一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的snp標記及其應用的製作方法
2023-05-27 13:48:06 2
一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的snp標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的SNP標記及其應用。該SNP位於蛻皮抑制激素基因MIH（AY310313.1）的3』‐UTR區，具體位置為3088bp處，鹼基變異信息為SNP?A3088T?T>G。性狀‐基因型關聯性分析結果表明，該SNP變異與河蟹的性早熟性狀之間存在著顯著的相關性，其中GG基因型河蟹個體表現出性早熟性狀的風險性較TT基因型個體高2.175倍。本發明河蟹性早熟相關基因的多態性SNP標記，可用於後續與河蟹性早熟性狀相關的遺傳育種研究。
【專利說明】一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的SNP標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學檢測【技術領域】，涉及一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的SNP標記及其應用。
【背景技術】
[0002]中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又稱河蟹,是我國重要的甲殼類經濟動物。長期以來，河蟹養殖過程中普遍存在著一齡蟹種的性早熟問題。性早熟幼蟹在培育過程中性腺當年發育成熟，這些性早熟蟹種不能順利蛻殼，體重增長緩慢甚至停滯，絕大多數在翌年4~5月期間死亡，不能再繼續飼養至2齡成蟹規格。性早熟一齡蟹的大量存在不僅造成餌料的巨大浪費，而且由於其外形與大規格蟹種較為相似，如果在挑選蟹種時不慎將性早熟個體用於後續商品蟹養殖，將給生產帶來巨大的損失。目前的研究認為，河蟹性早熟的發生機制非常複雜，可能與內在的遺傳因素和多種外部環境因素有關，但是其形成的確切機理還不清楚。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的SNP標記。
[0004]本發明的另一目的是提供該SNP標記的應用。
[0005]本發明的目的可通過如下技術方案實現:
[0006]一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的SNP標記，該SNP位於蛻皮抑制激素基因MIH(Genbank登錄號AY310313)的3』 - UTR區，具體位置為3088bp處，鹼基變異信息為SNPA3088T T>G。
[0007]其中，所述的SNP標記，蛻皮抑制激素基因MIH3088bp處SNP位點GG基因型河蟹個體表現出性早熟性狀的風險性顯著高於TT基因型個體。
[0008]本發明所述的SNP標記在預測中華絨螯蟹性早熟風險中的應用。
[0009]一種預測中華絨螯蟹性早熟風險的方法，通過檢測所述的SNP標記，預測中華絨螯蟹性早熟風險。
[0010]所述的預測中華絨螯蟹性早熟風險的方法，優選通過檢測所述的SNP標記，該位點GG基因型河蟹個體表現出性早熟性狀的風險性較TT基因型個體顯著提高，從而預測中華絨螯蟹性早熟風險。
[0011]所述的預測中華絨螯蟹性早熟風險的方法，可進一步優選不同河蟹個體的基因組DNA,採用以PCR為基礎的限制性片段長度多態法PCR - RFLP對不同個體進行基因分型，從而預測中華絨螯蟹性早熟風險。
[0012]所述的PCR-RFLP中使用的PCR上遊引物為SEQ ID N0.1，下遊引物為SEQ IDN0.2 ；使用的限制性內切酶為SspI限制性內切酶。
[0013]所述的PCR - RFLP中，酶切後進行電泳，GG基因在359b p處有特異性條帶，TT基因型在192bp和167bp處有特異性條帶，TG基因型在359bp、192bp以及167bp處有特異性條帶。
[0014]所述的預測中華絨螯蟹性早熟風險的方法，還可進一步優選提取不同河蟹個體的基因組DNA，PCR擴增含有所述SNP標記的基因片段，通過直接測序獲得所述SNP標記的序列，從而預測中華絨螯蟹性早熟風險。
[0015]用於鑑定本發明所述的SNP標記的PCR引物，上遊引物為SEQ ID N0.1，下遊引物為 SEQ ID N0.2。
[0016]有益效果:
[0017]本發明提供了一種與河蟹性早熟性狀密切相關的SNP標記及其應用，其位於編碼河蟹MIH基因序列的3』 -UTR區(T>G ;3088bp處)。性狀-基因型關聯性分析結果表明，該SNP變異與河蟹的性早熟性狀之間存在著顯著的相關性，其中GG基因型河蟹個體表現出性早熟性狀的風險性較TT基因型個體高2.175倍。本發明河蟹性早熟相關基因的多態性SNP標記，可用於後續與河蟹性早熟性狀相關的遺傳育種研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1中華絨螯蟹SNP A3088T位點基因分型情況。
[0019]圖1A.酶切後電泳圖譜及測序結果,其中泳道I為marker ;泳道2為GG基因
[0020]型(359bp);泳道3和5為TT基因型(192bp ;167bp);泳道4為TG基因型(359bp ；
[0021]192bp以及167bp)。圖1B.為三種基因型個體MIH基因PCR擴增產物經直接測序所得到的測序圖譜。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023](I)檢測方法:採用常規的酚氯仿法提取不同河蟹個體的基因組DNA，採用以PCR為基礎的限制性片段長度多態法(PCR - RFLP)對不同個體進行基因分型；
[0024]PCR反應條件:
[0025]PCR 產物長度為 359bp，PCR 擴增引物為:F:CGTTCACCTCGTTTACCCAC(SEQ ID N0.1)；R:CCCTCAAACAGCTTTAGAGTT (SEQ ID N0.2)。PCR 反應體系為 20 μ L，其中包括:10XPCRBuffer2.5μ L,Mg2+ (2.5mmol/L)2.5 μ L, dNTP (2.5mmol/L)l.7 μ L，正反向引物各 0.75 μ L(10nmol/L),Taq酶0.2U,DNA模板I μ L (50ng/μ L),去離子雙蒸水補足體積。PCR反應共計30個循環，循環前95°C預變性5min，每個循環包括94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s ;循環結束後於72°C延伸5min。擴增產物用I %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測合格後用於酶切。
[0026]酶切條件:
[0027]採用SspI限制性內切酶對上述PCR產物進行酶切，酶切體系為10 μ L，其中包括10 X NEB緩衝液I μ L，PCR產物5 μ L，SspI0.25 μ L，去離子雙蒸水補足體積。37°C酶切過夜後用3%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行分離，確定個體的不同基因型。
[0028]基因分型結果如圖1所示。
[0029] (2)不同基因型個體與性早熟性狀的相關性[0030]表1SNP A3088T與河蟹性早熟性狀相關性的兩階段相關研究
[0031]
【權利要求】
1.一種與中華絨螯蟹性早熟性狀相關的SNP標記，其特徵在於該SNP位於蛻皮抑制激素基因MIH的3』 - UTR區，具體位置為3088bp處，鹼基變異信息為SNPA3088T T>G。
2.根據權利要求1所述的SNP標記，其特徵在於蛻皮抑制激素基因MIH3088bp處SNP位點GG基因型河蟹個體表現出性早熟性狀的風險性顯著高於TT基因型個體。
3.權利要求1或2所述的SNP標記在預測中華絨螯蟹性早熟風險中的應用。
4.一種預測中華絨螯蟹性早熟風險的方法，其特徵在於通過檢測權利要求1所述的SNP標記，預測中華絨螯蟹性早熟風險。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於通過檢測權利要求1所述的SNP標記，該位點GG基因型河蟹個體表現出性早熟性狀的風險性較TT基因型個體顯著提高，從而預測中華絨螯蟹性早熟風險。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於提取不同河蟹個體的基因組DNA，採用以PCR為基礎的限制性片段長度多態法PCR-RFLP對不同個體進行基因分型，從而預測中華絨螯蟹性早熟風險。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的PCR- RFLP中使用的PCR上遊引物為SEQ ID N0.1，下遊引物為SEQ ID N0.2 ;使用的限制性內切酶為SspI限制性內切酶。
8.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於提取不同河蟹個體的基因組DNA，PCR擴增含有所述SNP標記的基因片段，通過直接測序獲得所述SNP標記的序列，從而預測中華絨螯蟹性早熟風險。
9.用於鑑定權利要求1所述的SNP標記的PCR引物，其特徵在於上遊引物為SEQIDN0.1，下遊引物為SEQ ID N0.2。
【文檔編號】C12N15/11GK104004750SQ201410119022
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】許志強, 李躍華, 趙沐子, 丁淑燕, 潘建林 申請人:江蘇省淡水水產研究所