兩種乳桿菌株及其用於製備通便生態口服液的方法
2023-05-27 07:48:16 1
專利名稱：兩種乳桿菌株及其用於製備通便生態口服液的方法
技術領域：
本發明涉及兩種乳桿菌株及其在製備保健食品中的應用。
背景技術：
便秘是一種常見的臨床症狀，對人體的危害很大，會引起頭痛、肩膀酸痛、肌膚粗糙等衰老、患病症狀。目前治療便秘的方法主要是用瀉藥，通過刺激小腸而產生腹瀉，但這樣往往會引起脫水，影響腸道的正常生理平衡，因而尋求一種能夠潤腸通便，無毒無害，可以長期食用的保健食品對便秘患者無疑具有重要的意義。
近些年來，利用微生物技術研製益生菌類保健食品風靡了全世界。很多研究已表明，益生菌具有提高腸道機能，改善人體胃腸功能，維持腸道菌群平衡的作用。如何選育優質益生菌菌株並將其應用於開發具有通便功能的保健食品是目前研究的熱點。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種具有潤腸通便作用的益生菌保健食品。為此，本發明公開了兩種經選育得到的乳桿菌株以及將它們用於製備通便生態口服液的方法。
本發明所提供的兩種乳桿菌株，分別為德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Lactobacillusdelbrueckii subsp bulgaricus和嗜酸乳桿菌株Lactobacillus acidophilus，已於2007年1月31日保藏在位於北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號分別為CGMCC No.1936和CGMCCNo.1937。
德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，是將保加利亞乳桿菌標準菌株1.1480(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)經活化後篩選得到。將該菌株在MRS瓊脂培養基上的形態觀察結果為革蘭氏染色呈陽性，細胞形態為長杆狀，形成芽孢呈陰性，過氧化氫酶呈陰性。
嗜酸乳桿菌株Lactobacillus acidophilus，是將嗜酸乳桿菌標準菌株1.1854(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)經活化後篩選得到。將該菌株在MRS瓊脂培養基上的形態觀察結果為革蘭氏染色呈陽性，細胞形態為杆狀，形成芽孢呈陰性，過氧化氫酶呈陰性。
本發明還提供了採用上述乳桿菌株用於製備通便生態口服液的方法，包括以下步驟
(1)採用MRS培養基對權利要求1和權利要求2的菌株分別進行培養，培養溫度為35℃，培養時間為120h；(2)將步驟(1)中培養好的兩種菌種按照1∶1的比例接入菌種罐內進行複合培養，採用營養瓊脂作為培養基，培養溫度為35℃，培養時間為48h；(3)將步驟(2)中培養好的複合菌種接入大罐內做進一步培養，採用紅糖作為培養基，培養溫度為28℃，培養時間為72h；(4)將步驟(3)中所得液體按常規罐裝製得口服液產品。
所述MRS培養基每1000ml蒸餾水中包含如下成分蛋白腖10g 牛肉膏5g 乙酸鈉5g葡萄糖20g吐溫80 1g MgSO4·7H2O 0.58g 酵母膏3gMnSO4·H2O 0.25g 檸檬酸銨2g K2HPO42g。
所述營養瓊脂培養基每1000ml蒸餾水中包含如下成分瓊脂20g蛋白腖10g 牛肉膏10g 乙酸鈉5g葡萄糖5g 吐溫80 1g 檸檬酸銨2g酵母膏5gMnSO4·H2O 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g K2HPO41g。
本發明通便生態口服液的製備採用複合培養新工藝，該工藝先進、合理、穩定、可靠，克服了只能將單個菌種單獨生產後再混合使用投資大、工藝複雜的問題。兩種菌的複合培養，可有效彌補單純嗜酸乳桿菌發酵口味差的缺點，同時由於存在共生關係，保加利亞乳桿菌分解蛋白產生的胺基酸可為嗜酸乳桿菌的生長提供營養物質，而嗜酸乳桿菌產生的乙酸可以促進保加利亞乳桿菌的生長，使其產酸能力增強，縮短複合培養的周期。經過實驗證明，本發明所制通便生態口服液具有營養高、口味佳的特點，產品質量穩定，保質期長。
具體實施例方式
實施例1 兩種菌種的複合培養先在250L菌種罐內通活蒸汽，罐內溫度升至121℃，消毒30min後，罐夾層通入蒸餾水降溫至50℃，再在罐內加入瓊脂20g、蛋白腖10g、牛肉膏10g、乙酸鈉5g、葡萄糖5g、吐溫80 1g、檸檬酸銨2g、酵母膏5g、MnSO4·H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.2g、K2HPO41g，並加水至1000ml。將罐內溫度升至121℃，實消25min，再在夾層通入蒸餾水，當罐內溫度降至35℃時，按體積比1∶1的比例，接入已培養好的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜酸乳桿菌菌種進行複合培養，培養溫度為35℃，培養時間為48h。
實施例2 複合菌種的大罐培養先在2000L大罐內通活蒸汽，當罐內溫度升至121℃，消毒30min，罐夾層通入蒸餾水降溫至50℃時，在罐內加入紅糖50g，加水至1000ml，再升溫至121℃消毒25min，降溫至35℃，罐內接入實施例1中培養好的複合菌種50ml。接完菌種後，在28℃保溫，培養72h經檢驗合格後，待罐裝。
實施例3 通便生態口服液的通便功能試驗為了解本發明所製備通便生態口服液的通便功能，由中國疾病預防控制中心營養與食品安全所與山東大學第二醫院合作，選擇了100名自願受試者，隨機分為試食組和對照組，每組50名，從2005年11月開始進行人體試食試驗。
受試對象選擇標準為排便次數一周少於3次者；糞便硬度增加者；無器質性便秘者；習慣性便秘者。受試口服液為每瓶100ml，人體用量為每人(以成人60kg體重計)每日2次，每次40ml。
試食者服用本發明所製備通便生態口服液，對照組服用外觀和口味與通便生態口服液均相似的安慰劑。按照盲法進行試食試驗，服用方法為每人每日2次，每次40ml，共服用觀察2周(14天)。在試食期間，使兩組受試者儘量保持其生活方式及飲食習慣不變，觀察記錄兩組受試者的排便次數、排便狀況、糞便性狀及膳食攝入量。
統計方法應用SPSS統計軟體包對試驗數據進行處理。數據經檢驗複合正態分布後，採用t檢驗的方法比較試食前後各指標的變化。對於數據為非正態分布的資料，採用非參秩和檢驗比較試食前後各指標的變化。計數資料使用X2檢驗進行統計分析。
結果判定試食前後，試食組自身比較排便次數明顯增加，排便狀況和糞便性狀二項指標中一項指標評分明顯下降，差異有顯著性；試食後，試食組與對照組比較，排便次數、排便狀況和糞便性狀任一項明顯改善，差異有顯著性，可判定該受試樣品有通便功能。
通便生態口服液對受試者排便次數的影響用組間t檢驗和試驗前後自身對照t檢驗對受試者試食前一周和試食期間平均一周的排便次數進行統計處理，結果見表1。
表1 通便生態口服液對受試者每周排便次數的影響(n，Mean±SD)
表1結果表明，兩組受試者試食前的排便次數沒有顯著差異，具有可比性。服用通便生態口服液期間，試食組排便次數與試食前相比有極顯著增加(P＜0.01)，且極顯著高於試驗期間對照組的周平均排便次數(P＜0.01)，說明通便生態口服液可增加便秘者的排便次數。
通便生態口服液對受試者排便狀況的影響排便狀況根據排便困難程度分為四級，評分值標準如下I級(0分)排便正常；II級(1分)僅有下墜感、不適感；III級(2分)下墜感、不適感明顯，或有便頻但排便困難而量少，較少出現腹痛或肛門燒灼感；IV級(3分)經常出現腹痛或肛門燒灼感，影響排便。
用組間t檢驗和試驗前後自身對照t檢驗對受試者的平均排便狀況評分進行統計處理，結果示於表2。
表2 通便生態口服液對受試者排便狀況評分的影響(分/次，Mean±SD)
表2結果表明，兩組受試者試食前的平均排便狀況評分沒有顯著差異，具有可比性。服用通便生態口服液期間，試食組平均排便狀況評分與試食前自身相比有極顯著降低(P＜0.01)，並且也極顯著低於對照組試食期間的平均評分(P＜0.01)，說明通便生態口服液可改善便秘者的排便狀況。
通便生態口服液對受試者糞便性狀的影響糞便狀況根據Bristol糞便性狀分類法分為三級，評分值標準如下I級(0分)像香腸或蛇，平滑且軟；像香腸，但在表面有裂痕；
軟的團塊，有明顯的邊緣(容易排出)。
II級(1分)香腸形狀，但有團塊；鬆散的塊狀，邊緣粗糙。
III級(2分)分離的硬團，像果殼(不易排出)。
用組間t檢驗和試驗前後自身對照t檢驗對受試者的平均糞便性狀評分進行統計處理，結果示於表3。
表3 通便生態口服液對受試者糞便性狀評分的影響(分/次，Mean±SD)
表3結果表明，兩組受試者試食前的平均糞便性狀評分沒有顯著差異，具有可比性。服用通便生態口服液期間，試食組平均糞便性狀評分比試食前有了極明顯下降(P＜0.01)，且顯著低於試食期間對照組的平均評分(P＜0.05)，說明通便生態口服液可改善便秘者的糞便性狀。
從以上的人體試食試驗結果可以看出，便秘者服用本發明所制通便生態口服液14天，試食組自身前後比較排便次數明顯增加(P＜0.01)，平均排便狀況和糞便性狀評分均明顯下降(P＜0.01)；與對照組比較，試食期間試食組排便次數明顯增加(P＜0.01)，平均排便狀況和糞便性狀評分均有明顯的改善(P＜0.01)。根據《保健食品檢驗與評價技術規範-2003年版》中的判定標準，可以認為本發明所制通便生態口服液對便秘者有通便功能。
實施例4 通便生態口服液的穩定性試驗對本發明所製備的通便生態口服液做了13批次的穩定性觀察實驗，其實驗結果如下
以上數據結果表明，不同批次所生產的通便生態口服液，其活菌總數大約在109cfu/ml，保存期一年後活菌總數仍能維持在大約108cfu/ml，說明由本發明製備所得通便生態口服液的活菌總數高，產品質量穩定可靠，保質期可在一年以上。
權利要求
1.一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus，其保藏號為CGMCC No.1936。
2.一種嗜酸乳桿菌株Lactobacillus acidophilus，其保藏號為CGMCC No.1937。
3.一種製備通便生態口服液的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟(1)採用MRS培養基對權利要求1和權利要求2的菌株分別進行培養，培養溫度為35℃，培養時間為120h；(2)將步驟(1)中培養好的兩種菌種按照體積比1∶1的比例接入菌種罐內進行複合培養，採用營養瓊脂作為培養基，培養溫度為35℃，培養時間為48h；(3)將步驟(2)中培養好的複合菌種接入大罐內做進一步培養，採用紅糖作為培養基，培養溫度為28℃，培養時間為72h；(4)將步驟(3)中所得液體按常規罐裝製得口服液產品。
4.根據權利要求3所述的製備通便生態口服液的方法，其特徵在於所述MRS培養基每1000ml蒸餾水中包含如下成分蛋白腖 10g 牛肉膏 5g乙酸鈉5g葡萄糖 20g吐溫80 1g MgSO4·7H2O 0.58g 酵母膏3gMnSO4·H2O 0.25g 檸檬酸銨 2g K2HPO42g。
5.根據權利要求3所述的製備通便生態口服液的方法，其特徵在於；所述營養瓊脂培養基每1000ml蒸餾水中包含如下成分瓊脂 20g 蛋白腖 10g牛肉膏10g 乙酸鈉 5g葡萄糖 5g 吐溫80 1g 檸檬酸銨 2g酵母膏 5gMnSO4·H2O 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g K2HPO41g。
全文摘要
本發明提供兩種乳桿菌株，德氏乳桿菌保加利亞亞種CGMCC No.1936和嗜酸乳桿菌CGMCC No.1937，以及將它們用於製備通便生態口服液的方法。該方法包括如下步驟(1)採用MRS培養基對兩種菌株分別進行培養，培養溫度35℃，培養時間120h；(2)將步驟(1)中培養好的兩種菌種按體積比1∶1接入菌種罐內進行複合培養，採用營養瓊脂作為培養基，培養溫度35℃，時間48h；(3)將步驟(2)中培養好的複合菌種接入大罐內做進一步培養，採用紅糖作為培養基，培養溫度28℃，時間72h；(4)將步驟(3)中所得液體按常規罐裝製得產品。本發明所制通便生態口服液營養高、口味佳，產品質量穩定，保質期長。
文檔編號A61K35/66GK101050440SQ20071006465
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月22日 優先權日2007年3月22日
發明者雷振東 申請人:雷振東