TernatusineA在製備抗缺氧藥物中的應用的製作方法

2023-05-27 15:34:36

本發明涉及化合物Ternatusine A的新用途，尤其涉及Ternatusine A在製備抗缺氧藥物中的應用。

背景技術：

氧是人類及許多生物賴以生存的重要條件。低氧(Hypoxia)是指機體生命活動所需的氧不能得到充足的供給。氧和低氧是生命活動最重要的關鍵因素，是生命科學基本理論的重要課題。低氧的形成可分為三類：第一類是外界環境氧含量降低，使正常生理活動過程不能攝取足夠氧，如高原和航空缺氧；第二類是指因疾病等導致外界正常氧量不能充分到達機體內，造成心、腦和呼吸系統等的缺氧；第三類是機體活動所需氧消耗量，超過了生理動員能力，造成相對氧供給不足，常見於劇烈運動和超限量勞動。長期低氧是危害人體健康的重要隱患，嚴重者可危及生命。因此，低氧造成心、腦和呼吸系統等損傷已成為21世紀醫學界急待解決的主要問題之一。

本發明涉及的化合物Ternatusine A是一個2013年發表(Zhilai Zhan,et al.,Ternatusine A,a New Pyrrole Derivative with an Epoxyoxepino Ring from Ranunculus ternatus.ORGANIC LETTERS,2013,15(8):1970–1973.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型，目前的用途僅僅涉及抗流感病毒(Zhilai Zhan,et al.,Ternatusine A,a New Pyrrole Derivative with an Epoxyoxepino Ring from Ranunculus ternatus.ORGANIC LETTERS,2013,15(8):1970–1973.)，對於本發明涉及的Ternatusine A在製備抗缺氧藥物中的用途屬於首次公開，由於屬於全新的結構類型，而且其對於抗缺氧活性強得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實質性特點，同時用於抗缺氧顯然具有顯著的進步。

技術實現要素：

針對上述現有技術，本發明的目的在於發現了Ternatusine A具有顯著的抗缺氧作用，可用於防治缺氧損傷疾病，從而增加了Ternatusine A的應用領域。

本發明的Ternatusine A在製備抗缺氧藥物中的應用，是Ternatusine A在製備防治缺氧性損傷藥物中的應用。所述化合物Ternatusine A結構如式(Ⅰ)所示：

本發明涉及的Ternatusine A在製備抗缺氧藥物中的用途屬於首次公開，由於骨架類型屬於全新的骨架類型，而且其抗缺氧活性強得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實質性特點，同時用於抗缺氧顯然具有顯著的進步。

具體實施方式

本發明所涉及化合物Ternatusine A的製備方法參見文獻(Zhilai Zhan,et al.,Ternatusine A,a New Pyrrole Derivative with an Epoxyoxepino Ring from Ranunculus ternatus.ORGANIC LETTERS,2013,15(8):1970–1973.)

以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但本發明的保護範圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。

實施例1：本發明所涉及化合物Ternatusine A片劑的製備：

取5克化合物Ternatusine A，加入糊精195克，混勻，常規壓片機製成1000片。

實施例2：本發明所涉及化合物Ternatusine A膠囊劑的製備：

取5克化合物Ternatusine A，加入澱粉195克，混勻，裝膠囊製成1000粒。

下面通過藥效學實驗來進一步說明其藥物活性。

實驗例1：實驗一小鼠特異性心肌缺氧實驗

1、方法：75隻昆明小鼠，南京醫科大學實驗動物中心，體重(20±2)g。隨機分為5組，灌胃給藥。前2組給予0.3％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，後3組分別給予Ternatusine A 0.015、0.03g·Kg-1、鹽酸普萘洛爾0.03g·Kg-1，50min後，除第1組外，均腹腔注射異丙腎上腺素(ISO)15mg·Kg-1，15min後，將小鼠放入常壓缺氧裝置中，記錄小鼠死亡時間及耗氧量。

2、結果：

異丙腎上腺素可通過興奮心臟β受體，使心肌耗氧量增加。本實驗顯示，與溶媒對照組相比，Ternatusine A 0.015、0.03g·Kg-1能顯著對抗異丙腎上腺素(ISO)導致的心肌耗氧量增加(P<0.01)，同時延長小鼠缺氧密閉狀態下的存活時間(P<0.01)，結果見表1。

表1Ternatusine A對異丙腎上腺素致特異性缺氧小鼠的影響(x±s，n＝15)

與對照組比較，*P<0.01，與異丙腎上腺素組比較，#P<0.01

實驗二小鼠常壓窒息性缺氧實驗

1、方法：

60隻昆明小鼠，南京醫科大學實驗動物中心，體重(20±2)g。隨機分為4組，灌胃給藥。第1組給予0.3％羧甲

基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，第2組給予鹽酸普萘洛爾0.03g·Kg-1，pro組。第3、4組分別給予含Ternatusine A的CMC-Na溶液，濃度分別為0.015、0.03g·Kg-1。給藥50min後，置於廣口瓶中並蓋緊瓶塞(瓶內放置5g鈉石灰)。以呼吸停止為標誌，記錄小鼠存活時間。

2、結果：

與溶媒對照組相比，Ternatusine A 0.015、0.03g·Kg-1使小鼠在常壓密閉條件下的存活時間分別延長了28.12％和40.14％，差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)。

實驗三小鼠減壓缺氧實驗

1、方法：

40隻昆明小鼠，南京醫科大學實驗動物中心，體重(20±2)g。隨機分為4組，灌胃給藥。給藥組給予Ternatusine A，濃度分別為0.015、0.03g·Kg-1，對照組給予0.3％CMC-Na溶液，灌胃體積均為2ml·Kg-1。50min後，給藥組和對照組各取5隻，放入減壓裝置中，在26.7Kpa(相當於海拔約10000m)時停止減壓，保持此壓力不變，待動物死亡50％時，立即停止減壓，緩緩放入空氣，取出動物，記錄各組死亡及存活數目，重複操作至實驗完成。

2、結果：

Ternatusine A 0.015、0.030g·Kg-1使小鼠在減壓缺氧條件下的存活率由對照組的30％、20％提高至70％、80％，差異具有顯著性(P<0.05)。

實驗四對心肌細胞缺氧損傷的保護作用

1、方法：

(1)大鼠原代心肌細胞培養：新生1-3d的SD乳鼠取心室肌剪成約1mm 3大小組織塊，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA，與37℃下消化。除首次消化上清液棄去外，收集各次上清液中止消化，離心收集心肌細胞沉澱，加入含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養基和Brdu(終濃度0.1mmol/L)，輕輕吹打混勻，製成細胞懸液，接種於培養瓶中，於37℃、5％CO2培養箱中孵育70min，使絕大部分非心肌細胞貼壁。

吸取瓶內細胞懸液計數，調整細胞濃度為1×105個/ml，接種到24孔板，每孔1ml；96孔板，每孔200ul。48h細胞貼壁後，更換含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養基(不含Brdu)，以後每2天換液1次。

(2)心肌細胞缺氧模型建立：取培養4d的心肌細胞，換無血清DMEM/F-12培養基連續培養12h後，用無糖D-Hanks液(預先充入95％N2-5％CO 2混合氣飽和30min)替代正常培養基，而後迅速將培養板移入通有95％N2-5％CO2混合氣的缺氧裝置中，用測氧儀檢測排氣口氧濃度(<1％),37℃缺氧培養6h。

(3)實驗分組：實驗設空白對照組、缺氧模型組、缺氧+Ternatusine A A組(濃度0.024mg/ml)、B組(濃度0.012mg/ml)、C組(濃度0.006mg/ml)，共5組，每組6孔。除空白對照組外，其他各組均缺氧處理6h，正常對照組則於37℃、5％CO2培養箱中同步孵育6h。

(4)缺氧損傷心肌細胞MTT實驗：取出各組樣本，每孔加入20ul MTT(5g/L)，於37℃、5％CO2孵箱中繼續孵育4h，終止培養，倒板。加入150ul DMSO振搖15min，使結晶充分溶解，於測定波長570nm、參考波長630nm處，測定各孔吸光度(OD)值。

MTT代謝率(％)＝實驗組OD值/正常對照組OD值×100％

(5)生化指標檢測：取培養於24孔板的各組細胞培養上清液，用比色法測定LDH、CK活性，用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法測定細胞內MDA含量，具體檢測過程及操作方法按試劑盒說明書進行。

2、結果：

當心肌細胞因缺氧受到損傷時，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈受損，電子傳遞阻斷，ATP產生減少。琥珀酸脫氫酶是琥珀酸氧化呼吸鏈裡重要的複合酶之一，可催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，從而使FAD接受兩個氫原子生成FADH2，然後再將氫傳遞給COQ，生成COQH2，繼續呼吸鏈的電子傳遞過程。所以，琥珀酸脫氫酶的活性，可以反映心肌細胞缺氧損傷的程度。MTT實驗原理，就是利用琥珀酸脫氫酶可以催化噻唑蘭(MTT)生成紫紅色不溶性有色產物的特性，通過吸光度的測定來反映各組的細胞活性。本實驗結果顯示：濃度分別為0.024mg/ml、0.012mg/ml、0.006mg/ml Ternatusine A，MTT測得OD值顯著高於模型組，表明均可顯著增加細胞活性(P<0.01)，說明Ternatusine A能對抗缺氧對心肌細胞琥珀酸脫氫酶活性的損害，維持缺氧損害細胞的呼吸功能；缺氧導致細胞膜損傷時，細胞內LDH、CK將外漏，導致培養基中LDH、CK活性升高，本試驗顯示3個劑量組與模型組相比培養基中LDH、CK活性均明顯降低，表明Ternatusine A可在急性缺氧條件下，保持心肌細胞膜的完整性，上述結果見表2。

SOD反映了細胞清除自由基的能力，MDA反映了細胞膜脂質過氧化損害程度，本試驗的3個劑量組與模型組相比細胞內SOD活性升高，MDA水平產生下降，見表3，表明Ternatusine A可通過增強心肌細胞清除自由基的能力對抗缺氧導致的細胞膜氧化損傷。

表2 Ternatusine A對缺氧心肌細胞LDH、CK外漏量的影響(x±s，n＝6)

與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

表3 Ternatusine A對缺氧心肌細胞活力、SOD活性和MDA含量的影響(x±s，n＝8)

與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

結論：Ternatusine A可顯著提高窒息性缺氧和急性減壓缺氧小鼠的存活率和存活時間，減輕藥物特異性缺氧小鼠的心肌損傷，對體外培養的乳鼠心肌細胞和神經細胞缺氧損傷亦具有顯著的保護作用，提供了Ternatusine A在製備抗缺氧藥物中的用途。