以看出，糖尿病模型組和pHGF陰性對照組，由於糖尿病症狀最嚴重，體重減輕最多；與此相比，PE治療組，由於PE的明確療效，減輕了治療組大鼠的糖尿病症狀，因此，體重逐漸恢復，向正常組靠近。結論PE有明顯減輕糖尿病大鼠臨床症狀，恢復體重的效果。4.3單位面積胰島總數變化測定時間給藥治療藥物129天後。測定方法1.給藥結束對存活大鼠行頸椎脫臼法處死，處死後進行大體解剖，取胰腺進行病理學檢查。2.取材及處理。將所取全部臟器放入10%中性福馬林液中，固定48h後，取材作常規石蠟包埋切片。切片厚度3-4y，H.E染色。3.用OLYMPUSBX41型光學顯微鏡觀察組織病理學變化並進行攝影。用Image-ProE鄧ressC圖像分析系統進行胰島細胞數目定量指標分析。4.胰島細胞數目每張切片計算五個視野中胰島細胞的總和。檢測結果從圖2可以看出，糖尿病模型組和pHGF陰性對照組的單位面積胰島總數計數，都不超過100個；正常對照組超過180個；PE藥物治療組超過140個。因此，從這些監測數據可以看出，PE明確由促胰島再生作用。結論通過直接觀察和計數實驗大鼠胰腺單位面積裡的胰島總數，可以明確推斷PE有促進胰島細胞再生的作用。4.4糖尿病大鼠腎臟的主要病理性改變測定時間給藥治療藥物129天後。測定方法給藥結束對存活大鼠行頸椎脫臼法處死，處死後進行大體解剖，取腎臟進行病理學檢查。將所取全部臟器放入10%中性福馬林液中，固定48h後，取材作常規石蠟包埋切片。切片厚度3-4ii，H.E染色，用OLYMPUSBX41型光學顯微鏡觀察組織病理學變化並進行攝影。結果見表二。表二糖尿病大鼠腎臟的主要病理性改變統計表(百分比)tableseeoriginaldocumentpage8注組織學改變程度用_、+、++、+++來表示正常、輕度、中度和重度PE為胰腺提取物；pHGF為促肝細胞生長素。從上表的數據可以看出，通過觀察腎小管透明變性這個指標，經過PE治療的糖尿病大鼠，可以顯著減輕腎臟的炎症性病變。結論PE可以緩解和治療糖尿病大鼠腎臟的炎症性病變。4.5糖尿病大鼠眼球的主要病理性改變測定時間給藥治療藥物129天後。測定方法給藥結束對存活大鼠行頸椎脫臼法處死，處死後進行大體解剖，取眼球進行病理學檢查。將所取全部臟器放入10%中性福馬林液中，固定48h後，取材作常規石蠟包埋切片。切片厚度3-4，H.E染色，用OLYMPUSBX41型光學顯微鏡觀察組織病理學變化並進行攝影。結果見表三表三糖尿病大鼠胰腺和眼球的主要病理性改變統計表(百分比)tableseeoriginaldocumentpage9白內障是糖尿病的一個典型的臨床併發症。大鼠糖尿病模型，隨著糖尿病的漸進性發展，最終都會出現眼球病變。從上表中可以看出，在我們觀察的實驗期限內，模型組和陰性對照組糖尿病白內障的發生率和嚴重程度，均顯著高於PE藥物治療組。結論PE可以緩解和阻止實驗糖尿病大鼠眼部糖尿病併發症-白內障的發生。4.6胰腺提取物中胰島素活性檢測測定時間2008年12月9日測定方法1.實驗共設計三組第一組正常Wistar大鼠5隻，每隻腹腔注射生理鹽水5mL;第二組正常Wistar大鼠5隻，每隻腹腔注射胰腺提取物5mL;第三組糖尿病造模成功的Wistar大鼠5隻，每隻腹腔注射胰腺提取物5mL。2.8:00a.m.開始撤除飼料，禁食。3.血糖測定1)9:00a.m.全部15隻大鼠測定隨機血糖一次；2)血糖測定完畢後，立即按照設計方案腹腔注射生理鹽水或者胰腺提取物；3)注射完畢後的1小時、2小時、5小時和7小時分別測定血糖一次。結果見表四表四注射胰腺提取物前後大鼠血糖濃度變化表tableseeoriginaldocumentpage10注NS生理鹽水，PE為胰腺提取物。無論正常大鼠還是糖尿病大鼠，在注射胰腺提取物後的一小時左右，出現一個血糖高峰值；從正常大鼠的血糖基線值看，從實驗開始到實驗結束，血糖趨於不斷降低(禁食空腹效應)。如果PE中存在胰島素，那麼，在給實驗大鼠(無論正常大鼠還是糖尿病大鼠)腹腔注射PE後，都應該在注射後0.5小時到2小時之間，出現一個血糖動態下降變化的低谷。但是，在本實驗中，非但沒有觀察到血糖下降，相反，在腹腔注射PE後1小時左右，觀察到一個較緩的曲線峰。因此，通過本實驗，可以看出本藥品PE中沒有胰島素。結論通過正常大鼠和糖尿病大鼠的活體實驗，證實本發明所提取的動物胰腺提取物中沒有胰島素存在。因此，該動物胰腺提取物對糖尿病的作用機理並不依賴於胰島素。權利要求一種用於防治糖尿病的動物胰腺提取物，其特徵在於，是從幼齡小豬的新鮮胰臟中提取的分子量不超過10000道爾頓的小分子量活性物質溶液，提取液為澄清液體，pH值為6.0-7.0，每1ml提取液中含多肽不少於15mg，不含胰島素。2.根據權利要求1所述的動物胰腺提取物的提取方法，其特徵在於，包括以下步驟A.初處理對每個小豬胰腺外觀、性狀目檢，不合格者棄去。將合格的小豬胰腺去除脂肪組織後，以純水洗淨至無血水，切碎；B.勻漿將切碎的小豬胰腺用注射用水清洗一次，瀝去水份，稱重，用膠體磨勻漿，將勻漿液和注射用水在25°C以下按質量比為1:1.1加入高剪切勻漿機中循環5分鐘，收集勻漿液，置-l(TC以下保存；C.粗濾將凍存至少7天的勻漿液取出，流水解凍後，放入水浴中攪拌加熱至80-85t:，放入300目濾布自然過濾，收集濾液，置於l(TC以下冰水中攪拌冷卻，同時滴加鹼液調節pH值至6.5士0.5t:，得粗濾液；D.精濾將粗濾液過分子量為10000道爾頓的超濾膜，收集超濾液，置於-l(TC以下保存；E.濃縮將凍存不少於10天的超濾液用自來水解凍，底部殘渣用300目濾紙過濾，濾液與上清液合併，然後用分子量10000道爾頓的中空纖維柱進行反滲透濃縮；F.分裝將濃縮液過分子量為10000道爾頓的中空纖維柱，再過0.22m的微濾膜除菌，然後分裝，得本發明所述的胰腺提取物，置-10°C以下保存。3.根據權利要求1所述的胰腺提取物用於製備預防與治療糖尿病的藥物的用途。全文摘要本發明涉及一種動物胰腺提取物，以及該動物胰腺提取物的藥物用途。本發明所述的一種用於防治糖尿病的動物胰腺提取物，是從幼齡小豬的新鮮胰臟中提取的分子量不超過10000道爾頓的小分子量活性物質溶液，提取液為澄清液體，pH值為6.0-7.0，每1ml提取液中含多肽不少於15mg，不含胰島素。本發明所述的動物胰腺提取物，是以糖尿病發生的源頭器官胰腺為靶點，選擇動物胰腺為原料，通過現代工藝提取得到的小分子活性多肽類物質，適用於各型糖尿病的預防和治療，包括治療重症糖尿病、防止輕型糖尿病的重症化、預防器官移植後糖尿病、減少抗排斥藥物不良反應等，以及逆轉或延遲重症糖尿病的發生和發展，防止糖尿病的各種併發症。文檔編號A61P3/10GK101716188SQ20091021378公開日2010年6月2日申請日期2009年12月14日優先權日2009年12月14日發明者張海松,楊富強,王洪敏,莫國玉,陳光明,饒桂榮申請人:陳光明;王洪敏;饒桂榮;張海松;楊富強;莫國玉