一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法
2023-05-27 13:44:01 2
專利名稱：一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法
技術領域：
本發明涉及藥物化合物檢測領域，特別涉及一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法。
背景技術：
克瀉靈片由苦豆草為原料，按中成藥片劑的常規工藝製成的能夠清熱解毒，祛風燥溼的中藥製劑，臨床用於治療溼熱洩瀉，痢疾。苦豆草為豆科植物苦豆子Sophora alopecuroides L.的乾燥地上部分，又稱苦甘草、苦豆根，其化學成分主要有喹諾裡西啶類生物鹼和黃酮兩大類，其生物鹼主要包括槐定鹼、苦參鹼、槐果鹼、苦豆鹼、槐胺鹼、金雀花鹼、氧化苦參鹼及N-甲基金雀花鹼等。目前，生物鹼的含量測定有重量法、酸鹼滴定法、酸性染料分光光度法等，衛生部藥品標準中藥成分製劑》第十八冊WS3-B-3408-98記載的克瀉靈片的質量標準中，生物鹼的測定方法為重量法，該方法專屬性較差，所用試劑毒性大，準確性和重複性差，且操作繁瑣。因此，提供一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法，具有現實意義。
發明內容
有鑑於此，本發明提供一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法。在該方法提供的高效液相色譜條件下，分別檢測不同濃度的對照品溶液和待測品溶液的峰面積，以對照品溶液的濃度和峰面積製作標準曲線，用待測品溶液的峰面積與標準曲線比較，獲得待測品溶液中生物鹼的濃度。該檢測方法精密度高，穩定性、重複性、準確度較好，避免了毒性試劑的使用。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案本發明提供了一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法，包括如下步驟取生物鹼對照品製備對照品溶液；取克瀉靈片製備供試品溶液；取不同濃度的對照品溶液經高效液相色譜法獲得對照品峰面積，以所述對照品溶液的濃度和所述對照品峰面積製作標準曲線；取供試品溶液，經高效液相色譜法獲得供試品峰面積，與所述標準曲線比較，獲得供試品溶液中生物鹼含量；所述高效液相色譜法的流動相包括酸的水溶液、乙腈、無水乙醇，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述無水乙醇的體積比為90 98 1 5 1 5;所述酸選自磷酸、醋酸、 甲酸。外標法是儀器分析常用的方法之一，比較法的一種。外標法在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標物與被測組分同為一種物質但要求它有一定的純度，分析時外標物的濃度應與被測物濃度相接近，以利於定量分析的準確性。
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外標法在操作和計算上可分為校正曲線法和用校正因子求算法。校正曲線法是用已知不同含量的標樣系列等量進樣分析，然後做出響應信號與含量之間的關係曲線，也就是校正曲線。定量分析樣品時，在測校正曲線相同條件下進同等樣量的等測樣品，從色譜圖上測出峰高或峰面積，在從校正曲線查出樣品的含量。作為優選，所述酸的水溶液中酸與水的體積比為1 3 100。作為優選，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述無水乙醇的體積比為90 96 2 5 · 2 「 5 ο作為優選，所述高效液相色譜法的檢測波長為205 280nm。作為優選，所述高效液相色譜法的柱溫為25 35°C。作為優選，所述高效液相色譜法的色譜柱為普通C18柱。作為優選，所述對照品溶液的製備方法為稱取槐定鹼、苦參鹼、氧化苦參鹼，加甲醇製得濃度為13 142 μ g/mL的對照品溶液。作為優選，所述供試品溶液的製備方法為取克瀉靈片，加入甲醇後超聲提取，製得供試品溶液，以mg/mL計，所述克瀉靈片與所述甲醇的質量體積比為100 40 50。作為優選，所述超聲提取時間為20 40min。作為優選，所述生物鹼包括槐定鹼、苦參鹼、氧化苦參鹼。本發明提供一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法，在該方法提供的高效液相色譜條件下，分別檢測不同濃度的對照品溶液和待測品溶液的峰面積，以對照品溶液的濃度和峰面積製作標準曲線，用待測品溶液的峰面積與標準曲線比較，獲得待測品溶液中生物鹼的濃度。該檢測方法精密度高，穩定性、重複性、準確度較好，避免了毒性試劑的使用。
圖1示實施例1中1號量瓶中對照品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間， 縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 050min的峰為苦參鹼，保留時間為9. 166min的峰為槐定鹼，保留時間為13. 374min的峰為氧化苦參鹼；圖2示實施例1中2號量瓶中對照品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間， 縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 074min的峰為苦參鹼，保留時間為9. 209min的峰為槐定鹼，保留時間為13. 381min的峰為氧化苦參鹼；圖3示實施例1中3號量瓶中對照品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間， 縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 084min的峰為苦參鹼，保留時間為9. 229min的峰為槐定鹼，保留時間為13. 394min的峰為氧化苦參鹼；圖4示實施例1中4號量瓶中對照品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間， 縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 090min的峰為苦參鹼，保留時間為9. 25Imin的峰為槐定鹼，保留時間為13. 370min的峰為氧化苦參鹼；圖5示實施例1中5號量瓶中對照品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間， 縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 076min的峰為苦參鹼，保留時間為9. 191min的峰為槐定鹼，保留時間為13. 332min的峰為氧化苦參鹼；圖6示實施例1中6號量瓶中對照品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間， 縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 05Imin的峰為苦參鹼，保留時間為9. 174min的峰為
4槐定鹼，保留時間為13. 276min的峰為氧化苦參鹼；圖7示實施例1中苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)，縱坐標為峰面積(mAU)；圖8示實施例1中槐定鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)，縱坐標為峰面積(mAU)；圖9示實施例1中氧化苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量 (μ g)，縱坐標為峰面積(mAU)；圖10示實施例2中苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)， 縱坐標為峰面積(mAU)；圖11示實施例2中槐定鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)， 縱坐標為峰面積(mAU)；圖12示實施例2中氧化苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量 (μ g)，縱坐標為峰面積(mAU)；圖13示實施例3中苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)， 縱坐標為峰面積(mAU)；圖14示實施例3中槐定鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)， 縱坐標為峰面積(mAU)；圖15示實施例3中氧化苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量 (μ g)，縱坐標為峰面積(mAU)；圖16示實施例4中苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)， 縱坐標為峰面積(mAU)；圖17示實施例4中槐定鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量(μ g)， 縱坐標為峰面積(mAU)；圖18示實施例4中氧化苦參鹼的對照品溶液標準曲線，其中，橫坐標為加樣量 (μ g)，縱坐標為峰面積(mAU)；圖19示實施例1中供試品溶液的高效液相色譜圖；橫坐標為保留時間，縱坐標為峰面積；其中，保留時間為8. 170min的峰為苦參鹼，保留時間為9. 266min的峰為槐定鹼，保留時間為13. 561min的峰為氧化苦參鹼。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案本發明提供了一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法，包括如下步驟取生物鹼對照品製備對照品溶液；取克瀉靈片製備供試品溶液；
取不同濃度的對照品溶液經高效液相色譜法獲得對照品峰面積，以所述對照品溶液的濃度和所述對照品峰面積製作標準曲線；取供試品溶液，經高效液相色譜法獲得供試品峰面積，與所述標準曲線比較，獲得供試品溶液中生物鹼含量；所述高效液相色譜法的流動相包括酸的水溶液、乙腈、無水乙醇，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述無水乙醇的體積比為90 98 1 5 1 5;所述酸選自磷酸、醋酸、 甲酸。作為優選，所述酸的水溶液中酸與水的體積比為1 3 100。作為優選，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述無水乙醇的體積比為90 96 2 5 · 2 「 5 ο作為優選，所述高效液相色譜法的檢測波長為205 280nm。作為優選，所述高效液相色譜法的柱溫為25 35°C。作為優選，所述高效液相色譜法的色譜柱為普通C18柱。作為優選，所述對照品溶液的製備方法為稱取槐定鹼、苦參鹼、氧化苦參鹼，加甲醇製得濃度為13 142 μ g/mL的對照品溶液。作為優選，所述供試品溶液的製備方法為取克瀉靈片，加入甲醇後超聲提取，製得供試品溶液，以mg/mL計，所述克瀉靈片與所述甲醇的質量體積比為100 40 50。作為優選，所述超聲提取時間為20 40min。作為優選，所述生物鹼包括槐定鹼、苦參鹼、氧化苦參鹼。本發明提供一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法。在該方法提供的高效液相色譜條件下，分別檢測不同濃度的對照品溶液和待測品溶液的峰面積，以對照品溶液的濃度和峰面積製作標準曲線，用待測品溶液的峰面積與標準曲線比較，獲得待測品溶液中生物鹼的濃度。該檢測方法精密度高，穩定性、重複性、準確度較好，避免了毒性試劑的使用。本發明提供的檢測方法中所用試劑均可由市場購得。其中，克瀉靈片購自廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司，槐定鹼購自中國藥品生物製品檢定所(批號為 110784-200303)，苦參鹼購自中國藥品生物製品檢定所(批號為110805-200508)，氧化苦參鹼購自中國藥品生物製品檢定所(批號為110780-200506)。下面結合實施例，進一步闡述本發明實施例1對照品溶液的製備精密稱取槐定鹼10. 60mg,苦參鹼8. 46mg,氧化苦參鹼 9. 13mg,置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，得到混合對照品母液，精密吸取lmL、 2mL、3mL、4mL、5mL混合對照品母液分別置於25mL的1至5號量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，製得濃度梯度的混和對照品溶液；精密吸取2mL混合對照品母液置於6號量瓶中；1，2，3，4，5，6 號量瓶中苦參鹼濃度分別是 13. 536 μ g/mL, 27. 072 μ g/mL, 40. 608 μ g/ mL，54. 144 μ g/mL,67. 68 μ g/mL, 112. 8 μ g/mL ；1，2，3，4，5，6 號量瓶中槐定鹼濃度分別是 16. 96 μ g/mL,33. 92 μ g/mL,50. 88 μ g/mL,67. 84 μ g/mL,84. 8 μ g/mL,141. 333 μ g/mL ；1， 2,3,4,5,6 號量瓶中氧化苦參鹼濃度分別是 14. 608 μ g/mL, 29. 216 μ g/mL, 43. 824 μ g/mL, 58. 432 μ g/mL,73. 04 μ g/mL,121. 733 μ g/mL。供試品溶液的製備精密稱取克瀉靈片10片，除去薄膜衣，研細、混勻，取約0. Ig,精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超聲提取30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，即得。色譜柱選用普通C18柱，用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為3%磷酸、 甲酸、醋酸水溶液-乙腈-無水乙醇(94 3 3；)為流動相；檢測波長為205nm;柱溫 30 "C。將對照品溶液經高效液相色譜法檢測，獲得峰面積，如圖1至圖6所示，以對照品溶液的濃度和對照品峰面積製作標準曲線。苦參鹼、槐定鹼、氧化苦參鹼的進樣量、峰面積見表1，標準曲線如圖7至圖9所示。表1苦參鹼、槐定鹼、氧化苦參鹼的進樣量、峰面積
量瓶編號苦參鹼槐定鹼氧化苦參鹼進樣量 (μ8)峰面積 (mAU)進樣量 (Rg)峰面積 (mAU)進樣量 (Rg)峰面積 (mAU)10.0676896. 40.0848119. 70. 07304143. 820.13536205. 90.1696273. 50. 14608288. 530.20304321. 70. 2544443. 90. 21912447. 840.27072430. 40.3392597. 80. 29216596. 550. 3384548. 20. 424783. 50.3652766. 360. 564947. 90.7066671361. 60.6086671324. 7苦參鹼的標準曲線為:y= 1716. 9χ_26· 815 (R2 = 0. 9996)；槐定鹼的標準曲線為:y= 2005. 4χ_64· 665 (R2 = 0. 9994)；氧化苦參鹼的標準曲線為:y= 2212. 6χ_33· 885 (R2 = 0. 9992)。將供試品溶液經高效液相色譜法檢測，獲得峰面積，如圖19所示，與標準曲線對比，獲得供試品溶液中生物鹼的濃度。供試品溶液中，苦參鹼含量為8. 46mg/g，槐定鹼含量為27. 82mg/g，氧化苦參鹼含量為7. 46mg/g,生物鹼總含量為43. 73mg/g,每片克瀉靈片中總生物鹼含量為17. 93mg/片。實施例2對照品溶液的製備精密稱取槐定鹼8. 34mg,苦參鹼8. 25mg,氧化苦參鹼8. 08mg, 置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，得到混合對照品母液，精密吸取lmL、2mL、3mL、 4mL、5mL混合對照品母液分別置於25mL的1至5號量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，製得濃度梯度的混和對照品溶液；精密吸取2mL混合對照品母液置於6號量瓶中；1，2，3，4， 5,6 號量瓶中苦參鹼濃度分別是 13. 344 μ g/mL, 26. 688μ g/mL,40. 032μ g/mL,53. 376 μ g/ mL，66. 72 μ g/mL, 111. 2 μ g/mL ；1，2，3，4，5，6 號量瓶中槐定鹼濃度分別是 13. 2 μ g/mL, 26. 4 μ g/mL, 39. 6 μ g/mL, 52. 8 μ g/mL, 66 μ g/mL, 110 μ g/mL ；1，2，3，4，5，6 號量瓶中氧化苦參鹼濃度分別是 12. 928 μ g/mL, 25. 856 μ g/mL, 38. 784 μ g/mL, 51. 712 μ g/mL, 64. 64 μ g/ mL,107. 733 μ g/mL。
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供試品溶液的製備精密稱取克瀉靈片10片，除去薄膜衣，研細、混勻，取約0. Ig, 精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超聲提取25分鐘，放冷，加甲醇至40mL，搖勻，過濾，即得。色譜柱選用普通C18柱，用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為2%磷酸、 甲酸、醋酸水溶液-乙腈-無水乙醇(90 5 5；)為流動相；檢測波長為280nm;柱溫 25 °C。將對照品溶液經高效液相色譜法檢測，獲得峰面積，以對照品溶液的濃度和對照品峰面積製作標準曲線。苦參鹼、槐定鹼、氧化苦參鹼的進樣量、峰面積見表2，標準曲線如圖10至圖12所
7J\ ο表2苦參鹼、槐定鹼、氧化苦參鹼的進樣量、峰面積
權利要求
1.一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法，其特徵在於，包括如下步驟 取生物鹼對照品製備對照品溶液；取克瀉靈片製備供試品溶液；取不同濃度的對照品溶液經高效液相色譜法獲得對照品峰面積，以所述對照品溶液的濃度和所述對照品峰面積製作標準曲線；取供試品溶液，經高效液相色譜法獲得供試品峰面積，與所述標準曲線比較，獲得供試品溶液中生物鹼含量；所述高效液相色譜法的流動相包括酸的水溶液、乙腈、無水乙醇，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述無水乙醇的體積比為90 98 1 5 1 5 ；所述酸選自磷酸、醋酸、甲酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述酸的水溶液中酸與水的體積比為1 3 100。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述無水乙醇的體積比為90 96 2 5 2 5。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述高效液相色譜法的檢測波長為205 280nm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述高效液相色譜法的柱溫為25 35 "C。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述高效液相色譜法的色譜柱為普通C18柱。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述對照品溶液的製備方法為稱取槐定鹼、苦參鹼、氧化苦參鹼，加甲醇製得濃度為13 142μ g/mL的對照品溶液。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述供試品溶液的製備方法為取克瀉靈片，加入甲醇後超聲提取，製得供試品溶液，以mg/mL計，所述克瀉靈片與所述甲醇的質量體積比為100 40 50。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述超聲提取時間為20 40min。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物鹼包括槐定鹼、苦參鹼、氧化苦參鹼。
全文摘要
本發明涉及藥物化合物檢測領域，特別涉及一種檢測克瀉靈片中生物鹼含量的方法。在該方法提供的高效液相色譜條件下，分別檢測不同濃度的對照品溶液和待測品溶液的峰面積，以對照品溶液的濃度和峰面積製作標準曲線，用待測品溶液的峰面積與標準曲線比較，獲得待測品溶液中生物鹼的濃度。該檢測方法精密度高，穩定性、重複性、準確度較好，避免了毒性試劑的使用。
文檔編號G01N30/88GK102507828SQ20111036422
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者姚小華, 李楚源, 覃仁安 申請人:廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司