創傷治療的乳鐵蛋白序列、組合物及方法

2023-05-27 17:11:41 3

專利名稱：創傷治療的乳鐵蛋白序列、組合物及方法
技術領域：
本發明涉及包含乳鐵蛋白或其片段的藥用組合物，以及它們在創傷，特別是角膜創傷的治療中的用途。
背景技術：
角膜是眼睛的透明前部，覆蓋瞳孔、虹膜以及前房。角膜的重要功能之一是通過將光線折射到晶狀體以及視網膜上來維持正常視力。人類的角膜由五層組成，其中角膜上皮是最前面一層並且形成了角膜的表面。上皮層主要是細胞的，由稱作角質化細胞的細胞組成。該層充當防止，例如，微生物侵入更深的、更易受傷害的結構的物理屏障。基質在上皮下面並且主要由膠原組成。它還包含稱作角膜細胞的其他細胞，這些細胞會在基質創傷癒合中有作用。角膜通過將光線折射到晶狀體以及視網膜上來維持正常視力的能力部分取決於角膜上皮經受連續更新的能力。上皮更新是必需的，因為它使得這該組織能夠充當保護角膜內部不被有害環境因素感染的屏障。更新過程也維持了角膜的光滑光學表面。更新率通過角膜上皮的增殖、分化以及細胞死亡過程之間的綜合平衡嚴密維持。角膜上皮的損害可能由佩戴接觸鏡期間的異物(例如，沙子和砂礫)、微生物刺激或化學刺激或由外科手術引起。大多數角膜上皮創傷迅速癒合。然而，在一些病例中，例如化學傷害，角膜上皮的癒合被延遲，使得下面的基質易受感染和潰瘍傷害。此外，眼睛不能維持正常的水合作用，導致降低視力的渾濁。鹼損傷特別受關注，並導致特徵為嗜中性細胞快速滲入角膜內的急性炎症，隨後是慢性炎症，慢性炎症涉及炎症細胞經延長期的遷移與聚集，並進一步損傷角膜表面。在嚴重的病例中，這導致 角膜潰瘍、穿孔、瘢痕形成以及永久性失明。迅速的角膜癒合對維持角膜上皮完整性以及保護視力很重要。天然的上皮的創傷癒合似乎取決於不同細胞組分的一種複雜的相互作用，這些細胞組分通過相互作用的信號分子網協作。這些分子中的許多，被稱作生長因子，在角膜創傷癒合中起重要作用。表皮生長因子(EGF)，角質化細胞生長因子以及血小板源生長因子(PDGF)是已知的刺激角膜創傷癒合的一些生長因子。還已經發現在角膜鹼燒傷之後的早期，上皮再生強烈地誘導白細胞介素(IL)-1a以及IL-6，表明它們可能在角膜上皮的再生中起作用。乳鐵蛋白是一種80-kDa的糖蛋白，其立體結構已經通過X射線結晶學分析確定。該蛋白由一條單個多肽鏈組成，該多肽鏈摺疊為兩個球狀域。這些域被定義為N-小葉(N-1obe)和C-小葉(C-1obe),對應於該蛋白的氨基(N-1obe)端半段和羧基(C-1obe)端半段。每個小葉包含一個鐵-結合位點。乳鐵蛋白具有多個功能，包括炎症減少、免疫應答調製以及抗細菌活性。它是在許多物種中發現的一種蛋白，並且因此反映了一些種間序列變
巳高山(Takayama)等人(負責促進人成纖維細胞的膠原凝膠收縮活性的牛乳鐵蛋白區域，《生物化學和生物物理研究通訊》(The bovine lactoferrin regionresponsible for promoting the collagen gel contractile activity of humanfibroblasts, Biochem Biophys Res Commun2002; 299:813-817))通過人成纖維細胞檢驗了牛乳鐵蛋白的N-小葉和C-小葉促進膠原凝膠收縮的能力。美國專利號7，524，814涉及一種包括整個乳鐵蛋白或N-端乳鐵蛋白變體的組合物，其中至少該N-端甘胺酸殘基被截短或被取代，用作一種用於創傷癒合的治療。仍存在對可以藉助實用劑量(S卩，每單位質量足夠有效的一個劑量)來刺激角膜上皮創傷修復的無刺激組合物的需要。本說明書中對任何現有技術的提及不是並且不應當視為承認或以任何形式暗示這種現有技術形成在澳大利亞或任何其他管轄權的公知常識的部分或者可以合理地預期這項現有技術由本領域技術人員確認、理解和視為相關的。發明概述本發明涉及一種治療角膜創傷的方法，它包括將包括有效量的多肽或肽模擬物(包括乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體)的藥用組合物給予對其有需要的受試者。本發明還涉及一種藥用組合物，包括一個有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的 多肽或肽模擬物。在一個實施方案中，該乳鐵蛋白是牛乳鐵蛋白。在一個實施方案中，該肽或肽模擬物由或主要由乳鐵蛋白的C-小葉組成。在本說明書中，「主要由…組成」意思是，對肽或肽模擬物而言，如通過下文描述的方法測定，基本上具有與牛乳鐵蛋白的C-小葉相同活性的任何長度的胺基酸序列，並且其與C-小葉序列具有至少60%的同一性。如在下文說明的，N-小葉以及整個乳鐵蛋白具有與C-小葉不同的活性並且因此「主要由」乳鐵蛋白的C-小葉「組成」的肽或肽模擬物不包括整個乳鐵蛋白。合宜地，可以通過下文描述的細胞增殖和/或遷移測定來常規地測定，確定一條胺基酸序列是否基本上具有與牛乳鐵蛋白的C-小葉相同的活性。在一個實施方案中，通過整個乳鐵蛋白的蛋白水解作用獲得C-小葉。優選地，該蛋白酶是胰蛋白酶。在一個實施方案中，該乳鐵蛋白是牛乳鐵蛋白。任選地，其獲得自牛奶。在另一個實施方案中，該受試者是人類患者。在一個實施方案中，該受試者具有，或者疑似具有角膜上皮創傷或損傷。這可以從另一種損傷或多種損傷中分離出或除另一種損傷或多種損傷外。在一個另外的實施方案中，該角膜創傷是一種上皮的角膜創傷。在仍一個另外的實施方案中，該上皮的角膜創傷是一種鹼誘導的創傷。本發明還涉及包含乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體的藥用組合物。在一個實施方案中，該藥用組合物處於一種適合向眼睛給藥的形式。優選地，該藥用組合物是水溶液。將該藥用組合物局部給藥。本發明還涉及一種治療角膜創傷的方法，包括給藥一個治療有效量的包括乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體的多肽或肽模擬物。本發明還涉及一個治療有效量的包括乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體的多肽或肽模擬物用於治療角膜創傷的用途。本發明還涉及一個治療有效量的包含乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體的多肽或肽模擬物用於製造用於治療角膜創傷的藥劑的用途。
在一個實施方案中，當在治療角膜創傷的方法中使用時，本發明提供了一種包括乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體的肽或肽模擬物。在一個實施方案中，本發明提供了一種用於治療角膜創傷的藥用組合物，包括作為一種活性成分的、主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用於治療角膜創傷的藥用組合物，包括一種主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物作為主要成分。本發明還涉及一種治療角膜創傷的方法，包括給藥一個治療有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物。本發明還涉及一個治療有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物用於治療角膜創傷的用途。本發明還包括這種多肽或肽模擬物用於製造用於治療角膜創傷的藥劑的用途。本發明還涉及一種治療角膜創傷的方法，包括以下步驟鑑別具有角膜創傷的受試者；並且給藥包括一個有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物的一種藥用組合物，或者

給藥一個治療有效量的、主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物。本發明還涉及一種加速角膜創傷閉合的方法，包括向需要其的受試者給藥包括一個有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物的一種藥用組合物，或者一個治療有效量的、主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物。在其他實施方案中，提供了用於上述的本發明的方法中的試劑盒，該試劑盒包括容納本發明的肽、肽模擬物或藥用組合物的容器；以及—個帶有書面使用說明的標籤或包裝插入物。優選地，該書面說明描述了該試劑盒在本發明的方法或用途中的使用。在其他實施方案中，當在上述的本發明的方法中使用時，提供了一個試劑盒，該試劑盒包括容納本發明的肽、肽模擬物或藥用組合物的容器；以及一個帶有書面使用說明的標籤或包裝插入物。優選地，該書面說明描述了該試劑盒在本發明的方法或用途中的使用。在某些實施方案中，該試劑盒可以包含用於治療角膜創傷的一種或多種另外的活性要素或成分。附圖簡要說明

圖1. SEQ ID號I (在登錄號P24627-1，序列版本2下，從Swiss-Prot資料庫可公開獲得)。圖2.基本角膜解剖(用蘇木精和伊紅染色)，示出上皮，上皮是最前面的一層，形成了角膜的外表面。圖3.與BSA對照相比，用12. 8 ii M牛乳鐵蛋白天然的(BLF);不含鐵(a-BLF);鐵飽和的(h-BLF);用TFMS去糖基化的(BLF TFMS);暴露於兼性離子去汙劑2%CHAPS (BLFCHAPS);暴露於離液劑6M Gdn-HCl (BLF Gdn-HCl);還原的並烷基化的；以及LFcin B肽孵化24小時後鹼誘導的HCLE創傷的相對閉合。數據代表平均值+SD(n=8)。*與天然的BLF相比，無統計學上的顯著差異(P>0.1)。#與天然的BLF相比，統計學上顯著減少(p〈0. 001)。圖4. BLF的化學去糖基化是通過7. 5%SDS_PAGE在非還原條件下確認的，並且對其用考馬斯R-250染色。(A)天然的BLF ； (B)用TMSF孵化30分鐘的BLF。圖5.來自絲氨酸蛋白酶親和層析柱的部分(A) BLF注入到柱中；(B)蛋白標準；(C)未結合部分；以及(D)洗脫部分。在還原條件下在12%的SDS-PAGE上可見，並且用考馬斯R-250染色。圖6.通過 0.1 ii M 的、用 I ii M PMSF 處理過的 p_BLF、BLF、N_ 小葉、C-小葉、np-BLF以及BLF的絲氨酸蛋白酶底物30 ii M Z-Phe-Arg-AMC水解的速率。數據代表平均值+SD.(對p-BLF而言，n=3 ;對BLF、N-小葉、C-小葉、np-BLF以及BLF而言，n=6)。*與p_BLF相t匕，統計學上顯著差異(P〈0. 005)。#與天然的BLF相比，統計學上顯著差異(p〈0. 05)。圖7.通過ImM PMSF，在具有或不具有絲氨酸蛋白酶抑制作用下，在12. 6 ii M以及252 ii M天然的BLF (分為非蛋 白水解的(np-BLF)以及蛋白水解的(p_BLF)部分)存在下，鹼誘導的HCLE創傷的閉合。數據代表平均值+SD (n=8)。*與PMSF處理的相比，統計學上顯著差異(P〈0. 001)。#與PMSF處理的相比，統計學上顯著差異(p〈0. 005)。與l/20a濃度相比，統計學上顯著差異(P〈0. 001 )。圖8.來自胰蛋白酶消化以及BLF N-小葉和C-小葉純化的部分(A)蛋白標準；(B)胰蛋白酶消化4小時的BLF; (C)從「B，，中通過陽離子交換以及尺寸排阻色譜法純化的C-小葉；(D)BLF; (E)胰蛋白酶消化0.5小時的BLF; (F、G、H)分別為從「E」的尺寸排阻色譜法的多個峰中分離出的BLF、部分消化的C-小葉、以及N-小葉。在還原條件下在12%的SDS-PAGE上可見，並且用考馬斯R-250染色。圖9.在 1.28、6.4、12.8、64 以及 128iiM 濃度處，用天然的 BLF、BLF N-小葉、BLFC-小葉以及BSA處理的鹼誘導的HCLE創傷的閉合。數據代表平均值+SD(n=8)。*與等摩爾的天然BLF (p〈0. 05)以及BLF N-小葉(p〈0. 001)相比，統計學上顯著增加。#與等摩爾的天然BLF相比，統計學上顯著減少(p〈0. 005 )。與等摩爾的BSA相比，統計學上顯著減少(p〈0. 05)。圖10.在豚鼠眼睛內，用64 U M BLF, N-小葉、C-小葉或PBS (載體)處理的、表示為創傷平均直徑土標準差的清創術創傷的閉合。用25 UL劑量給藥，對於頭24小時，每3個小時一次，並且然後一天3次，直至創傷閉合。~C-小葉創傷小於N-小葉處理的創傷(p〈0. 04)。#C-小葉創傷小於PBS處理的創傷(p〈0. 005)。*C-小葉創傷小於BLF處理的創傷(p=0. 02)。圖11.在豚鼠眼睛內，用64iiM BLF、N-小葉、C-小葉或PBS (載體)處理的、表示為創傷平均直徑土標準差的鹼創傷的閉合。用25 y L劑量給藥，對於頭8小時，每I小時一次，並且然後一天3次，直至創傷閉合。#C-小葉創傷顯著小於載體處理的創傷(p=0. 013)。圖12.人類角膜緣上皮細胞在添加有1.28、6.4、12.8、64以及12811|1濃度的牛血清白蛋白(BSA)、牛乳鐵蛋白(BLF)、N-小葉亦或C-小葉的介質(M)中的增殖。在0、8、16以及24小時孵化後,通過CyQuant進行測量。對所有的組，n=8。#與等摩爾的BSA相比，更小的增殖(P〈0. 001)。*與等摩爾的BSA相比，更大的增殖(p〈0. 05)。圖13.當用ImM羥基脲抑制增殖時，在添加有1. 28,6. 4、12. 8、64以及128 y M濃度的牛血清白蛋白(BSA)、牛乳鐵蛋白(BLF)、N-小葉亦或C-小葉的介質(M)中，人類角膜緣上皮細胞通過遷移的創傷閉合。對所有的組，ri=8。在去除遷移障礙0、8、16以及24小時之後，進行測量。*與等摩爾的BSA相比，更大的遷移(p〈0. 05)。#與等摩爾的BSA相比，更小的遷移(P〈0. 001)。實施方案的詳細說明現在將詳細地參照本發明的某些實施方案。儘管將結合實施方案描述本發明，但將應理解，不旨在將本發明不局限於那些實施方案。相反，本發明意在覆蓋全部替代形式、修改、和等同物，它們可以被包括在如權利要求書所定義的本發明範圍內。本領域技術人員將認識到，與在此所述的那些相似或等同的許多方法和材料，它們可以用於本發明的實踐。本發明無論如何不局限於所述的方法和材料。 術語「乳鐵蛋白的C-小葉」是指乳鐵蛋白的C-端小葉。如以上討論的，該蛋白由一條單個多肽鏈組成，該多肽鏈摺疊為兩個球狀域。這些域被定義為N-小葉(N-1obe)和C-小葉(C-1obe)，對應於該蛋白的氨基(N-1obe)端半段和羧基(C-1obe)端半段。每個小葉包含一個鐵-結合位點。已經示出，乳鐵蛋白為約690個胺基酸長，其中C-小葉對應於約胺基酸364 (至少對於牛乳鐵蛋白)至C-末端(例如，胺基酸690)的胺基酸序列。C-小葉的N-端可以位於胺基酸364，或者在該位置的兩到三個胺基酸內(例如，胺基酸361至胺基酸366)。在一個實施方案中，C-小葉的胺基酸序列是在圖1中給出的那個(定義為SEQID號I)。本發明延伸至乳鐵蛋白的所有公開序列以及它們包含的C-小葉序列。在一個優選實施方案中，C-小葉衍生自牛乳鐵蛋白並且具有根據SEQ ID號1的序列。如在此所述，本發明還包括變體，例如物種變體或多態變體，包括如在下文描述的一個胺基酸序列，其中在括號中的這些胺基酸的任何一個或多個代替其前面的胺基酸。YTRVVWCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADALNLDGGYI(V)YTAGKCGLVPVLAENRKS(T)SKH(Y)SSLDCVLRPTEGYLAVAVVK(R)KANEGLTffNSLKDKKSCHTAVDRTAGffNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGA(R)DPKSRLCALCA⑶DQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAVVSRSDRAAHVKQVLLH(R)QQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYVTAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR術語「多肽」或「多肽鏈」是指胺基酸的一個聚合物，通常通過醯胺鍵連接在一起。胺基酸功能上的活性聚合物通常被稱作「蛋白」。存在著乳鐵蛋白的多個同種型，並且因此組成乳鐵蛋白的胺基酸的確切數量將變化。因此，C-小葉在該蛋白中的確切位置也將變化。本發明旨在覆蓋展現出如通過下文描述的方法測定的相同活性的C-小葉的所有功能上的活性片段以及變體。這還包括C-小葉的apo-以及holo-形式、翻譯後修飾的形式、連同糖基化的或去糖基化的衍生物。C-小葉可以任選地包括在整個乳鐵蛋白的C-小葉與N-小葉之間存在的葉間區或其一部分。葉間區可以具有乳鐵蛋白的任何同種型或物種變體的序列。與乳鐵蛋白的C-小葉的多肽序列片段或變體相關的術語「功能上活性的」意思是，通過，例如，被施加到的要治療的創傷上，如通過下文描述的方法測定，能夠癒合角膜創傷的片段或變體(例如，類似物、衍生物或突變體)。此類變體包括天然發生的變體以及非天然發生的變體。考慮到了這些胺基酸的一個或多個的添加、缺失、取代以及衍生，只要這些修飾不導致該片段或變體的功能活性喪失。通過縮短胺基酸序列，例如，使用一種肽鏈外切酶或者通過合成更短長度的胺基酸序列，可以容易地確定功能上的活性片段，並且然後例如通過在以下實例中說明的方法，對任何創傷癒合活性進行測試。在無天然變體發生的情況下，可以將該片段稱作肽模擬物，肽模擬物也在本發明的範圍內。例如，合成的胺基酸以及它們的類似物可以替代如在以下方法中測定、提供創傷的癒合活性的這些天然胺基酸的一個或多個。「肽模擬物」是一種合成的化學化合物，其基本上具有本發明的肽的相同的結構和/或功能特徵，在此進一步描述後者。典型地，肽模擬物具有與本發明的肽相同或相似的結構，例如，與乳鐵蛋白的C-小葉相同或相似的序列。肽模擬物總體上包含至少一個非天然合成的殘基。肽模擬化合物的非天然組分可以根據以下項一個或多個a)除天然醯胺鍵(「肽鍵」)連接之外的殘基連鎖群；b)非天然的殘基代替天然發生的胺基酸殘基；或誘導二級結構擬態的殘基，即，用以誘導或穩定二級結構，例如，P轉角、Y轉角、P片層、a螺旋構象、等。使用在科學以及專利文獻中(例如，《有機合成集合卷》，吉爾曼等人，約翰.威利父子出版公司，紐約(Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman etal. (eds) John ffiley&Sons, Inc. , NY)；歐貝迪；《分子生物技術》(al-Obeidi ;MolBiotechnol 1998;9:205-223);赫魯比《化學生物學新見》(Hruby Curr Opin ChemBiol 1997; 1: 114-119);奧斯特加德《分子多樣性》(Ostergaard Mol Diversl997; 3:17-27)；奧斯德士《酶學方法》(Ostresh Methods Enzymoll996; 267:220-234))描述的多種步驟和方法學可以合成肽模擬物。優選地，功能上的活性片段具有30、40、50、60、70、80、90或更大的胺基酸長度。優選地，該功能上的活性片段或變體具有該片段或變體對應的SEQ ID號I的有關部分的至少約60%同一性，更優選至少約65%、70%、75%、80%或85%同一性，甚至更優選90%同一性，甚至更優選至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。該功能上的活性片段或變體可以對應於，或者具有與來自乳鐵蛋白的C-小葉的連續的胺基酸序列的同一性，然而，還考慮至IJ，一個功能上的活性片段對 應於，或者具有與空間上聚集在乳鐵蛋白的C-小葉的立體結構中的胺基酸序列的同一性。此類功能上的活性片段與變體包括，例如，具有保守的胺基酸置換的那些。本領域的那些技術人員可以確定用於測量比對的適當參數，包括實現對進行比較的序列的全長的最大比對所需要的任何算法(下述非限制性實例)。當比對胺基酸序列時，給出的胺基酸序列A與(to、with或against)給出的胺基酸序列B(可以可替代地被表述為給出的胺基酸序列A具有或包括與(to、with或against)給出的胺基酸序列B的某一百分數的胺基酸序列同一性)的百分數胺基酸序列同一性可以被計算為百分數胺基酸序列同一性= (X/Y)xlOO，其中，X是通過A與B的序列比對程序的或算法的比對，被打分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，並且Y是B中的胺基酸殘基的總數。如果胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不等，則A對B的百分數胺基酸序列同一性將不等於B對於A的百分數胺基酸序列同一性。在計算百分數同一性中，計數確切的匹配。兩個序列之間的百分數同一性的確定可以通過使用數學算法來完成。用於兩個序列的比較的一種數學算法的一個非限制性的實例是卡爾林和阿爾丘爾《美國國家科學院院刊》(Karlin and Altschul Proc Natl AcadSci 1990USA;87:2264)的算法，該算法被修改為卡爾林和阿爾丘爾《美國國家科學院院刊》(Karlin and Altschul Proc Natl Acad Sci USA1993;90:5873-5877)。這樣一種算法被結合到阿爾丘爾等人，《分子生物學雜誌》(Altschul et al. J MoI Bioll990; 215:403)的BLASTN以及BLASTX程序中。為了獲得用於比較目標的有缺口的比對，可以利用如在阿爾丘爾等人，《核酸研究》(Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res25:3389)中所述的有缺口的BLAST (BLAST2. 0中)。可替代地，可以將PS1-Blast用於進行檢測兩個分子之間的距離關係的迭代檢索。參看阿爾丘爾等人(Altschul et al. (1997))，同上。在一個優選實施方案中，利用BLAST、有缺口的BLAST以及PS1-Blast程序，使用各自程序的默認參數(例如，BLASTX以及BLASTN)。還可以通過檢查，手動進行比對。用於序列比較的一種數學算法的另一個非限制性的實例是ClustalW算法(希金斯等人,《核酸研究》(Higgins et al. NucleicAcids Resl994; 22:4673-4680))。ClustalW比較多個序列並且將全部的胺基酸或DNA序列對齊，並且因此可以提供關於全部胺基酸序列的序列保守性的數據。ClustalW算法被用在若干可商購的DNA/胺基酸分析軟體包中，例如，Vector NTI程序套裝的ALIGNX模塊(Invitrogen 公司，加利福尼亞州，卡爾斯巴德(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA))。用ClustalW進行胺基酸序列比對之後，可以估算出百分數胺基酸同一性。對於ClustalW比對的分析有用的一個軟體程序的非限制性實例是GENED0C 或JalView (htp://www.jalview. org/)。GENED0C 允許評估多個蛋白之間的胺基酸(或DNA)相似性以及同一性。用於序列比較的一種數學算法的另一個非限制性的 實例是梅耶斯和米勒的算法(algorithmof Myers and Miller) (CABI0S1988; 4:11-17)。這樣一種算法被結合到 ALIGN 程序(2.0版)中，該程序是GCG威斯康辛州遺傳學軟體包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage), 10版(得自美國，力口利福尼亞州,聖地牙哥，斯克蘭頓路9685的Accelrys公司(Accelrys, Inc. , 9685Scranton Rd. , San Diego, CA, USA))的一部分。在一個優選實施方案中，當估算百分比同一性時，利用被用於比較胺基酸序列的ALIGN程序，PAM120權重殘基表、12的缺口長度罰分以及4的缺口罰分。術語「保守的胺基酸置換」是指一個胺基酸被另一個相同類別的胺基酸置換，這些類別如下非極性的Ala、Val、Leu、lie、Pro、MetPhe> Trp極性不帶電荷的Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性的Asp、Glu鹼性的Lys、Arg、His其他保守的胺基酸置換還可以如以下組成芳香族的Phe、Tyr、His質子供體Asn、Gin、Lys、Arg、His、Trp質子接受體Glu、Asp、Thr>Ser> Tyr> Asn、Gln術語「治療」(treating或treatment)是指向受試者給藥一個治療有效量的、包括該肽或肽模擬物(如，乳鐵蛋白的C-小葉)的組合物，使得該受試者被治療的病症(例如，角膜創傷)有所改善。將認識到，該治療可以改善該病症，但是可能不會提供對該病症的完全治癒。該藥用組合物可以包括乳鐵蛋白的C-小葉、或它的一種或多種功能活性片段或變體。術語「受試者」是指向其給藥一種包含乳鐵蛋白的C-小葉的組合物的任何動物。在一個優選實施方案中，該受試者是有創傷的人類患者。該創傷優選是一種角膜創傷，並且在一個實施方案中，是一種角膜上皮創傷。雖然本發明發現了人類中的應用，但是本發明對於獸用目的也是有用的。如在此所述，本發明對於治療家畜(例如牛、綿羊、馬以及家禽);寵物(例如貓和狗)；以及動物園動物的創傷是有用的。術語「治療有效量」或「有效量」是指導致該疾病或病症的一個或多個症狀改善或恢復的肽或肽模擬物的量。術語「創傷」是指由於疾病或紊亂或者由於事故、偶然事件或外科手術(例如，LASIK或PRK)引起的一種損傷，例如潰瘍或病損。例如，該創傷可以是由角膜與異物(例如，沙子)接觸導致的一種磨損。該創傷可以是由於鹼損傷，即鹼誘導的創傷或任何其他化學燒傷引起的一種角膜創傷(確切地，包括具有或不具有與其他創傷或損傷一起的角膜上皮創傷)。潰瘍可以是有傳染性的、炎性的或自身免疫源性的。病損可以是一種不癒合角膜病損。該創傷還可能是由於乾眼病引起的。術語「藥用組合物」是指包括肽或肽模擬物(如，乳鐵蛋白的C-小葉)的組合物，該組合物被分散在一種藥學上可接受的載體中。該藥用組合物可以包括乳鐵蛋白的C-小葉或它的一種或多種功能活性片段或變體。該組合物可以進一步包括一種或多種額外的賦形劑，如，稀釋劑、乳化劑、緩衝劑、穩定劑、粘合劑、填充劑，以及類似物。可任選地，它可以包括一個有效量的其他的藥學上的活性組分。例如，還可以包括一種抗生素，如喹諾酮家族的一個成員或氨基糖甙與￠-內醯胺的一個組合。其他抗生素包括但不局限於，氯黴素、四環素類並且還可以使用大環內酯類。此外，該組合物可以包括一種或多種抗炎劑，這個或這些抗炎劑可以是甾體的 或非甾體的抗炎劑。本發明的藥用組合物還可以僅包含乳鐵蛋白的C-小葉(S卩，主要由其組成)。可替代地，本發明包括一種藥用組合物，該藥用組合物包含與任何其他肽、肽模擬物和/或其他活性成分相比，一個更大濃度的一種主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的肽或肽模擬物。如在此使用，除非上下文另外要求，否則術語「包括」和該術語的變體，如「包括著」(comprising)、「包括了」(comprises)和「被包括」(comprised)不意在排除其他添加物、組分、整數或步驟。本發明治療角膜創傷，並且涉及向受試者給藥一種包括有效量的肽或肽模擬物(例如乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體)的藥用組合物。本發明具體涉及角膜創傷的治療。具體地，本發明考慮的角膜創傷的類型是上皮的角膜創傷。這些創傷可能是由於，例如，化學損傷，如由眼睛暴露於鹼性試劑導致的(即，鹼誘導的創傷)或外科的酒精清創術引起的。鹼誘導的創傷可以，例如，由於眼睛意外暴露於鹼性液體、肥料、石膏以及水泥粉、家用清潔產品(特別是含氨的那些)、排水溝清潔產品、烘箱清潔劑以及類似物而發生的。本發明還協助將病原體進入角膜中最小化。
鹼暴露導致上皮細胞死亡、基質膠原變性並且危害角膜，以及使眼睛內部被異物與病原入侵。鹼誘導的創傷特徵為升高的炎症應答以及阻礙的創傷癒合，這將延長在其間可以發生威脅視力的次級併發症(例如，微生物感染)的危險期。一些損傷還可以導致上皮潰瘍的復發、慢性基質潰瘍、深度基質新生血管形成、結膜過度生長、或者甚至角膜穿孔。可以用本發明的肽或肽模擬物或者通過本發明的方法或用途治療的其他角膜創傷是由清創術、磨損、刮傷或任何其他磨蝕損傷引起的創傷。這些創傷通常被認為是非炎性創傷。本發明的諸位申請人已經發現，乳鐵蛋白的C-小葉能夠比乳鐵蛋白的N-小葉亦或天然的(即，整個)乳鐵蛋白更有效地增加創傷閉合速率。由天然乳鐵蛋白促進角膜不同部分癒合、角膜基質創傷癒合先前已經被歸因於其刺激成纖維細胞增殖(致使細胞外基質的合成)。相比之下，本發明涉及不包含成纖維細胞的角膜上皮創傷的治療。不希望受任何理論或行動模式的約束，本發明的諸位申請人提出乳鐵蛋白的C-小葉通過促進上皮細胞遷移跨越眼表並且上調不同細胞因子以及生長因子(例如，IL-6以及roGF)的表達，來增加上皮創傷閉合的速率。圖2示出了基本的角膜解剖。上皮是最前面的一層，形成了角膜的外表面。該層主要是細胞的(由角質化細胞組成)。基質在上皮下面並且包含角膜細胞。它大部分由膠原組成。角膜細胞形成了在由非常細的分支相連的膠原層之間的鬆散連接的網絡，並且佔基質的約10%。角膜上皮細胞(角質化細胞)的遷移發生在纖連蛋白的臨時基質(provisionalmatrix)、粘連的胞外糖蛋白上，後兩者出現在角膜上皮創傷部位處的基質的暴露面上。已經示出，纖連蛋白的表達在損傷之後增加，並且某些生長因子能夠增強纖連蛋白對細胞遷移的效應。在上皮創傷癒合的病 例中，提出這些生長因子通過天然乳鐵蛋白的上調可以被歸因於它與不同受體(如，在創傷癒合以及TOGF-信號通路中涉及的那些)的相互作用。再次，不希望受任何理論或行動模式的約束，與N-小葉以及天然乳鐵蛋白相比，C-小葉的增加的效力可能是由於空間因子、更大的底物親和力或來自N-小葉的抑制效應。例如,將C-小葉從N-小葉的不必要的40kDa上釋放，可以減少這些肽在具體靶結合位點的空間幹擾，由此促進創傷癒合。可替代地，乳鐵蛋白N-端附近的陽離子精氨酸對普遍存在的陰離子底物(例如，硫酸化的氨基聚糖)的吸引將減少可用於結合靶的乳鐵蛋白，用於促進創傷癒合。最後，與創傷閉合溫和地拮抗的活性(例如，蛋白水解活性)可以存在於N-小葉的肽上。本發明還涉及一種加速角膜創傷閉合的方法，包括向對其有需要的受試者給藥一種藥用組合物，該組合物包括一個有效量的多肽或肽模擬物(包括乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體)，或一個治療有效量的多肽或肽模擬物(包括乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體)。與未治療的創傷和/或用完整的乳鐵蛋白治療的創傷相比，用本發明的肽或肽模擬物治療的創傷的閉合被加速。角膜創傷的加速閉合有利於防止對角膜的額外傷害，和/或最小化感染或潰瘍的風險。此外，加速創傷閉合導致視覺功能的快速分辨。本領域的技術人員將理解的是，乳鐵蛋白的C-小葉可以通過技術人員已知的任何合適的方法獲得，這些方法包括但不局限於重組技術，使用遺傳工程的從頭合成和/或化學合成技術；從天然來源(例如，哺乳動物的奶)中分離、純化並蛋白水解；以及購買自商業來源。以此方式，可以純化、分離、重組或合成C-小葉。
在一個優選實施方案中，通過將天然來源的、重組的或可商購的乳鐵蛋白蛋白水解為N-小葉和C-小葉來獲得C-小葉。優選地,使用的蛋白酶是胰蛋白酶。然後可以使用任何數量的、技術人員已知的技術將N-小葉和C-小葉彼此分開，這些技術例如，色譜法。陽離子交換以及尺寸排阻色譜法都是合適的方法。存在於本發明的藥用組合物中的肽或肽模擬物(例如C-小葉)的濃度可以是，例如，在10至70iiM之間。本發明的藥用組合物可以是一種眼用組合物，它是一種適合向眼睛給藥或應用於眼睛的組合物。根據本發明的眼用組合物的實例是懸浮液、軟膏、持續釋放的配製品(包括當負載到接觸鏡或其他生物材料中時)、凝膠或適合用作滴眼劑的溶液。優選地，根據本發明的藥用組合物將被配製為用於局部給藥或者用於持續釋放遞送。優選地，本發明的組合物處於一種適合向眼睛給藥的形式。基於配製容易連同受試者藉助滴入一至兩滴的該溶液到病眼中，從而容易地給藥此類組合物的能力，總體上優選水性溶液。然而，該組合物還可以是懸浮液、粘性的或半粘性的凝膠或者其他類型的固體或半固體組合物，或者適用於持續釋放的那些。該藥用組合物可以是一種眼部潤滑劑，例如人工淚液配製品，或接觸鏡溶液。多種載體中的任一種都可以被用在本發明的組合物中，包括水，水和水可混溶溶劑的混合物，該水可混溶溶劑例如C1至C7鏈烷醇類、包括從0. 5%至5%的無毒的水溶性聚合物的植物油或礦物油、凝膠產品(例如明膠、藻酸鹽、果膠、黃蓍膠、梧桐膠、黃胞膠、角叉菜膠、瓊脂以及阿拉伯膠，以及它們的衍生物)、澱粉衍生物(例如澱粉乙酸酯以及羥丙基澱粉)、纖維素及其衍生物，並且還 有其他的合成產物(例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯基甲基醚、聚氧化乙烯，優選交聯的聚丙烯酸，例如中性聚羰乙烯或那些聚合物的混合物)、天然發生的磷脂(例如，卵磷脂)、或烯基氧化物與脂肪酸的縮合物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合物(例如，十七烷亞乙基氧基鯨蠟醇)、或環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯類的縮合物(例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)、或環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯類的縮合物(例如，聚乙烯山梨醇單油酸酯)。通過添加水，適合製備水性懸浮液的可分散粉以及顆粒提供了與分散劑或溼潤齊U、懸浮劑以及一種或多種防腐劑混合的活性成分。合適的分散劑或溼潤劑以及懸浮劑通過上文已經提及的那些進行舉例說明。根據本發明的組合物可以包括至少一種膠凝劑。適用於藥用組合物的膠凝劑是本領域那些普通技術人員熟知的，並且包括，例如，黃原膠及其衍生物，卡波姆及其衍生物，基於丙烯酸酯的共聚物以及交聯聚合物，聚丙烯酸鈉及其衍生物，纖維素及其衍生物，以及澱粉和瓊脂以及它們的衍生物。根據本發明的膠凝劑的選擇在提供透明凝膠(Clear gel)中是重要的。添加到該組合物中的膠凝劑的量可以輕易地由本領域的一個普通技術人員用最少的實驗來確定，並且將取決於本領域的普那些技術人員已知的因素，例如膠凝劑的特性以及藥用組合物的希望的特性。可以包括在本發明的藥用組合物中的額外成分包括張度增強劑、防腐劑、增溶劑、穩定劑、無毒的賦形劑、緩和劑、掩蔽劑、pH調節劑、共溶劑以及粘度助劑。對於pH調節，優選地對於生理學pH調節，緩衝劑會尤其有用。本溶液的pH應當保持在4至8，優選6至7. 5之間的範圍內。本領域的普通技術人員將理解的是，與眼表相容的任何PH都是合適的。可以添加合適的緩衝劑，例如硼酸、硼酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸、碳酸氫鈉、TRIS、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)以及不同的混合的磷酸鹽緩衝劑(包括Na2HP04、NaH2P04以及KH2PO4的組合)以及它們的混合物。通常，在濃縮中將使用的緩衝劑的範圍是從約0. 05至0. 5M。如果需要的話，典型地通過張度增強劑來調節張度。此類試劑可以是，例如，離子和/或非離子型的。離子張度增強劑的實例是鹼金屬或土金屬滷化物，例如像CaCl2、KBr,KCl、LiCl、Na1、NaBr或NaCUNa2SO4或硼酸。非離子張度增強劑是，例如，脲、甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇、或右旋糖。典型地用張度劑將本發明的水性溶液調節至接近正常淚液的滲透壓。在某些實施方案中，本發明的這些組合物額外包括一種防腐劑。防腐劑可以典型地選自季胺類化合物，例如氯化苄烷銨(N-苄基-N- (C8-C18烷基)-N. N- 二甲基氯化銨)、苯佐氯銨或類似物。不同於季銨鹽的防腐劑的實例是硫代水楊酸的烷基汞鹽，例如像，硫柳汞、硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼酸苯汞，過硼酸鈉，亞氯酸鈉，對羥苯甲酸酯，例如像，對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯，苯甲酸鈉，水楊酸，醇類，例如像，三氯叔丁醇、苯甲醇或苯乙醇，胍基衍生物，例如像，氯己定或聚六亞甲基雙胍，過硼酸鈉，Germafjc或山梨酸。優選的防腐劑是季胺類化合物，特別是氯化苄烷銨或其衍生物，例如多季胺聚合物(Polyquad)(參見，美國專利號4，407，791)、烷基汞鹽以及對羥基苯甲酸酯。在適當情況下，添加足夠量的防腐劑到該眼用組合物中，從而確保對使用期間由細菌和真菌引起的繼發性汙染的保護。在其他實施方案中，本發明的這些組合物不包括防腐劑。此類配製品對於佩戴接觸鏡的受試者會特別有用。本發明的組合物可能額外要求存在一種增溶劑，特別是如果該活性的或非活性的成分傾向於形成一種懸浮液或乳液。適合上文有關的組合物的增溶劑是，例如，選自下組，該組由以下項組成泰洛沙泊、脂肪酸甘油聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇酯、聚乙二醇、甘油醚、環糊精(例如a-、￠-或Y-環糊精，例如，烷基化的、羥烷基化的、羧基烷基化的或烷氧基羰基-烷基化的衍生物，或單-或二糖基-a-、￠-或Y-環糊精，單-或二麥芽糖基或Y-環糊精或潘糖殘基( panosyl)-環糊精)、聚山梨醇20、聚山梨酯80或那些化合物的混合物。一種尤其優選的增溶劑的特定實例是蓖麻油與環氧乙烷的反應產物，例如，商業產品Cremophor EU*+或Cremophor RH408。已經證明蓖麻油與環氧乙燒的反應產物是眼睛極好地耐受的特別好的增溶劑。另一種優選的增溶劑選自泰洛沙泊並且選自環糊精。使用的濃度尤其取決於活性成分的濃度。添加的量典型地足以溶解該活性成分。這些組合物可以進一步包括無毒的賦形劑，例如像，乳化劑，溼潤劑或填充劑，例如像，指定的聚乙二醇200、300、400和600，或指定的碳蠟1000、1500、4000、6000和10000。添加的賦形劑的量以及類型是根據具體要求，並且本領域普通技術人員將理解的是，可以存在於一種組合物中的賦形劑以及其他添加劑的類型以及量，使得該組合物與眼睛相容。還可以添加其他的化合物到本發明的組合物中，從而增加載體的粘性。粘度增強劑的實例包括但不局限於多糖(如透明質酸)及其鹽，硫酸軟骨素及其鹽，葡聚糖，纖維素族的不同聚合物；乙烯基聚合物；以及丙烯酸聚合物。本發明的示例性的眼用溶液包括本發明的肽或肽模擬物、氯化鈉、馬來酸二鈉、氯化苄烷銨、氫氧化鈉、鹽酸、無菌純淨水以及具有約7. 45的生理pH或者在眼部舒適範圍內的PH的溶液。為了最大舒適度，眼用溶液應當具有與淚液相同的pH或者該溶液的pH應當位於眼部舒適範圍內，即PH6. 6至7. 8之間。可替代地，該溶液可以包括本發明的肽或肽模擬物、氯化鈉、磷酸二氫鈉二水合物、氯化苄烷銨、氫氧化鈉、鹽酸、無菌純淨水以及具有如上文討論的PH的溶液。一種示例性的眼用溶液是
權利要求
1.一種藥用組合物，包括一個有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物。
2.根據權利要求1所述的一種藥用組合物，其中該乳鐵蛋白是牛乳鐵蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的一種藥用組合物，其中該多肽或肽模擬物主要由SEQID號1中示出的胺基酸序列組成。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的一種藥用組合物，其中該多肽或肽模擬物由乳鐵蛋白的C-小葉組成。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的一種藥用組合物，其中該功能活性片段是具有大於30個胺基酸序列長度並且與SEQ ID號I的連續序列具有大於65%的同一性的多肽或肽模擬物。
6.根據權利要求1或2所述的一種藥用組合物，其中該C-小葉通過整個乳鐵蛋白的蛋白水解獲得。
7.根據前述權利要求中任一項所述的一種藥用組合物，它處於一個適合向眼部給藥的形式。
8.根據前述權利要求中任一項所述的一種藥用組合物，它是一種水溶液。
9.根據前述權利要求中任一項所述的一種藥用組合物，其中該組合物處於滴眼劑的形式。
10.一種治療角膜創傷的方法，該方法包括向對其有需要的受試者給予根據前述權利要求中任一項所述的一種藥用組合物。
11.根據權利要求10所述的一種方法，其中該受試者是一個人類患者。
12.根據權利要求10或11所述的一種方法，其中該角膜創傷是一種上皮的角膜創傷。
13.根據權利要求12所述的一種方法，其中該上皮的角膜創傷是一種鹼誘導的創傷。
14.根據權利要求10至13中任一項所述的一種方法，其中該受試者已經被鑑定為具有一種角膜創傷。
全文摘要
本發明涉及包含乳鐵蛋白或其片段的藥用組合物以及它們在創傷，特別是角膜創傷的治療中的用途。本發明還提供了一種藥用組合物，包括一個有效量的主要由乳鐵蛋白的C-小葉或其功能活性片段或變體組成的多肽或肽模擬物。
文檔編號A61K38/40GK103037894SQ201180037142
公開日2013年4月10日 申請日期2011年7月1日 優先權日2010年7月1日
發明者班傑明·大衛·阿什比, 齊安·加勒特, 馬克·威爾科克斯 申請人:華柏恩視覺研究中心