β-內醯胺類抗生素殘留檢測的受體分析法與試劑盒的製作方法

2023-05-27 17:53:31

β-內醯胺類抗生素殘留檢測的受體分析法與試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明屬於獸藥殘留分析領域，具體涉及一種β-內醯胺類抗生素殘留檢測的受體分析方法與試劑盒及應用。本發明的試劑盒含可同時檢測15種β-內醯胺類藥物殘留的受體蛋白。本發明的受體蛋白BlaR-CTD是由大腸桿菌(Escherichia?coli)BlaRC所表達，包含受體蛋白BlaR-CTD的大腸桿菌保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO：M2013173。本發明還公開了受體蛋白、酶標藥物的製備方法和受體分析方法。本發明的試劑盒可同時檢測青黴素類和頭孢菌素類藥物，拓寬了現有技術的檢測對象，具有簡便、快速、靈敏和準確等突出優點。
【專利說明】β-內醯胺類抗生素殘留檢測的受體分析法與試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於獸藥殘留分析、基因工程和受體分析【技術領域】。具體涉及一種能識別β-內醯胺類抗生素殘留的受體蛋白的製備、同時檢測15種β-內醯胺類抗生素殘留的受體分析法的建立及試劑盒研製。
【背景技術】
[0002]分子結構中含有內醯胺環的一類藥物稱為內醯胺類抗生素，主要包括青黴素類和頭孢菌素類。低廉而有效的殺菌效果使它成為目前使用最廣泛的一類獸藥。此類藥物不僅可以用來治療動物細菌感染性疾病，同時還可以作為促生長飼料添加劑使用。
[0003]由於未按照休藥期規定使用獸用β -內醯胺類抗生素或者將人用β -內醯胺類抗生素使用在動物上，導致其在畜產品中殘留嚴重。通過研究證實，即使是低劑量的此類藥物在動物食品中殘留，長期接觸也可能使對其敏感的人群發生過敏反應，嚴重者會發生過敏性休克甚至死亡。制定相應的措施對抗生素殘留進行監控和管制刻不容緩。為了保障各國利益及食品安全，各國對β_內醯胺類抗生素在動物性食品中的殘留制定了最高殘留限量(MRL)。
[0004]目前內醯胺類抗生素殘留的檢測方法主要分為理化分析法、微生物法、免疫分析法及受體分析法。理化分析法主要用於確證，亦可用於篩選，但需要昂貴的儀器作為檢測的保證，且其前處理程序較複雜並不適合大量檢測。後面三種方法主要用於篩選，其中微生物法成本低廉、操作簡便，但其精確度、準確度還無法適應目前抗生素殘留檢測的需要；免疫分析方法靈敏度 高、特異性強，但它不能同時檢測青黴素類和頭孢菌素類藥物；受體分析法可以同時識別青黴素類和頭孢菌素類藥物，可實現多殘留檢測。此外，內醯胺環容易發生水解而失活，而MRL標準中規定的殘留物為有活性的殘留物，受體能特異性地檢測到活性組分。因此，對於快速準確篩選內醯胺類抗生素在動物組織中的殘留，受體分析方法更具優勢。
[0005]目前已有一些文獻和專利報導了內醯胺類抗生素的受體分析法。例如，美國專利(專利號4762782)利用枯草芽孢桿菌PBP2a蛋白建立了 β _內醯胺類抗生素的受體分析法，但該方法需要用到抗體，操作過程複雜。基於肺炎鏈球菌ΡΒΡ2χ蛋白所建立的受體檢測方法已有數項報導，這些方法有的需要用到昂貴的生物傳感器(Cacciatore et al.，Analytica Chimica Acta, vol520,2004,ppl05_115),有的需要用到抗體(Lamar and Petz,Analytica Chimica Acta, 586, 2007, pp296_303),且能識別的 β-內醯胺類藥物種類不多，尚不能滿足需要。地衣芽孢桿菌BlaR蛋白是一種β-內醯胺酶調控蛋白，其C端區域即BlaR-CTD位於細胞膜外，能特異性的識別β-內醯胺類抗生素(Joris et al.，FEMSMicrobiology Letters，vol.70，1990，ppl07_114)。美國專利(專利號 6524804B2)在大腸桿菌中重組表達獲得地衣芽孢桿菌749的BlaR-CTD受體蛋白，來檢測食品中殘留的β _內醯胺類抗生素。此專利共設計了4種檢測生物液體中的β_內醯胺類抗生素的方式:第一種為生物素標記的BlaR-CTD的膠體金試紙條方法，這種方法能檢測牛奶中10種β -內醯胺類藥物，且檢測限均低於歐盟規定的MRL，但不能進行定量分析；第二種方式是利用融合蛋白BlaR-CTD-β內醯胺酶，可以檢測青黴素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、頭孢匹林和頭孢噻呋這6種藥物，但青黴素、氨苄西林、阿莫西林的檢測限高於歐盟規定的MRL ;第三種方式是用鹼性磷酸酶和過氧化物酶分別標記BlaR-CTD的酶標板方法，這種方法檢可以測青黴素、氯唑西林、頭孢噻呋這3種藥物；第四種方法同樣以酶來標記受體蛋白的試管方法，這種方法可檢測青黴素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、頭孢匹林和頭孢噻呋，其中前三種低於美國規定的MRL但高於歐盟規定MRL。縱觀上述方法，建立一種能同時檢測多種β -內醯胺類藥物、其檢測限須要低於歐盟規定的MRL且組織樣品處理和操作步驟簡單的受體分析方法非常有必要。基於該方法建立的試劑盒在檢測動物源性食品中的β_內醯胺類藥物殘留中具有廣闊的應用前景。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於克服現有技術存在的缺陷，製備一種能識別多種β -內醯胺類抗生素的受體蛋白。
[0007]本發明的第二個目的是利用該受體蛋白，建立一種能用於組織樣品中多種β_內醯胺類抗生素殘留檢測的受體分析法，該方法的組織樣品前處理過程簡單，涵蓋的組織樣品範圍廣(包括牛奶、牛肉和雞肉)，操作簡便快捷。
[0008]本發明的第三個目的是在組織樣品中的β_內醯胺類藥物種類已知時，可以對其進行定量分析。
[0009]本發明的第四個目的是該受體蛋白在內醯胺類抗生素殘留檢測試劑盒中的應用。
[0010]本發明的第五個目的是本發明製備的試劑盒在β-內醯胺類抗生素殘留檢測中的應用。
[0011]本發明通過以下技術方案實現:
[0012]為了實現本發明的任務，發明人克隆了地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)保藏號ATCC14580的BlaR蛋白的C端區域(BlaR-CTD)的基因，構建相應的原核表達質粒pET-28a-BlaR-CTD，轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，得到表達該受體蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli)BlaRC,於2013年5月6日將該菌株送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO:M2013173，然後誘導受體蛋白BlaR-CTD的重組表達。
[0013]具體地，本發明通過以下技術方案實現:
[0014] 申請人:製備得到一種β -內醯胺類抗生素殘留檢測試劑盒，其核心在於該試劑盒的固相載體包被有受體蛋白BlaR-CTD，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
[0015]進一步，上述試劑盒，還包含包含下列組分:
[0016](1)由受體蛋白BlaR-CTD包被的固相載體，即酶標板；
[0017](2)頭孢喹廂標準溶液6瓶，濃度分別為O μ g/L、0.5 μ g/L、I μ g/L,2 V- g/L、4y g/L、8 μ g/L ；
[0018](3)辣根過氧化物酶標記氨苄西林的儲存液；
[0019](4) IOX磷酸鹽緩衝液，用下列方法製備得到:NaC180.0g, ΚΗ2Ρ042.0g,Na2HPO4.12H2029.0g, KC12.0g,加去離子800mL充分溶解，調節pH值至7.4，補充去離子水定容至1000mL ；
[0020](5) IOX洗滌液，用下列方法製備得到:NaC180.0g，ΚΗ2Ρ042.0g，Na2HPO4.12Η2029.0g, KC12.0g, Tween205mL,加去離子水約800mL,補充去離子水定容至1000mL ；[0021](6)底物A液，用下列方法製備得到:準確稱取四甲基聯苯胺160mg，加入IOmL 二甲基乙醯胺，攪拌完全溶解；
[0022](7)底物B液，用下列方法製備得到:準確稱取檸檬酸13.70g、檸檬酸三鈉10.14g和過氧化氫脲282.0Omg，用少量超純水溶解，定容至1000mL ；
[0023](8)終止液，用下列方法製備得到:準確量取濃硫酸100mL,緩慢滴加到800mL超純水中；
[0024]使用時，將10X磷酸鹽緩衝液和10X洗滌液分別用去離子水稀釋十倍得到樣品稀釋液和洗滌液，將辣根過氧化物酶標記氨苄西林的儲存液用磷酸鹽緩衝液稀釋300倍得到酶標藥物工作液，將底物A液和底物B液按體積比為1: 10混勻得到底物混合液。
[0025] 申請人:提供了一種同時檢測β -內醯胺類抗生素殘留的受體分析方法，包括下列步驟:
[0026](I)以地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)保藏號ATCC14580的基因組為模板，利用PCR擴增得到受體蛋白BlaR-CTD的基因片段，將該基因片段插入到表達載體pET-28a中，得到重組表達質粒pET-28a-BIaR-CTD ；
[0027](2)將步驟(1)所述的重組表達質粒pET-28a-BlaR_CTD轉化大腸桿菌BL21 (DE3)得到重組的大腸桿菌(Escherichia coli) BlaRC,進一步誘導表達得到受體蛋白BlaR-CTD,對該受體蛋白進行親和純化；
[0028](3)採用碳二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺(EDC/NHS)法合成酶標藥物，即辣根過氧化物酶標記的氨苄西林HRP-AMP ；
[0029](4)用步驟⑵所述的受體蛋白BlaR-CTD包被固相載體，即酶標板；
[0030](5)將待測樣品用弱鹼性的磷酸鹽緩衝液提取，離心取上清為待測物；
[0031](6)對步驟(5)所述的待測物進行受體分析檢測。
[0032]其中:
[0033]步驟⑴中受體蛋白BlaR-CTD的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0034]步驟⑵所述的重組的大腸桿菌(Escherichia coli)BlaRC於2013年5月6日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO:M2013173 ；
[0035]步驟(5)中磷酸鹽緩衝液按如下步驟製得:NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H202.9g，KC10.2g，加去離子水800mL充分溶解，調節pH值至7.4，補充去離子水定容至1000mL。
[0036]本發明的主要優點是:
[0037]1、本發明的受體能夠識別15種β -內醯胺類藥物，而現有文獻和專利報導尚不能識別如此多種β-內醯胺類藥物；
[0038]2、本發明建立的受體分析可以檢測牛奶中規定了殘留限量的11種內醯胺類藥物的殘留情況，檢測限均在歐盟規定的MRL以下；
[0039]3、本發明還可以用來檢測牛肉和雞肉中的內醯胺類藥物殘留，適用範圍廣；
[0040]4、本發明在組織樣品中的β -內醯胺類藥物種類已知時，還可以對其進行定量分析；
[0041]5、本發明涉及的樣品處理方法簡便，易操作，準確度和精密度好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]序列表SEQ ID NO:1是本發明克隆的BlaR-CTD蛋白的基因片段的核苷酸序列，序列長度為765bp。
[0043]圖1為本發明的技術路線圖。
[0044]圖2為重組表達質粒pET-28a_BIaR-CTD的圖譜。
[0045]圖3為本發明其中一個實施例的SDS-PAGE圖，顯示了受體蛋白BlaR-CTD表達和純化的SDS-PAGE圖。圖中:泳道I為大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_28a空載體誘導全菌蛋白，泳道2、3分別為大腸桿菌BlaRC誘導全菌蛋白和純化後的重組蛋白。M為蛋白質分子量標準。
[0046]圖4為本發明其中一個實施例的紫外掃描圖譜，顯示了辣根過氧化物酶標記的氨苄西林(HRP-AMP)的紫外吸收特徵。
[0047]圖5為本發明的受體蛋白與頭孢喹肟標準品的受體分析法的反應曲線，其中X軸為頭孢喹肟標準品溶液濃度的對數值，Y軸為對頭孢喹肟標準品溶液的光密度值除以零孔光密度值(6/?)。
【具體實施方式】
[0048]下面通過實施例對本發明作進一步說明，但不限制本發明。
[0049]實施例1受體蛋白的製備
[0050]提取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)保藏號ATCC14580 (購於中國江蘇省無錫市江南大學中國高校工業微生物資源和信息中心，為商業菌株和公開使用的菌株)的基因組，用引物 5' -cgcGGATCCATGCAAAGAGATACGCACTT-3'和 5' -ccgCTCGAGTTATCGGGAAGCGGATGG-Si進行PCR擴增(PCR擴增的方法為常用方法，參見:J.薩姆布魯克，EF弗裡奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，北京，科學出版社，2002版)目的蛋白BlaR-CTD的基因。將該基因片段用限制性內切酶BamH I和Xho I進行雙酶切，插入到表達載體pET-28a的BamH 1-Xho I多克隆位點中，通過構建得到重組表達載體pET-28a-BlaR-CTD，將該重組表達載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到表達該受體蛋白的重組大腸桿菌BlaRC。
[0051]將過夜培養的重組大腸桿菌BlaRC的液體培養物以體積比為1: 100的接種量加入到LB液體培養基(含終濃度為50 μ g/mL的卡那黴素)中，在37°C和250r/min的振蕩培養箱中培養到菌液的0D_值為0.6-1.0 (對數生長期)，加入lmmol/L的IPTG，18°C下200r/min低溫誘導12h。離心收集菌 體，用預冷的磷酸鹽緩衝液(NaC18.0g，KH2PO40.2g,Na2HPO4.12H202.9g，KC10.2g，加去離子約800mL充分溶解，調節pH值至7.4，加去離子水定容至1000mL)洗滌兩次後，經過壓力破碎或者超聲破碎得到含有目的蛋白的上清液。利用親和層析純化技術，在咪唑洗脫濃度為lOOmmol/L時重組受體蛋白純度最高。收集IL的菌液可以純化得到受體蛋白BlaR-CTD約20mg。經過透析除去咪唑，蛋白純度能達到95%以上。
[0052]實施例2辣根過氧化物酶標記氨苄西林的製備
[0053]稱取4.40mg辣根過氧化物酶(HRP)，溶於ImL的ρΗ7.4的磷酸鹽緩衝液中，倒入含有磁性粒子的棕色瓶中。稱取2.40mg的碳化二亞胺(EDC)溶於500 μ L的磷酸鹽緩衝液中，混勻後逐滴加入到棕色瓶中。隨後稱取1.SOmg的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)溶於500 μ L的磷酸鹽緩衝液中，逐滴加入到棕色瓶中，在4°C條件下避光攪拌2h。以上反應液標記為A液。稱取6.18mg的氨苄西林鈉(AMP)，溶於ImL的磷酸鹽緩衝液中，標記為B液。隨後將B液緩緩的加入A液中，4°C條件下避光攪拌5h。
[0054]反應完成後，將上述反應液加入到透析袋中，在4°C置於磷酸鹽緩衝液中透析3~4d。分別測定氨苄西林鈉，辣根過氧化物酶和反應合成物的紫外全波長圖譜，得到各物質的最大吸收波長，以此鑑定是否偶聯成功。透析後的反應液加入等體積的甘油，置_20°C保存。
[0055]實施例3 β -內醯胺類抗生素多殘留受體分析方法的建立
[0056]3.1試劑的配製(本實施例使用的試劑除另註明外均採用以下方法配置)
[0057]磷酸鹽緩衝液( PBS):NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO4.12Η202.9g，KC10.2g，加去離子約800mL充分溶解，調節pH值至7.4，加去離子水定容至1000mL。
[0058]洗滌液(PBST):NaC18.0g, KH2PO40.2g, Na2HPO4.12H202.9g, KC10.2g,Tween200.5mL,加去離子水約800mL,調節pH值至7.4,加去離子水定容至1000mL。
[0059]碳酸鹽緩衝液(CBS) =NaCO3L 59g，NaHCO; 93g，加去離子水約800mL，調節pH值至9.6,加去離子水定容至1000mL。
[0060]BSA封閉液:準確稱取牛血清白蛋白10g，加入1000mL的磷酸鹽緩衝液，攪拌混勻
至蛋白完全溶解。
[0061]OVA封閉液:準確稱取卵清白蛋白10g，加入1000mL的磷酸鹽緩衝液，攪拌混勻至
蛋白完全溶解。
[0062]底物A液:準確稱取四甲基聯苯胺(TMB) 160mg,加入IOmL 二甲基乙醯胺(DMF)，攪
拌至完全溶解。
[0063]底物B液:準確稱取檸檬酸13.70g、檸檬酸三鈉10.14g和過氧化氫脲282.0Omg,超純水溶解，定容至1000mL。
[0064]底物混合液:準確量取底物B液10mL，加入100 μ L底物A液，混勻，現配現用。
[0065]終止液:準確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。
[0066]3.2包被原濃度的確定
[0067]採用方陣滴定法初步選擇包被的蛋白濃度。選擇標準以OD45tl值位於2.0附近，且相鄰兩孔OD值有較大變化的包被原濃度和對應的酶標藥物稀釋度為最佳組合。微量分光光度計測定蛋白濃度為0.5mg/mL,以該蛋白溶液為母液，以碳酸鹽緩衝液配置不同濃度的蛋白，每孔100 μ L,置於4°C包被12h。甩出包被液,每孔加250 μ L洗漆液,靜置2min後，儘量甩掉孔內的液體，並在吸水紗布上拍幹；如此重複洗滌3次，拍幹。每孔加入250 μ L封閉液，放入37°C溼盒中孵育2h。甩出孔內封閉液後，用洗滌液洗滌3次，拍幹。每孔加入50 μ L的磷酸鹽緩衝液，加入50 μ L不同濃度的倍比稀釋的酶標藥物HRP-AMP，最終每孔的體積1OOyL,混勻。37°C溼盒孵育lh。甩盡孔內液體後，洗滌液洗滌3次，拍幹。加底物混合液100 μ L/孔，37°C溼盒中孵育15min。每孔加50 μ L終止液，用酶標儀測定OD45tl值。方陣滴定法結果如表1所示。
[0068]以OD45tl值在2.0左右，且相鄰孔間差異較大時的最大稀釋倍數作為受體蛋白效價，並以蛋白和酶標藥物的使用量最少為原則，故可供選擇的最優組合為蛋白稀釋400倍，酶標藥物稀釋300倍。
[0069]表1受體蛋白的方陣滴定
[0070]
【權利要求】
1.一種能夠識別β-內醯胺類抗生素的受體蛋白BlaR-CTD，其特徵在於，該受體蛋白BlaR-CTD克隆在表達質粒pET_28a_BIaR-CTD中，表達受體蛋白BlaR-CTD的大腸桿菌(Escherichia coli)BlaRC保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:M2013173，所述的受體蛋白Bl aR-CTD的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.—種β-內醯胺類抗生素殘留檢測試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒的固相載體包被有如權利要求1所述的受體蛋白BlaR-CTD。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵包含下列組分: (1)由權利要求1所述的受體蛋白BlaR-CTD包被的固相載體，即酶標板； (2)頭孢喹肟標準溶液6瓶，濃度分別為Oμ g/L、0.5 μ g/L、I μ g/L、2 μ g/L、4 μ g/L、8 μ g/L ； (3)辣根過氧化物酶標記氨苄西林的儲存液； (4)IOX磷酸鹽緩衝液，用下列方法製備得到:NaC180.0g，KH2P042.0g,Na2HPO4.12H2029.0g, KC12.0g,加去離子800mL充分溶解，調節pH值至7.4，補充去離子水定容至1000mL ；
(5)IOX 洗滌液，用下列方法製備得到:NaC180.0g, ΚΗ2Ρ042.0g, Na2HPO4.12Η2029.0g,KC12.0g, Tween205mL,加去離子水約800mL,補充去離子水定容至1000mL ； (6)底物A液，用下列方法製備得到:準確稱取四甲基聯苯胺160mg，加入IOmL二甲基乙醯胺，攪拌完全溶解； (7)底物B液，用下列方法製備得到:準確稱取檸檬酸13.70g、檸檬酸三鈉10.14g和過氧化氫脲282.0Omg，用少量超純水溶解，定容至1000mL ； (8)終止液，用下列方法製備得到:準確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中； 使用時，將IOX磷酸鹽緩衝液和IOX洗滌液分別用去離子水稀釋十倍得到樣品稀釋液和洗滌液，將辣根過氧化物酶標記氨苄西林的儲存液用磷酸鹽緩衝液稀釋300倍得到酶標藥物工作液，將底物A液和底物B液按體積比為1: 10混勻得到底物混合液。
4.一種同時檢測β_內醯胺類抗生素殘留的受體分析方法，其特徵包括下列步驟: (1)以地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)ATCC14580的基因組為模板，利用PCR擴增得到受體蛋白BlaR-CTD的基因片段，將該基因片段插入到表達載體pET_28a中，得到重組表達質粒pET-28a-BIaR-CTD ； (2)將步驟(1)所述的重組表達質粒pET-28a-BlaR-CTD轉化大腸桿菌BL21(DE3)得到重組的大腸桿菌(Escherichia coli) BlaRC,進一步誘導表達得到受體蛋白BlaR-CTD,對該受體蛋白進行親和純化； (3)採用碳二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺(EDC/NHS)法合成酶標藥物，即辣根過氧化物酶標記的氨節西林HRP-AMP ； (4)用步驟(2)所述的受體蛋白BlaR-CTD包被固相載體，即酶標板； (5)將待測樣品用弱鹼性的磷酸鹽緩衝液提取，離心取上清為待測物； (6)對步驟(5)所述的待測物進行受體分析檢測。 其中: 步驟(1)中受體蛋白BlaR-CTD的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；步驟(2)所述的重組的大腸桿菌(Escherichia coli)BlaRC保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:M2013173 ； 步驟(5)中磷酸鹽緩衝液，按如下步驟製得:NaC18.0g, KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H202.9g，KC10.2g，加去離子水800mL充分溶解，調節pH值至7.4，補充去離子水定容至1000mL。
5.權利要求1所述的受體蛋白BlaR-CTD在製備同時檢測β-內醯胺類抗生素的受體分析試劑盒中的應用。
6.權利要求2或 3所述的試劑盒在β-內醯胺類抗生素殘留檢測中的應用。
【文檔編號】C07K14/32GK103897046SQ201310196144
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2013年5月23日
【發明者】袁宗輝, 彭娟, 程古月, 王晨曦, 王玉蓮, 彭大鵬, 郝海紅, 黃玲利, 陶燕飛, 陳冬梅, 戴夢紅, 王旭, 謝書宇, 劉振利, 謝長清 申請人:華中農業大學