脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法及用其生產反式4-羥基-l-脯氨酸的高效轉化方法
2023-05-27 12:06:11 3
脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法及用其生產反式4-羥基-l-脯氨酸的高效轉化方法
【專利摘要】本發明公開了生物轉化法生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，具體包括重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法和將L-脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化體系中助劑的種類、濃度及轉化條件，為建立生物轉化法工業化生產反式-4-羥基-L-脯氨酸工藝提供了重要科學依據。
【專利說明】脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法及用其生產反式4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於屬於酶工程和生物催化領域，具體涉及一種重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法和利用脯氨酸羥化酶將L-脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法。
【背景技術】
[0002]輕脯氨酸(Hydroxy pro line, Hyp)不屬於常見20種胺基酸,是脯氨酸羥基化修飾的結果，羥基通常加在第4或是第3位碳上。由於有兩個不對稱的碳原子，所以羥脯氨酸有4種立體異構體。分別為反式-4-羥基-L-脯氨酸，順式-4-羥基-L-脯氨酸，反式-3-羥基-L-脯氨酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。
[0003]反式-4-羥基-L-脯氨酸在哺乳動物細胞中主要存在於膠原蛋白中，對形成穩定的三股螺旋膠原蛋白具十分重要的作用，可使結締組織的彈性和韌性得到加強(Shibasaki, T.Mori, H.0zaki, A.2000)。體液羥脯氨酸平衡失調會造成許多疾病，例如營養不良，老年痴呆症，牙齒、骨骼中的軟骨和韌帶組織的韌性減弱以及組織纖維化疾病等(Rajesh N.Kalaria, Andrea B.Pax.1995)。
[0004]近年來，羥脯氨酸的研究和開發已引起醫藥、生化、食品及美容業等方面的廣泛關注。在醫藥方面，由於其具有多種生理功能與獨特的生物活性，可作為各種軟組織疾病的藥物，如結締組織受損、風溼性關節炎等，又可加快傷口癒合，治療各種皮膚疾病。反式-4-羥基-L-脯氨酸易於衍生化，藥理活性多樣，近年來逐漸被應用到原料藥手性中間體領域，用於合成新一代培南類抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等多種新創製藥物的合成。由於其具有抗氧化、抗輻射的作用，在美容業方面，可以作為化妝品添加劑。目前，世界用量為500噸/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趨勢。
[0005]目前，我國反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產主要採用化學水解提取工藝，以動物膠原蛋白為原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程製備，「三廢」排放量大、汙染嚴重，能耗高、純度低及生產成本高。因此，利用節能、汙染少的生物催化法生產反式-4-羥基-L-脯氨酸勢在必行。
[0006]生物轉化法是指利用細菌或真菌細胞中的酶將底物分子轉化為功能產物的過程。反式-4-羥基-L-脯氨酸生物轉化法是指利用L-脯氨酸為底物，在Fe2+、α -酮戊二酸和L-抗壞血酸存在的條件下，利用L-脯氨酸羥化酶將L-脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸。反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因(GenBank ID:D78338.1)長816核苷酸，編碼272個胺基酸殘基，GC含量為66.67%，研究發現，該酶蛋白主要以包涵體形式出現(ChristianKleina, Wolfgang Huttela.2011)。
[0007] 2011年，德國科學家Christian Klein對含有伴因子的大腸桿菌工程菌轉化生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉化條件進行了優化，在37°C下，140 rpm培養重組工程菌為0D600=1.1 - 1.4時，加入0.2禮IPTG誘導表達，隨後，再加入6.25mM L-脯氨酸，0.5 mM硫酸亞鐵，8 mM α-酮戊二酸，28°C條件下，140rpm培養72h後，測得的將脯氨酸轉化為反式-4-L-脯氨酸的轉化率僅為61%，底物投入量和轉化效率都比較低，不適合工業化生產反式-4-L-脯氨酸。
[0008]另外，對於工程菌株的酶表達，多採用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)做誘導劑，其誘導效果雖好，但價格昂貴，不適合工業化生產。
[0009]在前期研究中，我們發現一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段，可用於高效轉化生產反式-4-羥基-L-脯氨酸。較全長酶，該基因片段編碼酶活性高，轉化效率高，轉化反應時間短，具有較好的工業應用前景(已公布專利號為:CN 103146720A 和 CN 103275998 A)。
[0010]在前期研究中，採用的轉化體系為:200mM L-脯氨酸、200mM α -酮戊二酸、6mM硫酸亞鐵、6mM L-抗壞血酸、80mM pH 6.5 MES緩衝液及1% Nonidet P-40。其中NonidetP-40助劑也存在價格昂貴，不適合工業化生產的缺點。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在於解決現有技術存在的問題提供一種脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，同時提供用其生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，使該方法具備成本低、轉化效率高，轉化反應時間短，工業應用前景好的優點。
[0012]為實現上述目的，本發明一方面提供了一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，具體採用下述技術方案為:
一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，其為將含重組質粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株的單克隆接種至下述發酵培養基直接自誘導培養，所述培養基為:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L,七水硫酸亞鐵0.1 g/L,乳糖6-10 g/L。
[0013]進一步的，所述重組質粒的工程菌株採用如下方法構建:將反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因的截短片段構建到表達載體PET-M-3C中，獲得重組質粒PET-M-SC-Pfflyd1^257,並將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21_CodonPlus (DE3)中，獲得了重組大腸桿菌工程菌。
[0014]進一步的，所述自誘導培養條件如下:溫度24-37°C，轉速為140-220 rpm，培養時間為 20-24h。
[0015]進一步的，還包括離心收集菌體的步驟。
[0016]本發明的另一方面提供了一種利用上述脯氨酸羥化酶生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，其採用如下技術方案:
一種利用脯氨酸羥化酶生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，將菌體懸浮於轉化反應液中對L-脯氨酸進行轉化,所述菌體與轉化液的比例為lg: 8-18mL,轉化液包括MES 緩衝液 80-240m M，L-脯氨酸 180_250mM、α -酮戊二酸 180_250mM，FeSO4 6_9mM，L-抗壞血酸l_5mM和助劑，所述助劑選自20-80mg/L的頭孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS、
0.5%_4%(v/v)TritonX-100、或 0.1-1.5mg/mL 溶菌酶中的一種。
[0017]進一步的，所述轉化液ρΗ6.3-6.8，反應溫度為24-28°C，轉速為140-220 rpm，時間為 60-72h。[0018]進一步的，還包括離心去除菌體的步驟。
[0019]與現有技術相比，本發明取得的有益效果為:
本發明通過對重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達條件和將L-脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化體系中助劑的種類、濃度及轉化條件進行了優化，本發明提供的方法不僅成本低、轉化效率高，而且轉化反應時間短，具有較好的工業應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1自誘導培養基乳糖濃度的優化；
圖2轉化反應體系中頭孢替胺(TTCT)抗生素濃度的優化；
圖3轉化反應體系中SDS濃度的優化；
圖4轉化反應體系中TritonX-100濃度的優化；
圖5轉化反應體系中溶菌酶濃度的優化；
圖6轉化反應條件優化的響應面實驗結果。
【具體實施方式】
[0021]下面將結合附圖1-6和具體實施例對本發明進行進一步詳細的說明。
[0022]實施例1a重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法
將含重組質粒的工程菌株的單克隆接種至發酵培養基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1g/L和乳糖8 g/L，直接於28°C、140rpm搖床自誘導培養24小時後，當菌液濃度為OD6c?達到2-2.5時，離心收集菌體。
[0023] 實施例1b重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法
將含重組質粒的工程菌株的單克隆接種至發酵培養基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1g/L和乳糖8 g/L，直接於24°C、220rpm搖床自誘導培養20小時後，當菌液濃度為OD6c?達到2-2.5時，離心收集菌體。
[0024]實施例1c重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法
將含重組質粒的工程菌株的單克隆接種至發酵培養基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1g/L和乳糖8 g/L，直接於37°C、180rpm搖床自誘導培養22小時後，當菌液濃度為OD6c?達到2-2.5時，離心收集菌體。
[0025]試驗例I重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達條件的考察
與實施例1不同之處在於培養基中乳糖的濃度不同，分別設計乳糖濃度為4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L(編號為試驗例la、試驗例lb、實施例la、試驗例lc、試驗例Id)的五組試驗來測量不同自誘導培養基獲得菌體L-脯氨酸羥化酶活性。具體測量方法如下:各組分別稱取Ig菌體懸浮於IOmL轉化反應液中[200mM L-脯氨酸、200mM α -酮戊二酸、6mM 硫酸亞鐵、6mM L-抗壞血酸、80mM MES 緩衝液(pH 6.5)、1% Nonidet Ρ-40]，於 28°C、140rpm振蕩反應72h，離心去除菌體，通過HPLC檢測上清中反式_4_羥基-L-脯氨酸的生成情況來反映不同自誘導培養基獲得菌體L-脯氨酸羥化酶活性，具體見表1:
表1不同自誘導培養基獲得菌體的L-羥脯氨酸的轉化率
【權利要求】
1.一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，其特徵在於:其為將含重組質粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株的單克隆接種至下述發酵培養基直接自誘導培養，所述培養基為:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1 g/L，乳糖6-10 g/L。
2.根據權利要求1所述的一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，其特徵在於:所述重組質粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株採用如下方法構建:將反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因的截短片段(/7也構建到表達載體pET-M-3C中，獲得重組質粒PET-M-SC-Pfflyc^257，並將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21-CodonPlus (DE3)中，獲得了重組大腸桿菌工程菌。
3.根據權利要求1所述的一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，其特徵在於:所述自誘導培養條件如下:溫度24-37°C，轉速為140-220 rpm，培養時間為20-24h。
4.根據權利要求1-3任一項所述的一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法，其特徵在於:還包括離心收集菌體的步驟。
5.一種利用權利要求1-3任一項所述重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導表達方法得到的脯氨酸羥化酶生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，其特徵在於:將菌體懸浮於轉化反應液中對L-脯氨酸進行轉化，所述菌體與轉化液的比例為lg: 8-18mL,轉化液包括MES緩衝液80_240mM，L-脯氨酸180_250mM、α -酮戊二酸.180-250mM, FeSO4 6_9mM，L-抗壞血酸l_5mM和助劑，所述助劑選自20_80mg/L的頭孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS,0.5%_4%(v/v)TritonX-100、或0.1-1.5mg/mL溶菌酶中的一種。
6.根據權利要求5所述的一種利用脯氨酸羥化酶生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，其特徵在於:所述轉化液PH6.3-6.8，反應溫度為24-28°C，轉速為140-220 rpm,時間為60-72h。
7.根據權利要求6所述的一種利用脯氨酸羥化酶生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉化方法，其特徵在於:還包括離心去除菌體的步驟。
【文檔編號】C12P13/24GK103911355SQ201410029052
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】李瑋, 張金秀, 薛張偉, 王立安, 李存會, 鞠建松, 李天雲, 張琳琳, 陳嬌嬌, 張慶 申請人:河北博倫特藥業有限公司, 石家莊萬尚醫藥科技有限公司, 河北師範大學