鑑別細胞特異性靶結構的方法
2023-05-27 15:52:56 2
專利名稱：鑑別細胞特異性靶結構的方法
技術領域：
本發明涉及鑑別細胞特異性靶結構的方法。
鑑別細胞特異性靶結構對於驗證可能導致生物體內無法估計的作用的細胞—細胞相互作用是關鍵的。特別地，了解疾病特異性靶結構是開發有效的同時副作用很小的藥物的決定性必要條件。
現有技術已知免疫細胞(淋巴細胞)表達特異組合的蛋白質，也稱為蛋白質組合模式，簡稱PCP，其負責結合腦和肌肉組織中的血管的內皮樣細胞。其他蛋白質組合卻不導致與這種內皮樣細胞的結合。令人驚奇地，這些特異的組合是個體間一致的，總是顯示相同的結合功能。其結果是，所述特異性蛋白質組合模式似乎是細胞表面的個體間一致的淋巴細胞結合密碼，用於結合存在細胞特異性靶結構的器官特異性內皮樣細胞表面。細胞特異性靶結構因此可顯示相當特異的蛋白質組合模式。
浸潤性腫瘤細胞表面也顯示特異性蛋白質組合模式，其將導致目的明確的即器官選擇性浸潤行為。為此，這種蛋白質組合模式組成了可能的藥物的靶結構。
然而，開發這種高選擇性藥物的一不可避免的必要條件是這種靶結構的分子組成的知識。
現有技術中公開了鑑別靶結構的方法，其是基於分析疾病組織或細胞的基因表達模式，與健康組織或細胞的基因表達模式相比較，蛋白質表達模式和信使核糖核酸(mRNA)均意在提供新蛋白質的表觀、疾病組織或細胞中失控的或異常修飾的蛋白質的信息(例如F.Lottspeich/H.Zorbas；Bioanalytik；Spektrum Analytischer Verlag；Heidelberg，1998)。
但是，這些方法均使用細胞勻漿物，其通常基於幾千個或幾百萬個細胞，因為僅能通過這樣大量的細胞才能產生上述的表達模式。在細胞勻漿物中，細胞以破碎的開放形式存在，從而可通過生物化學方法進行抽提和分離。
這些現有技術方法的一個缺點是它們不適合鑑別蛋白質組合模式，因為這種蛋白質組合模式中的各個蛋白質組分由於產生細胞勻漿物和隨後的抽提步驟而完全分離，由此喪失了其細胞和組織拓撲學位置的相關信息。另外，破壞細胞區室使得不能獲得這些細胞區室內的蛋白質組合及其相關拓撲學相互關係的信息。
另外，現有技術方法另一缺點是它們不能在一個細胞水平進行分析，從而不能指出各個細胞的不同方式的蛋白質組合模式。再者，僅以少量存在的蛋白質不能由現有技術方法檢測。這在例如僅存在於少數致病性疾病特異性細胞中的蛋白質或特異性蛋白質組合的情況下尤其如此。
現有技術方法的另一缺點是製備組織或細胞的步驟從它們的取出或收集直至分離蛋白質的步驟可能受到各種可變的外部影響，不能控制和標準化。
因此，本發明的目的在於提供能夠鑑別細胞特異性組合模式的方法，其克服了上述現有技術中的缺點。
本發明目的通過鑑別細胞特異性靶結構的創造性方法而實現，該方法包括如下步驟(a)將包括至少一種標記分子的試劑溶液Y1自動沉積在含有來自細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜的物體X1上；(b)使試劑溶液Y1反應，並自動檢測用試劑溶液Y1標記的物體X1的至少一種標記模式；(c)在檢測該標記模式之前或之後除去所述試劑溶液Y1，並用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，…，N)重複步驟(a)和(b)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標記分子和/或至少另一種標記分子；(d)組合步驟(b)中檢測的標記模式以得到物體X1的複合分子組合模式；(e)用含有來自不同的細胞或組織樣品的其他細胞和/或其他細胞膜的至少另一種物體Xn(n＝2，3，…，N)重複步驟(a)至(d)；(f)確定物體X1和物體Xn的組合模式之間的至少一種差異；(g)鑑別其標記模式導致步驟(f)中確定的差異的至少一種試劑溶液Y1或Yn；(h)選擇來自不同於步驟(f)確定的物體Xn的細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜的勻漿物的由至少步驟(g)鑑別的試劑溶液Y1或Yn的標記分子結合的分子或分子複合物；以及(i)生物化學鑑定步驟(h)中選擇的分子或分子複合物。
本發明方法使得能對比性檢查來自不同細胞或組織樣品的各個細胞或細胞膜的蛋白質組合模式，由此可鑑別這樣的標記分子，其例如結合來自第一種組織或細胞樣品的第一個物體的特定蛋白質組合模式或這種蛋白質組合模式的特定區域，而同時不結合來自第二種組織或細胞樣品的第二個物體。通過這些鑑別的標記分子，可以用第一種組織和/或細胞樣品的樣品部分檢測或選擇並隨後鑑定那些由所鑑別的標記分子結合的蛋白質組合模式的分子區域(分子或分子複合物)。這使得能檢測一種蛋白質組合模式的分子組成，所述蛋白質模式中的分子排列以及該蛋白質組合模式在一種組織或細胞內的排列。
根據本發明的一特別優選的實施方案，在步驟(h)之前，步驟(h)所用的勻漿物通過分子或分子複合物分離方法、特別是蛋白質分離方法分成各個勻漿物成分，這將特別有利於從勻漿物選擇分子或分子複合物。
根據本發明的另一優選的實施方案，物體X1含有來自患者的細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜，且至少一種其他的物體Xn含有來自健康測試者的細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜。這將使得能鑑別疾病特異性靶結構或相應蛋白質組合模式，並且基於這些疾病特異性蛋白質組合模式的知識，將能開發高度特異性的藥物，這種藥物由於非常特異性因而幾乎無副作用。
根據本發明的另一優選的實施方案，所述方法包括如下平行步驟(x)製備物體X1和Xn所用的細胞和/或細胞膜所來自的每種所述細胞或組織樣品的每一樣品部分的蛋白質表達分布圖，並將物體X1相關的蛋白質表達分布圖與物體Xn相關的蛋白質表達分布圖相比較，這種比較將顯示至少一種差異。
另外，本發明方法在步驟(x)之後可包括如下步驟(y)檢查導致步驟(x)中確定的差異的至少一種蛋白質和/或至少一種蛋白質修飾是否結合步驟(g)中鑑別的試劑溶液Y1或Yn的所述至少一種標記分子。這將能夠確定通過比較蛋白質表達分布圖檢測的差異是否是與方法相關的假象(見上述)，或者它們是真正形成明顯差異，因為它們在本發明方法中也檢測到。本發明方法因此也可用作已知方法的一個重要補充。
根據本發明的另一特別優選的實施方案，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子與導致步驟(x)確定的差異的至少一種蛋白質和/或至少一種蛋白質修飾結合。使用已知的方法，例如可開發與通過比較蛋白質表達分布圖鑑別為靶結構區域的蛋白質或蛋白質修飾結合的抗體或配體。在本發明方法中使用這些抗體或配體將使得能檢查通過比較蛋白質表達分布圖確定的蛋白質是否將產生蛋白質組合模式。
另外，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子可以是螢光素綴合的，這種螢光素標記將使標記分子特別易於檢測。
另外，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子可以是抗體，該抗體可得自抗體文庫，該抗體文庫可以是原初型或非原初型。所謂的原初型抗體文庫是其抗體不顯示任何已知特異性的文庫，而非原初型抗體文庫的抗體將識別已知的分子如蛋白質或糖蛋白。因此使用非原初型文庫將提供即時信息，如抗體的性質及所述抗體與何種分子結合等。
另外，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子可以是配體。該配體可得自配體文庫，該配體文庫可以是原初型或非原初型。術語「原初型」和「非原初型」的定義與上述類似。
在步驟(c)除去試劑溶液之後，可進行一漂洗步驟，該步驟中將一種漂洗溶液沉積在物體X1上，一段時間後除去。這將防止新沉積的試劑溶液被先前施加的試劑溶液汙染。
有利地，步驟(d)可通過計算機輔助成象覆蓋圖進行。
所述方法可包括隨機重複的漂白循環，特別是在步驟(b)之後。這種漂白循環將防止已被檢測的標記在後續步驟中不再被檢測到。
本發明的詳細細節、特徵和優點將參照下述實施方案的描述而清楚。
在該實施方案中，組織或細胞樣品分成兩個樣品部分，第一個樣品部分作為起始材料產生勻漿物，用於根據已知方法生物化學鑑定蛋白質。特別應用如2D凝膠電泳的方法製備蛋白質表達分布圖。
第二個樣品部分用於製備組織切片或具有完整細胞的細胞製備物。當第二個樣品部分是組織塊時，製備其組織切片。但是當其是懸液中的細胞時，這些細胞將以完整形式施加於一個表面，特別是玻片上。以此方式獲得的第一個物體進行下述自動化步驟1.取具有非原初型抗體文庫的一或多個螢光素綴合抗體的第一種試劑溶液Y1；2.將所述試劑溶液Y1加至第一個物體上；3.在特定溫度、特別是室溫將所述物體與這一溶液Y1保溫；4.去除所述試劑溶液；
5.向物體上一次或多次滴加漂洗溶液，隨後除去所述漂洗溶液；6.將一種緩衝溶液加至所述第一個物體上；7.檢測螢光分布圖，如果使用多種螢光素則用選擇性螢光記錄濾波器照相，在這一步驟中，確定樣品中的一個抗體/多個抗體是否顯示結合信號及在何處顯示結合信號，類似地數字記錄第一個物體的細胞或組織的每一成象點或位點的陽性和陰性信號；8.再次施加漂洗溶液；9.通過螢光激髮漂白樣品，當不再能檢測到螢光時終止漂白步驟；10.除去所述漂洗溶液；11.取具有不同或相同抗體文庫的一或多個類似地螢光素綴合抗體的第二種試劑溶液Y2；12.將所述試劑溶液Y2加至第一個物體上。
通過重複步驟1-10而持續這一方法，所用試劑溶液Y3，Y4，Y5，…，Yn可含有非原初型或原初型文庫的抗體或配體。以此方式，可用完整的原初型文庫、完整的非原初型文庫或非原初型和原初型文庫混合體檢查一個相同物體。
每個方法循環(步驟1-10)通過記錄相應相差成象或鑑別性幹擾相差成象而終止。
基於步驟7中記錄的標記模式，通過計算機輔助成象覆蓋圖確定存在的信號組合和不存在的信號組合，兩者一起給出組合模式。
針對第一個物體確定的這一組合模式與其他樣品或測試者、細胞狀態或疾病的其他組合模式進行比較，所述其他組合模式通過用相同試劑溶液根據上述相同標準化步驟分析得到。
如果這一比較得到特異於所檢查樣品的獨特信號組合，或者如果得到特異於一種狀態、細胞類型、疾病或功能的信號組合，則這些信號組合基於特異的即選擇性分子相互作用，並因此鑑定了所述狀態、疾病、功能或細胞類型。隨後可將相應抗體或配體與所檢測的信號組合結合。
以此方式濾出的抗體和/或配體隨後可用於「捕獲」第一個樣品部分中的能特異地結合這些配體或抗體的蛋白質、糖蛋白或其他碳水化合物，為此，可使用已知的生物化學分析方法。如此發現的分子可以是單個的分子或不同分子的複合物，在每種情況下，它們均組成了高度特異的靶結構，特別用於開發藥物。
權利要求
1.一種用於鑑別細胞特異性靶結構的方法，所述方法包括如下步驟(a)將包括至少一種標記分子的試劑溶液Y1自動沉積在含有來自細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜的物體X1上；(b)使試劑溶液Y1反應，並自動檢測用試劑溶液Y1標記的物體X1的至少一種標記模式；(c)在檢測該標記模式之前或之後除去所述試劑溶液Y1，並用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，…，N)重複步驟(a)和(b)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標記分子和/或至少另一種標記分子；(d)組合步驟(b)中檢測的標記模式以得到物體X1的複合分子組合模式；(e)用含有來自不同的細胞或組織樣品的其他細胞和/或其他細胞膜的至少另一種物體Xn(n＝2，3，…，N)重複步驟(a)至(d)；(f)確定物體X1和物體Xn的組合模式之間的至少一種差異；(g)鑑別其標記模式導致步驟(f)中確定的差異的至少一種試劑溶液Y1或Yn；(h)選擇來自不同於步驟(f)確定的物體Xn的細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜的勻漿物中的由至少步驟(g)鑑別的試劑溶液Y1或Yn的標記分子結合的分子或分子複合物；以及(i)生物化學鑑定步驟(h)中選擇的分子或分子複合物。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(h)之前，步驟(h)所用的勻漿物通過分子或分子複合物分離方法、特別是蛋白質分離方法分成各個勻漿物成分。
3.前述任一項權利要求的方法，其中所述物體X1含有來自患者的細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜，且至少一種其他的物體Xn含有來自健康測試者的細胞或組織樣品的細胞和/或細胞膜。
4.前述任一項權利要求的方法，其中所述方法包括如下平行步驟(x)製備物體X1和Xn所用的細胞和/或細胞膜所來自的每種所述細胞或組織樣品的每一樣品部分的蛋白質表達分布圖，並將物體X1相關的蛋白質表達分布圖與物體Xn相關的蛋白質表達分布圖相比較，這種比較將顯示至少一種差異。
5.權利要求4的方法，其中所述方法在步驟(x)之後包括如下步驟(y)檢查導致步驟(x)中確定的差異的至少一種蛋白質和/或至少一種蛋白質修飾是否結合步驟(g)中鑑別的試劑溶液Y1或Yn的至少一種標記分子。
6.權利要求4的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子與導致步驟(x)檢測的差異的至少一種蛋白質和/或至少一種蛋白質修飾結合。
7.前述任一項權利要求的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子是螢光素綴合的。
8.前述任一項權利要求的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子是抗體。
9.權利要求8的方法，其中所述抗體得自抗體文庫，該抗體文庫是原初型或非原初型。
10.前述任一項權利要求的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標記分子是配體。
11.權利要求10的方法，其中所述配體得自配體文庫，該配體文庫是原初型或非原初型。
12.前述任一項權利要求的方法，其中在步驟(c)除去試劑溶液之後，進行一漂洗步驟，該步驟中將一種漂洗溶液沉積在物體X1上，一段時間後除去。
13.前述任一項權利要求的方法，其中步驟(d)通過計算機輔助成象覆蓋圖進行。
14.前述任一項權利要求的方法，其中所述方法包括隨機重複的漂白循環，特別是在步驟(b)之後。
全文摘要
本發明涉及鑑別細胞特異性靶結構的方法,特別是涉及鑑別細胞表面上的細胞特異性蛋白質組合模式的方法。
文檔編號G01N33/68GK1334463SQ01109720
公開日2002年2月6日 申請日期2001年3月23日 優先權日2000年3月24日
發明者瓦爾特·舒伯特 申請人:瓦爾特·舒伯特