一種肺癌患者血清特異性代謝產物譜及其建立方法
2023-05-27 16:07:51 2
一種肺癌患者血清特異性代謝產物譜及其建立方法
【專利摘要】本發明公開了一種肺癌患者血清特異性代謝產物譜及其建立方法，具體是基於肺癌患者的血清進行液相/氣相色譜質譜聯用代謝組學分析方法，包括：收集健康正常體檢者和肺癌患者手術前及術後7天空腹血標本，經處理後經色譜柱分離，並採用質譜檢測分析後提取並對齊儀器原始數據，採用多變量數據統計軟體建立數學模型對上述代謝物譜進行分析，比較正常人與肺癌患者代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。本發明方法可以全面、綜合地體現肺癌患者的代謝產物的變異狀況，可用於肺癌的早期診斷或為預後提供有利的技術支持。
【專利說明】一種肺癌患者血清特異性代謝產物譜及其建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及癌症，特別是肺癌。本發明還涉及代謝組學，特別是基於液相色譜質譜聯用和氣相色譜質譜聯用分析技術的代謝組學。本發明為早期診斷肺癌提供了依據，並提供了肺癌患者術前及術後血清中特異性代謝物譜以及相關特異性生物標記物。並且本發明還提供了建立肺癌患者術前及術後血清中特異性代謝物譜以及篩選相關特異性生物標記物的方法。
【背景技術】
[0002]肺癌是世界性的惡性腫瘤之一，居目前癌症死因的首位。近20年來，儘管有關肺癌的發生發展機理的研究和診療水平有明顯進步，但其5年生存率仍只有15%左右。原因是目前肺癌的早期診斷和治療方法遠不能滿足現實臨床工作所需，80%肺癌患者在就診時就處於晚期，已喪失手術機會，僅能行姑息治療，從而導致患者生存時間的縮短；如果能實現早期診斷，肺癌患者的5年生存率可達到85%。傳統的影像學和痰液脫落細胞學仍是目前篩查早期肺癌的主要手段，但存在一定漏診和誤診，病理學檢查雖然能夠診斷肺癌，但會對人體造成很大創傷。因此，早期篩查已成為肺癌防治的關鍵，探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的早期診斷技術等已是臨床醫學上的迫切需要。
[0003]代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學後系統生物學的另一重要研究內容，它是研究生物體系(細胞，組織或生物體)受外部刺激所產生的所有代謝產物變化的科學。與轉錄組學和蛋白質組學比較，代謝組學專門研究生物體系受外部刺激後所產生的所有代謝產物的變化，能夠更準確地反映生物體系的狀態，且位於系統生物學的最下遊，是生物體系整體功能或狀態最終結果的表現。代謝組學在發現潛在生物標誌物和改善肺癌早期診斷方面有獨特的前景，它藉助先進的分析儀器和統計工具對多種疾病進行標誌物檢測和研究，但用代謝組學方法研究肺癌的報導相對較少。牛豔潔等應用GC/MS分析肺癌和其它肺部疾病患者的血清及尿液小分子代謝產物，發現肺癌患者血清及尿液的代謝模式都出現明顯的分離趨勢。An等應用LC-MS分析肺癌和正常對照人群尿液的代謝產物，Chen等運用IHNMR分析肺癌患者組織中的代謝產物，分別發現了肺癌患者尿液和組織中的差異代謝產物。在代謝組學分析的各種技術手段中，液相色譜-四級杆-飛行時間質譜(LC-Q-T0F/MS)作為一種先進的分離分析技術，在眾多分析方法中脫穎而出，尤其對於非靶標代謝組學分析，其強大的定性分析能力使之被公認為最好的複雜樣品分析技術之一，已經被廣泛應用於代謝組學的研究領域中。
[0004]氣相色譜質譜聯用技術(GC/MS)現已被廣泛的應用於複雜組分的分離和鑑定，其結合了氣相色譜的高解析度和質譜的高靈敏度，是生物樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。GC/MS和液相色譜質譜聯用技術(LC/MS)當前也被廣泛的應用到代謝組學的研究中。色譜技術主要由流動相和固定相組成，樣本由流動相帶入色譜儀，在氣相色譜技術中，流動相即為氣體。當兩相作相對運動時，樣本不斷地在兩相之間進行分配，樣本各組分與固定相分子間發生吸附、溶解、結合或離子交換，使樣本各組分隨載氣在兩相之間反覆多次分配，由於樣本各組分之間的性質不同，流動相氣體攜帶的樣本中各種不同組分在色譜過程中的樣本中表現出不同的色譜行為，最終使那些分配係數只有微小差別的組分發生很大的分離效果，從而使不同組分得到完全分離。將分離後的各種組分用質譜進行檢測。並對檢測後得到的代謝產物進行對比分析，最後得到各組間的差異性代謝產物，利用支持向量機、人工神經網絡及主成分分析等生物信息學的方法選擇部分差異性代謝產物建立判別模型。
【發明內容】
[0005]針對現有肺癌診斷方法的有創傷性、漏診和誤診等缺點，本發明所要解決的問題是提供一種代謝組學技術為肺癌早期診斷提供依據，該方法具有靈敏度高，特異性好，無創等優點。
[0006]本發明採用液相色譜-四級杆-飛行時間質譜和氣相色譜質譜聯用技術的分析方法，具有強大的定性分析能力，對血清僅需簡單處理，成本低廉，適合大規模篩查，並且同樣具有良好的特異性和靈敏度，具有非常好的應用前景。
[0007]本發明為早期診斷肺癌提供了依據。通過尋找肺癌患者術前及術後血清中特異性代謝物譜以及相關特異性生物標記物，建立檢測該生物標記物的方法。
[0008]本發明運用基於液相色譜-四級杆-飛行時間質譜聯用分析和氣相色譜質譜聯用技術對肺癌患者和健康人血漿中的代謝物質進行定性定量分析，通過考察肺癌患者和正常人的代謝指紋圖譜變化，將健康人及肺癌患者很好的區分開，並從中找出潛在的腫瘤標誌物。同時檢測肺癌術前和肺癌術後患者的代謝指紋圖譜變化，以期通過考察患者血清中的代謝物變化，總結肺癌腫瘤復發和預後的相關代謝標誌物，為今後肺癌患者的預後判別提供理論依據。
[0009]本發明提供了一種代謝組學技術在肺癌疾病中的應用，其步驟為:
[0010](I)樣本的收集與處理:收集臨床病人的血清樣本；樣本經過甲醇沉澱蛋白。
[0011](2)液相色譜-四級杆-飛行時間質譜和氣相色譜質譜測定:採用基於液相色譜質譜和氣相色譜質譜聯用的方法得到血清中的代謝物譜，代謝物譜經過處理得到各個峰的峰高或者峰面積以及質量數和保留時間等數據。
[0012](3)模式識別分析血清中代謝物譜:上述數據採用多變量數據統計軟體Simca-Pll.0，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立數學模型，對步驟(2)中產生的代謝物譜進行分析，比較正常人與肺癌患者手術前後代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
[0013](4)生物標記物:發現了一組血清中的生物標記物用於肺癌疾病的診斷或者為肺癌早期診斷提供依據。
[0014]隨著代謝組學的發展，越來越多的研究發現，分子質量小於1000的內源性小分子代謝物更加具有早期診斷價值，作為一種新的檢測工具，代謝組學方法已成為腫瘤標誌物檢測中的研究熱點。研究表明，正常人與肺癌病人的代謝譜存在明顯的差異，代謝組學技術有助於肺癌等疾病的診斷。
[0015]1.檢測血清中的代謝物譜和相關的生物標記物，與目前常用傳統的影像學、痰液脫落細胞學及病理學檢查等侵入性方法相比，具有無創，方便快捷的特點。[0016]2.準確反映肺癌患者與正常人的代謝譜差異，特異性高。
[0017]不希望受任何理論的限制，發明人指出這些生物標誌物是存在於人體中的內源性化合物。通過本發明所述的方法對受試者血清的代謝物譜進行分析，代謝物譜中的質量數值指示相應生物標誌物的存在及在代謝物譜中的對應位置。同時，肺癌患者的所述生物標誌物在其代謝物譜中表現出一定的含量範圍值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1.液相色譜質譜聯用主成分分析得分圖。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術前組，圓形代表肺癌術後組。
[0019]圖2.氣相色譜質譜聯用主成分分析得分圖。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術前組，圓形代表肺癌術後組。
[0020]圖3.液相色譜質譜聯用PLS-DA模型。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術前組，圓形代表肺癌術後組。
[0021]圖4.氣相色譜質譜聯用PLS-DA模型。菱形代表正常組，正方形代表肺癌術前組，圓形代表肺癌術後組。
[0022]圖5.液相色譜質譜聯用OPLS得分圖。形代表正常組，正方形代表肺癌術前組，圓形代表肺癌術後組。
[0023]圖6.氣相色譜質譜聯用OPLS得分圖。形代表正常組，正方形代表肺癌術前組，圓形代表肺癌術後組。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例進一步描述本發明。
[0025]I樣本收集:收集健康正常體檢者和肺癌患者手術前及術後7天空腹血標本各5mL於無菌促凝BD真空採血管中，2500rpm，4°C離心5min，取上層血清，保存於_80°C冰箱中待用。正常組共收集30份血清樣本，肺癌術前及術後組各收集30份血清樣本。
[0026]2液相色譜質譜測定樣本的處理:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 μ L的樣本加入300 μ L甲醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min ;所有樣本進行冷凍離心(12000rpm, 4°C，15min)，取200 μ L上清液，轉入進樣小瓶備用。
[0027]3氣相色譜質譜測定樣本的處理:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 μ L的樣本加入300 μ L甲醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min ;所有樣本進行冷凍離心(12000rpm, 4°C，15min)，取150 μ L上清液，轉入玻璃衍生小瓶，加入IOyL的內標溶液(二氯苯丙氨酸，濃度為0.02mg/mL)，置溫和氮氣下吹乾4°C ;向玻璃衍生小瓶中加入30 μ L的20mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，強烈震蕩30s，於37°C肟化反應90min ;取出後加入30 μ L的BSTFA (含1%TMCS)的衍生試劑，於70°C反應60min。取出樣本，室溫放置30min，轉入進樣小瓶備用。
[0028]4液相色譜質譜聯用分析
[0029]儀器設備:Agilent,1290InfinityLC, 6530UHDandAccurate-MassQ-T0F/MS
[0030]色譜條件:色譜柱:AgilentC18色譜柱(IOOmmX 2.1mm，1.8 μ m)，流速 0.4mL/min，柱溫為40°C，流動相A:0.1%甲酸-7jC，B:0.1%甲酸-乙腈，進樣量為4 μ L，自動進樣器溫度 4°C。梯度洗脫程序:0 ?2min，5% B，2 ?17min，5%?95% B, 17 ?19min，95% B。
[0031]質譜條件:ESI離子源，採用正離子掃描模式，以氮氣作為霧化、錐孔氣。毛細管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度100°C ;脫溶劑氣溫度350°C、反向錐孔氣流50L/h、脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V。離子掃描時間0.03s，掃描時間間隔0.02s，數據採集範圍:50_1000m/z。
[0032]5氣相色譜質譜聯用分析
[0033]儀器設備:Agilent7890A/5975CGC/MS系統
[0034]氣相色譜-質譜條件:毛細管色譜柱為AgilentJ&WScientific公司的HP_5ms(30mX0.25mmX0.25ym)0儀器參數設定為:進樣口溫度280°C，EI離子源溫度230°C，四極杆溫度150°C，高純氦氣(純度大於99.999%)作為載氣，不分流進樣，進樣量l.0yL。升溫程序為:初始溫度80°C，維持2min，10°C /min的速度升至320°C，並維持6min。採用全掃描模式進行質譜檢測，質譜檢測範圍為50-550 (m/z)。
[0035]6數據處理
[0036]6.1液相色譜質譜測定
[0037]米用AgilentMassHunter 工作站(QualitativeAnalysisVB03.01，Agilent, USA)記錄每個血清樣本的總離子流色譜圖(TIC)進行可視化檢查。在R軟體平臺下採用自寫的程序代碼提取原始數據信號(峰識別和積分)，然後進行保留時間校正、峰對齊和反卷積分析(質譜碎片歸屬)，最後在Excel軟體中進行後期編輯，將結果組織為二維數據矩陣，包括變量(保留時間Rt，質荷比m/z)、觀察量(樣本)和積分面積。將編輯後的數據矩陣導入Simca-Pll.0軟體進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方分析(0PLS)。按照OPLS的VIP值挖掘差異代謝物質，運用兩樣本的t檢驗分別比較正常對照組和肺癌組的代謝產物水平。以肺癌組與正常對照組的均值之比的對數值(以2為底)fold(B/A)表示該物質在肺癌患者的相對水平,正號表示該物質在肺癌患者中升高，負號表示該物質在肺癌患者中降低。差異性代謝物的定性方法為:搜索代謝物二級質譜資料庫(METLIN)，比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量mass。
[0038]6.2氣相色譜質譜測定
[0039]米用AgilentMassHunter 工作站(QualitativeAnalysisVB03.01，Agilent, USA)記錄每個血清樣本的總離子流色譜圖(TIC)進行可視化檢查。在R軟體平臺下採用自寫的程序代碼提取原始數據信號(峰識別和積分)，然後進行保留時間校正、峰對齊和反卷積分析(質譜碎片歸屬)，最後在Excel軟體中進行後期編輯，將結果組織為二維數據矩陣，包括變量(保留時間Rt，質荷比m/z)、觀察量(樣本)和積分面積。將編輯後的數據矩陣導入Simca-Pll.0軟體進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方分析(0PLS)。按照OPLS的VIP值挖掘差異代謝物質，運用兩樣本的t檢驗分別比較正常對照組和肺癌組的代謝產物水平。以肺癌組與正常對照組的均值之比的對數值(以2為底)fold(B/A)表示該物質在肺癌患者的相對水平,正號表示該物質在肺癌患者中升高，負號表示該物質在肺癌患者中降低。差異性代謝物的定性方法為:搜索自建的標準物質資料庫和NIST商業資料庫(比較質譜和色譜保留時間RT)。
[0040]7代謝譜分析和潛在的生物標誌物
[0041]7.1主成分分析(PCA)[0042]7.1.1液相色譜質譜聯用測定
[0043]主成分分析作為無監督式學習方法，可以真實反映樣本的聚類情況。對3組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得7個主成分(PC)，R2X=0.582，Q2=0.425。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此本項目建立的模型可以應用於可視化觀察3組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖la，模式下PCA得分圖均可以看出大部分樣本都在95%的置信區間，並且三組樣本之間可以明顯區分，並且組內樣本比較集中，整體模型比較理想。
[0044]對正常對照組和肺癌術前組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得4個主成分(PC)，R2X=0.556，Q2=0.419。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此本項目建立的模型可以應用於可視化觀察2組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖lb。
[0045]對正常對照組和肺癌術後組組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得7個主成分(PC)，R2X=0.552，Q2=0.319。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此本項目建立的模型可以應用於可視化觀察3組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖lc。
[0046]對肺癌術前組和肺癌術後組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得7個主成分(PC)，R2X=0.62，Q2=0.4。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此本項目建立的模型可以應用於可視化觀察2組之間的代謝譜差異。PCA得分圖(Scoresplot)如圖1d0
[0047]7.1.2氣相色譜質譜聯用測定
[0048]首先對整體數據進行評價，檢查是否達到代謝組學分析的標準。Simca-P軟體中，數據均採用默認的UV格式化和平均中心化處理，以獲得更加可靠且更加直觀的結果。軟體對整體數據進行模型擬合分析，血清共獲得10個主成分，R2X=0.801，Q2=0.652。PCA得分圖(Scoresplot)如圖2a所示；樣本大部分處於95%置信區間內，因此當前PCA模型能可靠地用於解釋樣本之間的代謝差異。從圖1a中可以看出，正常對照組與肺癌術前組明顯通過第2主成分劃分為上下兩部分，而肺癌術後組大部分處於上方，即其分析結果更接近正常對照組。通過非監督式的統計分析，初步可以判斷其術後的代謝狀態更趨於正常。
[0049]對正常對照組和肺癌術前組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得8個主成分，R2X=0.787，Q2=0.64。PCA得分圖(Scoresplot)如圖2b所示，樣本基本處於95%置信區間內。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此當前PCA模型能可靠地用於解釋兩組樣本之間的代謝差異。
[0050]對正常對照組和肺癌術後組組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得9個主成分，R2X=0.805，Q2=0.627。PCA得分圖(Scoresplot)如圖2c所示，樣本基本處於95%置信區間內。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此當前PCA模型能可靠地用於解釋兩組樣本之間的代謝差異。
[0051]對肺癌術前組和肺癌術後組樣本正模式下得到的數據進行PCA分析，共獲得12個主成分，R2X=0.843，Q2=0.626。PCA得分圖如圖2d所示，樣本基本處於95%置信區間內。一般來說R2X值大於0.4就表示該模型可靠，因此當前PCA模型能可靠地用於解釋兩組樣本之間的代謝差異。[0052]7.2偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)
[0053]7.2.1液相色譜質譜聯用測定
[0054]進一步採用有監督式方法PLS-DA進行建模分析，模型的參數R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的預測率，一般來說此參數大於0.4即表明此模型可靠。結果正常對照組和肺癌術前組正模式下得到4個主成分，R2X=0.527，R2Y=0.991，Q2=0.938，PLS-DA得分圖如圖3a所示。
[0055]正常對照組和肺癌術後組正模式下得到4個主成分，R2X=0.412，R2Y=0.992，Q2=0.935，PLS-DA得分圖如圖3b所示。
[0056]肺癌術前組和肺癌術後組正模式下得到2個主成分，R2X=0.432，R2Y=0.906，Q2=0.875，PLS-DA得分圖如圖3c所示。
[0057]7.2.2氣相色譜質譜聯用測定
[0058]進一步採用有監督式方法PLS-DA進行建模分析，正常對照組和肺癌術前組共獲得3個主成分，R2X=0.533，R2Y=0.854，Q2=0.747，R2Y及Q2值大於0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖4a所示。
[0059]正常對照組和肺癌術後組正模式下共獲得3個主成分，R2X=0.518，R2Y=0.883，Q2=0.758，R2Y及Q2值大於0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖4b所示。
[0060]肺癌術前組和肺癌術後組正模式下獲得5個主成分，R2X=0.605, R2Y=0.956，Q2=0.707，R2Y及Q2值大於0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖4c所示。
[0061]7.3正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)
[0062]7.3.1液相色譜質譜聯用測定
[0063]採用OPLS-DA方法來區分正常對照組、肺癌術前組和肺癌術後組，進一步通過VIP值和t檢驗篩選潛在標誌物。正常對照組和肺癌術前組正模式下得到I個主成分和I個正交成分，R2X=0.468，R2Y=0.936，Q2=0.898，其得分圖如圖5a所示，通過OPLS分析，得分圖的效果上看，兩組樣本在正離子模式下能夠很好的分離，並且分正常對照組的樣本處在主成分I (PCl)的左側，而肺癌術前組樣本處在主成分I (PCl)的右側。
[0064]正常對照組和肺癌術後組正模式下得到I個主成分和I個正交成分，R2X=0.326，R2Y=0.937，Q2=0.899，其得分圖如圖5b所示:通過OPLS分析，得分圖的效果上看，兩組樣本在正離子模式下能夠很好的分離，並且正常對照組組的樣本處在主成分I(PCl)的左側，而肺癌術後組樣本處在主成分I (PCl)的右側。
[0065]肺癌術前組和肺癌術後組正模式下得到I個主成分和I個正交成分，R2X=0.432，R2Y=0.906，Q2=0.865，其得分圖如圖5c所示:通過OPLS分析，得分圖的效果上看，兩組樣本在正離子模式下能夠很好的分離，並且肺癌術前組的樣本處在主成分I (PCl)的左側，而肺癌術後組樣本處在主成分I (PCl)的右側。
[0066]7.3.2氣相色譜質譜聯用測定
[0067]採用OPLS-DA方法來區分正常對照組、肺癌術前組和肺癌術後組，進一步通過VIP值和t檢驗篩選潛在標誌物。正常對照組和肺癌術前組正模式下共獲得I個主成分和I個正交成分，R2X=0.46，R2Y=0.797，Q2=0.745，R2Y及Q2值大於0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖6a所示。
[0068]正常對照組和肺癌術後組正模式下共獲得I個主成分和2個正交成分，R2X=0.518，R2Y=0.883，Q2=0.767，R2Y及Q2值大於0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖6b所
/Jn ο
[0069]肺癌術前組和肺癌術後組正模式下共獲得I個主成分和I個正交成分，R2X=0.457，R2Y=0.68，Q2=0.57，R2Y及Q2值大於0.4就表示該模型可靠，得分圖如圖6c所示。
[0070]7.4潛在生物標記物
[0071]7.4.1液相色譜質譜聯用測定
[0072]根據模式識別模型OPLS-DA的VIP值篩選潛在標誌物，在OPLS-DA模型中提取VIP值大於I的變量，以及結合P值小於0.05的變量。以肺癌術前/術後組與正常對照組的均值之比的對數值(以2為底)fold表示該物質在肺癌患者的相對水平，正號表示該物質在肺癌患者中升高，負號表示該物質在肺癌患者中降低。差異性代謝物的定性方法為:搜索在線資料庫METLIN (比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量mass)。正常對照組和肺癌術前組之間的差異代謝物如表1所示，肺癌術前組和肺癌術後組之間的差異代謝物如表2所示，正常對照組和肺癌術後組之間的差異代謝物如表3所示。對兩兩比較的差異代謝物進行綜合分析，發現肺癌術前組、術後組與正常對照組相比，有多種代謝物的水平表現明顯異常，包括:鞘氨醇，氯磷膽鹼，花生四烯乙醇胺，Y -亞油酸，十二烯二酸，阿魏酸，硫酸普拉睪酮，半乳糖醇磷酸，泛醌10和膽紅素。
[0073]表1正常對照組和肺癌術前組之間的差異代謝物
[0074]
【權利要求】
1.一種基於肺癌患者血清的液相/氣相色譜質譜聯用代謝組學分析方法，包括: (1)樣品製備:收集臨床病人與正常人的血清樣本，經處理去除蛋白質等大分子後準備進行色譜檢測分析； (2)液相色譜質譜和氣相色譜質譜分析測定:採用基於液相色譜質譜和氣相色譜質譜的方法得到血清中的代謝物譜，並對代謝譜進行分析； (3)模式識別分析血清中代謝物譜:上述數據採用多變量數據統計軟體建立數學模型，對步驟(2)中產生的代謝物譜進行分析，比較正常人與肺癌患者代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
2.根據權利要求1所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(1)中的處理包括樣本經過甲醇蛋白沉澱。
3.根據權利要求1所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(2)中代謝物譜經過處理得到原始數據， 所述原始數據優選地是各個峰的峰高或者峰面積以及質量數和保留時間等數據。
4.根據權利要求4所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，對原始數據進行峰檢測和峰匹配，優選地採用R軟體平臺下採用自寫的程序代碼進行所述峰檢測和峰匹配。
5.根據權利要求1所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(3)中的多變量數據統計軟體Simca-Pll.0，選用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立數學模型，比較正常人與肺癌患者手術前後代謝物譜的差異，從而確定特異性代謝物譜。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(1)中的樣本收集具體為:收集健康正常體檢者和肺癌患者手術前及術後7天空腹血標本各5 mL於無菌促凝BD真空採血管中，2500 rpm，4°C離心5 min，取上層血清，保存於-80 °C冰箱中待用。
7.根據權利要求1-5中任一項所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(1)中進行液相色譜質譜測定樣本的處理為:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 UL的樣本加入300 UL甲醇，渦漩震蕩30 s,4 °C靜置20 min ;所有樣本進行冷凍離心(12000rpm,4 °C, 15 min)，取200 μ L上清液，轉入進樣小瓶備用。
8.根據權利要求1-5中任一項所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(1)中進行氣相色譜質譜測定樣本的處理為:將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取100 UL的樣本加入300 μ L甲醇，渦漩震蕩30 s,4 °C靜置20 min ;所有樣本進行冷凍離心(12000rpm,4 °C, 15 min)，取150 μ L上清液，轉入玻璃衍生小瓶，加入10 yL的內標溶液(二氯苯丙氨酸，濃度為0.02 mg/mL)，置溫和氮氣下吹乾4 °C;向玻璃衍生小瓶中加入30 yL的20 mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，強烈震蕩30 S，於37 1:肟化反應90 min ;取出後加入30μ L的BSTFA (含1%TMCS)的衍生試劑，於70 °C反應60 min，取出樣本，室溫放置30 min,轉入進樣小瓶備用。
9.根據權利要求1-5中任一項所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(2)中液相色譜-質譜條件為:Agilent C18色譜柱(100 mm X 2.1 mm, 1.8 μπι),流速0.4 mL/min，柱溫為40 °C，流動相A:0.1%甲酸-水，B:0.1%甲酸-乙腈，進樣量為4 yL，自動進樣器溫度4 °C ；ESI離子源，採用正離子掃描模式，以氮氣作為霧化、錐孔氣；毛細管電壓4kV、錐孔電壓35 kV、離子源溫度100 °C;脫溶劑氣溫度350 °C、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣600 L/h、萃取錐孔4 V;離子掃描時間0.03 S，掃描時間間隔0.02 S，數據採集範圍:50-1000 m/zo
10.根據權利要求1-5中任一項所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(2)中氣相色譜-質譜條件為:毛細管色譜柱為Agilent J&ff Scientific公司的HP_5ms(30 mX 0.25 mm X 0.25 μ m)，儀器參數設定為:進樣口溫度280 °C，EI離子源溫度230 °C，四極杆溫度150 °C，高純氦氣(純度大於99.999%)作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0 μ L ;升溫程序為:初始溫度80 °C，維持2 min, 10 °C/min的速度升至320 °C，並維持6 min ;採用全掃描模式進行質譜檢測，質譜檢測範圍為50-550 (m/z)。
11.根據權利要求1-5中任一項所述的代謝組學分析方法，其特徵在於，所述步驟(2)中米用 Agilent MassHunter 工作站(Qualitative Analysis VB 03.01, Agilent, USA)記錄每個血清樣本的總離子流色譜圖(TIC)進行可視化檢查，在R軟體平臺下採用自寫的程序代碼提取原始數據信號(峰識別和積分)，然後進行保留時間校正、峰對齊和反卷積分析(質譜碎片歸屬)，最後在Excel軟體中進行後期編輯，將結果組織為二維數據矩陣，包括變量(保留時間Rt，質荷比m/z )、觀察量(樣本)和積分面積。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的代謝組學分析方法建立的肺癌患者血清特異性代謝產物譜。
13.根據權利要求12中任一項所述的代謝組學分析方法建立的肺癌患者血清特異性代謝產物譜的用途。`
【文檔編號】G01N30/06GK103616450SQ201310629077
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】鍾婧, 鄭淑鶯, 戴利成 申請人:湖州市中心醫院