基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法和試劑盒的製作方法
2023-05-27 14:44:21 1
專利名稱：基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬分子生物學檢測領域，涉及基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法和試劑盒。具體的是從基因改造農作物及其加工產品中提取脫氧核糖核酸(DNA)，應用多聚酶鏈式反應(PCR)和限制性內切酶(R.E.)分析技術(酶切技術)對基因改造農作物及其加工產品中的基因改造成分(genetically modifiedorganisms，GMOs)進行定性檢測的方法和試劑盒。
1983年，世界上第一例基因改造植物問世，這標明生物技術的發展已經可以使植物遵從人類的意願生長。1994年，美國Calgene公司研製的基因改造番茄成為世界上第一個獲準商品化生產的基因改造農作物。此後，在美國、加拿大、阿根廷和歐洲，先後有數十種基因改造農作物獲準商品化生產，這主要包括基因改造的大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯、西葫蘆、番木瓜、番茄和南瓜等。在我國，目前有五種基因改造農作物獲準商品化生產，其中三種為基因改造的番茄，另外兩種是基因改造的甜椒和棉花，還有一種基因改造的花卉——矮牽牛也獲準了商品化生產。
基因改造農作物由於具有抗蟲、抗除草劑、抗病毒以及品質改善等優點而得到大面積推廣。據統計，去年全球基因改造農作物的種植面積已達到4000萬公頃，其中超過半數為基因改造的大豆，另有近30％為基因改造的玉米。作為全球最大的基因改造農作物種植國，美國出口的食品中約60％含有基因改造成分。
1998年英國的一位科學家實驗發現，老鼠食用了基因改造的馬鈴薯後，體重減輕，器官出現異常，且免疫系統受到破壞。這在英國引起了軒然大波，儘管後來其所在的實驗室對這一結果進行了更正，但基因改造農作物及其加工產品的安全性依然引起人們的質疑儘管目前沒有直接的證據顯示基因改造農作物及其加工產品對人類有現實的危害，但科學家們也無法證明已食用的基因改造農作物及其加工產品對人類的未來不存在危害。
因此，在西方發達國家，尤其是歐洲，人們對基因改造農作物及其加工產品表現出了強烈的牴觸情緒。政府也採取相應的措施，對基因改造農作物及其加工產品進行檢測並加以標籤，標明是否含有基因改造成份及其含量，使消費者具有知情權，可以自由選擇基因改造農作物及其加工產品。
但由於在基因改造農作物中基因改造成分在農作物的基因組中所佔的比例是非常微小的，且由於產品加工過程中的高溫高壓處理對基因的破壞，以及所加工的產品中存在的抑制因子，因此對基因改造農作物及其加工產品中基因改造成分的檢測是很困難的。
在國外，科學家們正在努力研究與改進基因改造農作物及其加工產品的檢測方法，以適應種類繁多的基因改造農作物及其加工產品。而在我國，目前政府還未出臺與基因改造農作物及其加工產品相關的法規和管理標準，在基因改造農作物及其加工產品的檢測方法上還是空白。
本發明的目的旨在提供通用的對基因改造農作物及其加工產品進行定性檢測的方法及試劑盒。
本發明的基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法如下標準的檢測流程包括四個部分基因改造農作物及其加工產品DNA的提取；利用PCR技術擴增出基因改造成分；利用酶切技術對所擴增的基因改造成分進行鑑定；對檢測結果進行科學的通用的解釋。
為防止PCR結果對樣品的汙染，DNA的提取、PCR的準備、PCR的運行及PCR結果的分析要分開不同的房間進行。
第一步、基因改造農作物及其加工產品DNA的提取(一)待測樣品的前處理粉末狀的待測樣品不需處理；非粉末狀的固體待測樣品要處理成粉末狀；液態待測樣品採用冷凍乾燥法乾燥並研碎成粉末狀；新鮮的待測樣品清洗乾淨即可。如對于堅硬的食品，例如黃豆、玉米粒等，採用食品加工機或研缽進行研磨，成為粉末狀；對於固體的非堅硬食品，例如餅乾、薯片等，採用研缽或鑷子將其搗碎，成為粉末狀；對於固體的粉末狀的食品，例如豆粉、麵粉等，可直接用於分析；對於半固體的食品，例如番茄醬、腐乳等，採用冷凍乾燥法，並研碎成為粉末；對於液體的食品，例如豆奶、啤酒等，採用冷凍乾燥法，並研碎成為粉末；對於新鮮的食品，例如新鮮的馬鈴薯、番茄等，可清洗乾淨後，直接用於分析。
在進行前處理的時候，每處理完一個樣品，要及時清理器具，採用洗滌液、酒精及高溫滅菌等方式，防止食品的交叉汙染。
(二)提取待測樣品的DNA，方法一如下1.稱取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)離心管中，緩慢加入700微升(μl)CTAB提取緩衝液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/LCTAB，pH8.0，使用前加入體積比為1％的巰基乙醇)，充分混勻。
若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有700μl提取緩衝液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩衝液中搗碎食品。
2.將離心管置於60℃水浴中，放置45分鐘，期間混勻數次。
3.加入等體積氯仿，充分混勻。
4.室溫下12,000rpm離心10min。
5.將上清轉移到一個新的離心管中，重複氯仿抽提過程一遍。
6.將上清轉移到一個新的離心管中，加入1ml樹脂，例如Promega公司的Resin，充分混勻。
7.將混合液通過一個過濾柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
8.用2ml清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱，重複一遍。
9.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
10.向過濾柱上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘。
11.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
12.收集洗脫液。
13.用紫外分光光度計測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲存於-20℃冰箱，備用。
提取待測樣品的DNA的方法二如下1.稱取200mg食品粉末，放入1.5ml離心管中，緩慢加入860μl提取緩衝液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混勻。
若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有860μl提取緩衝液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩衝液中搗碎食品。
2.加入100μl 5M鹽酸胍溶液，混勻。
3.加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻。
4.將離心管置於60℃水浴中，放置3小時，期間混勻數次。
5.在室溫下冷卻5分鐘。
6.室溫下13,000rpm離心10min。
7.將上清轉移到一個新的離心管中，加入等體積氯仿，充分混勻。
8.室溫下12,000rpm離心10min。
9.將上清轉移到一個新的離心管中，重複氯仿抽提過程一遍。
10.將上清轉移到一個新的離心管中，加入1ml樹脂，例如Promega公司的Resin，充分混勻。
11.將混合液通過一個過濾柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
12.用2ml清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱，重複一遍。
13.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
14.向過濾柱上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘。
15.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
16.收集洗脫液。
17.用紫外分光光度計測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲存於-20℃冰箱，備用。
第二步、利用PCR技術擴增出基因改造成分(一)檢測標記及對照基因的確定由於在植物基因轉化過程中所使用的大部分的植物轉化中間載體均含有CaMV35S啟動子、Nos終止子、抗生素篩選標記基因NPTII以及除草劑篩選標記基因Bar，因此可以將它們作為通用的基因改造農作物及其加工產品檢測標記。另外由於Monsanto公司的「Roundup Ready」抗除草劑大豆和Novartis公司的「Event176」抗蟲玉米在基因改造農作物的市場上佔有較大的份額，因此「Roundup Ready」所含有的基因改造成分EPSPS基因和CaMV 35S-CTP基因結構，以及「Event 176」所含有的CryIA(b)基因也可以作為特定的含有「Roundup Ready」大豆或「Event 176」玉米以及其它的含有這些基因改造成分的基因改造農作物及其加工產品的檢測標記。還有一些基因由於能夠提供抗蟲、抗病毒、耐貯存及改善品質等特點，而在農作物的基因改造中被廣泛使用，因此它們也可以作為基因改造農作物及其加工產品檢測標記，例如存在於基因改造的抗蟲馬鈴薯中的CryIIIA基因；存在於基因改造的月桂酸含量增高的油菜中的ACP基因；存在於基因改造的耐貯存的番茄中的CaMV 35S-反義PG基因結構；存在於基因改造的抗病毒的菸草中的CaMV 35S-TMV CP基因結構。
為防止基因改造農作物及其加工產品檢測中的假陰性結果，需要設立一系列的對照基因，包括針對所有農作物的DNA降解對照，例如來源於植物的葉綠體特異性基因UAA，和針對基因改造大豆的大豆特異基因Lectin基因，針對基因改造玉米的玉米特異基因Zein和Invertase基因。
(二)鑑定檢測體系的可靠性和靈敏度在開始對樣品進行檢測以前，應首先進行檢測體系的可靠性和靈敏度的鑑定。
選定混有基因改造的「Roundup Ready」0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的「Event 176」0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米(購自歐洲的Joint Research Center，Institute for Reference Material and Measurements)，作為標準來鑑定基因改造農作物及其加工產品檢測體系的可靠性和靈敏度。按照前面所述的基因改造農作物及其加工產品DNA的提取方法，分別提取它們的DNA，然後對各個檢測標記和對照基因進行PCR擴增，同時設立用重蒸水代替DNA模板的空白對照。只有當檢測結果如下時，才能證明檢測體系的可靠性，同時可以確定檢測體系的靈敏度以重蒸水代替DNA模板的空白對照，不能擴增出任何檢測標記和對照基因片段。
「Roundup Ready」0％的大豆，可以擴增出植物通有的UAA基因和大豆特異的Lectin基因片段。
「Event 176」0％的玉米，可以擴增出植物通有的UAA基因和玉米特異的Zein或Invertase基因片段(Zein和Invertase，可以二者任選其一)。
「Roundup Ready」0.1％和以上的大豆，可以擴增出大豆特異的Lectin基因、CaMV 35S啟動子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結構片段(EPSPS和CaMV 35S-CTP，可以二者任選其一)。則此時檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農作物及其加工產品。若無法從「Roundup Ready」0.1％的大豆中擴增出CaMV 35S啟動子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結構片段，而可以從「Roundup Ready」0.5％和以上的大豆中擴增出這些基因片段，則檢測的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農作物及其加工產品。依此類推。
「Event 176」0.1％和以上的玉米，可以擴增出玉米特異的Zein或Invertase基因、CaMV 35S啟動子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，則此時檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農作物及其加工產品。若無法從「Event 176」0.1％的玉米中擴增出CaMV 35S啟動子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，而可以從「Event 176」0.5％和以上的玉米中擴增出這些基因片段，則此時檢測體系的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農作物及其加工產品。依此類推。
(三)確定基因改造農作物及其加工產品的定性檢測PCR引物和限制性內切酶由於產品的加工過程會對DNA造成降解，因此所擴增的檢測標記和對照基因片段應控制在200鹼基對(bp)以內，且該片段內最好含有限制性內切酶位點，以利於隨後對PCR產物進行酶切鑑定。PCR引物的長度應控制在18-30bp之間，GC含量應控制在30-50％之間。我們選定符合以上條件的PCR引物的位置範圍和限制性內切酶如下表基因改造農作物及其加工產品的定性檢測PCR引物位置範圍和限制性內切酶列表(表一)
(表一)針對上面列表中的PCR引物位置範圍，我們尋找到最佳的引物序列基因改造農作物及其加工產品的定性檢測最佳PCR引物和限制性內切酶列表(表二)
(表二)(四)確定PCR反應體系PCR反應體系如下PCR buffer1×
MgCl22.1mMdNTPS0.2mMTaq DNA polymerase 0.5UPfu DNA polymerase 0.5UPrimer 0.5μMDNA template100ng重蒸水 補至20μl(五)確定PCR反應條件PCR反應條件如下預變性 94℃ 2分鐘變性94℃ 40秒復性50-62℃ 40秒延伸72℃ 40秒40個循環，最後在72℃延伸10分鐘。
PCR產物在3％瓊脂糖膠上，110V恆壓下電泳30分鐘。在紫外燈下檢測電泳結果。
第三步、利用酶切技術對所擴增的基因改造成分進行鑑定為避免所擴增的基因改造成分(即PCR產物)的假陽性情況，需要採用合適的限制性內切酶對PCR產物進行酶切鑑定，只有通過酶切得到相應的基因片段，才能證實PCR產物的正確性。對於擴增片段過短，而無法通過酶切鑑定的，可以通過雜交或測序進行PCR產物的鑑定。
酶切體系如下PCR產物15μl限制性內切酶buffer 2μl重蒸水 2μl限制性內切酶 1μl(10U)總反應體系 20μl在37℃保溫3個小時。然後在3％瓊脂糖膠上，110V恆壓下電泳30分鐘。在紫外燈下檢測電泳結果。
第四步、對檢測結果進行解釋在檢測體系的可靠性得到確認以後，對基因改造農作物及其加工產品的檢測結果解釋如下如果得到相應的Lectin基因片段，則證明該樣品中含有大豆成分；如果得到相應的Zein或Invertase基因片段，則證明該樣品中含有玉米成分；
如果得到相應的CaMV 35S啟動子、Nos終止子和NPTII基因片段中的一個或幾個，則證明該樣品中含有基因改造成分；如果得到相應的EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結構片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結構；如果得到相應的CryIA(b)基因片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為CryIA(b)基因；如果僅得到相應的UAA基因片段，則證明該樣品不含有基因改造成分；如果沒有得到任何相應的片段，則證明從該樣品提取的DNA中含有PCR反應的抑制成分，所提取的DNA需要進一步純化。
本發明的實施基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法的試劑盒由如下試劑構成DNA提取緩衝液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；樹脂；過濾柱(column)；清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR緩衝液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；PCR引物，為表一或表二中的引物的全部或部分組合；限制性內切酶，為表一或表二中的限制性內切酶的全部或部分組合。
採用本發明的方法和試劑盒，可以方便準確地判定一種農作物或其加工產品是否含有基因改造成分。
實施例用於實施基因改造農作物及其加工產品定性檢測方法的試劑盒由下列試劑組成提取緩衝液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；樹脂；過濾柱(column)；清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR緩衝液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；表二中的CaMV35啟動子引物1，Nos終止子引物1，NPTII引物1，CaMV 35S-CTP基因結構引物1，CryIA(b)基因引物1，UAA基因引物，Lectin基因引物1和Invertase基因引物；限制性內切酶EcoRV，AflIII，NciI，PvuII，StyI和NaeI。
所檢測的食品為購自超市的進口薯片。用研缽磨成粉末狀，採用前述基因改造農作物及其加工產品DNA的提取方法一，得到樣品的DNA，同時提取混有基因改造的「Roundup Ready」0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的「Event176」0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米的DNA。按照前述PCR反應體系和反應條件，分別利用各對引物對各個檢測標記和對照基因進行擴增，同時進行檢測系統可靠性和靈敏度的鑑定。最後對各個PCR產物用相應的限制性內切酶進行鑑定。按照前述對檢測結果的解釋整理出相應的檢測報告。
權利要求
1.基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法，步驟包括第一步、基因改造農作物及其加工產品DNA的提取(一)待測樣品的前處理粉末狀的待測樣品不需處理；非粉末狀的固體待測樣品要處理成粉末狀；液態待測樣品採用冷凍乾燥法乾燥並研碎成粉末狀；新鮮的待測樣品清洗乾淨即可；(二)提取基因改造農作物及其加工產品的DNA，方法如下(1)稱取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)離心管中，緩慢加入700微升(μl)CTAB提取緩衝液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0，使用前加入體積比為1％的巰基乙醇)，充分混勻；若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有700μl提取緩衝液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩衝液中搗碎食品；(2)將離心管置於60℃水浴中，放置45分鐘，期間混勻數次；(3)加入等體積氯仿，充分混勻；(4)室溫下12,000rpm離心10min；(5)將上清轉移到一個新的離心管中，重複氯仿抽提過程一遍；(6)將上清轉移到一個新的離心管中，加入1ml樹脂，充分混勻；(7)將混合液通過一個過濾柱(column)；(8)用2ml清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱(column)，重複一遍；(9)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(10)向過濾柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘；(11)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(12)收集洗脫液；(13)用紫外分光光度計測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲存於-20℃冰箱，備用；提取DNA還可以採取如下方法(1)稱取200mg食品粉末，放入1.5ml離心管中，緩慢加入860μl提取緩衝液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混勻；若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有860μl提取緩衝液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩衝液中搗碎食品；(2)加入100μl 5M鹽酸胍溶液，混勻；(3)加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻；(4)將離心管置於60℃水浴中，放置3小時，期間混勻數次；(5)在室溫下冷卻5分鐘；(6)室溫下13,000rpm離心10min；(7)將上清轉移到一個新的離心管中，加入等體積氯仿，充分混勻；(8)室溫下12,000rpm離心10min；(9)將上清轉移到一個新的離心管中，重複氯仿抽提過程一遍；(10)將上清轉移到一個新的離心管中，加入1ml樹脂，充分混勻；(11)將混合液通過一個過濾柱(column)；(12)用2ml清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱(column)，重複一遍；(13)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(14)向過濾柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘；(15)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(16)收集洗脫液；(17)用紫外分光光度計測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲存於-20℃冰箱，備用；第二步、利用PCR技術擴增出基因改造成分，方法如下(一)確定檢測標記及對照基因選定下列要素作為檢測標記存在於植物基因轉化過程中所使用的大部分的植物轉化中間載體中的CaMV35S啟動子、Nos終止子、抗生素篩選標記基因NPTII以及除草劑篩選標記基因Bar；存在於Monsanto公司的「Roundup Ready」抗除草劑大豆中的基因改造成分EPSPS基因和CaMV 35S-CTP基因結構；存在於Novartis公司的「Event 176」抗蟲玉米中的CryIA(b)基因；存在於基因改造的抗蟲馬鈴薯中的CryIIIA基因；存在於基因改造的月桂酸含量增高的油菜中的ACP基因；存在於基因改造的耐貯存的番茄中的CaMV 35S-反義PG基因結構；存在於基因改造的抗病毒的菸草中的CaMV 35S-TMV CP基因結構；設立一系列的對照基因，包括針對所有農作物的DNA降解對照，例如來源於植物的葉綠體特異性基因UAA，針對基因改造大豆的大豆特異基因Lectin基因，針對基因改造玉米的玉米特異基因Zein和Invertase基因；(二)鑑定檢測體系的可靠性和靈敏度選定混有基因改造的「Roundup Ready」0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的「Event 176」0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作為標準來鑑定基因改造農作物及其加工產品檢測體系的可靠性和靈敏度；按照前面所述的基因改造農作物及其加工產品DNA的提取方法，分別提取它們的DNA，然後對各個檢測標記和對照基因進行PCR擴增，同時設立用重蒸水代替DNA模板的空白對照；只有當檢測結果如下時，才能證明檢測體系的可靠性，同時可以確定檢測體系的靈敏度以重蒸水代替DNA模板的空白對照，不能擴增出任何檢測標記和對照基因片段；「Roundup Ready」0％的大豆，可以擴增出植物通有的UAA基因和大豆特異的Lectin基因片段；「Event 176」0％的玉米，可以擴增出植物通有的UAA基因和玉米特異的Zein或Invertase基因片段(Zein和Invertase，可以二者任選其一)；如果「Roundup Ready」0.1％和以上的大豆，可以擴增出大豆特異的Lectin基因、CaMV 35S啟動子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結構片段(EPSPS和CaMV 35S-CTP，可以二者任選其一)，則此時檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農作物及其加工產品；若無法從「Roundup Ready」0.1％的大豆中擴增出CaMV 35S啟動子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結構片段，而可以從「RoundupReady」0.5％和以上的大豆中擴增出這些基因片段，則檢測的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農作物及其加工產品；依此類推；如果「Event 176」0.1％和以上的玉米，可以擴增出玉米特異的Zein或Invertase基因、CaMV 35S啟動子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，則此時檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農作物及其加工產品；若無法從「Event 176」0.1％的玉米中擴增出CaMV 35S啟動子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，而可以從「Event 176」0.5％和以上的玉米中擴增出這些基因片段，則此時檢測體系的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農作物及其加工產品；依此類推；(三)確定PCR引物和限制性內切酶所擴增的檢測標記和對照基因片段應控制在200鹼基對(bp)以內，且該片段內最好含有限制性內切酶位點；PCR引物的長度應控制在18-30bp之間，GC含量應控制在30-50％之間；我們選定符合以上條件的PCR引物的位置範圍和限制性內切酶如下表基因改造農作物及其加工產品的定性檢測PCR引物位置範圍和限制性內切酶列表(表一)
(表一)(四)確定PCR反應體系PCR反應體系如下PCR buffer 1×MgCl22.1mMdNTPS0.2mMTaq DNA polymerase 0.5UPfu DNA polymerase 0.5UPrimer 0.5μMDNA template100ng重蒸水 補至20μl(五)確定PCR反應條件PCR反應條件如下預變性 94℃ 2分鐘變性94℃ 40秒復性50-62℃ 40秒延伸72℃ 40秒40個循環，最後在72℃延伸10分鐘；PCR產物在3％瓊脂糖膠上、110V恆壓下電泳30分鐘，在紫外燈下檢測電泳結果；第三步、利用酶切技術對所擴增的基因改造成分進行鑑定採用合適的、可以避免所擴增的基因改造成分(即PCR產物)假陽性情況的限制性內切酶對PCR產物進行酶切鑑定，只有通過酶切得到相應的基因片段，才能證實PCR產物的正確性；對於擴增片段過短，而無法通過酶切鑑定的，可以通過雜交或測序進行PCR產物的鑑定；酶切體系如下PCR產物15μl限制性內切酶buffer 2μl重蒸水 2μl限制性內切酶 1μl(10U)總反應體系 20μl在37℃保溫3個小時，然後在3％瓊脂糖膠上、110V恆壓下電泳30分鐘，在紫外燈下檢測電泳結果；第四步、對檢測結果進行解釋在檢測體系的可靠性得到確認以後，對基因改造農作物及其加工產品的檢測結果解釋如下如果得到相應的Lectin基因片段，則證明該樣品中含有大豆成分；如果得到相應的Zein或Invertase基因片段，則證明該樣品中含有玉米成分；如果得到相應的CaMV 35S啟動子、Nos終止子和NPTII基因片段中的一個或幾個，則證明該樣品中含有基因改造成分；如果得到相應的EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結構片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結構；如果得到相應的CryIA(b)基因片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為CryIA(b)基因；如果僅得到相應的UAA基因片段，則證明該樣品不含有基因改造成分；如果沒有得到任何相應的片段，則證明從該樣品提取的DNA中含有PCR反應的抑制成分，所提取的DNA需要進一步純化。
2.如權利要求1所述的基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法，其特徵在於PCR引物序列和限制性內切酶如下表基因改造農作物及其加工產品的定性檢測最佳PCR引物和限制性內切酶列表(表二)
(表二)
3.一種實施如權利要求1或2所述的基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法的試劑盒，其特徵在於試劑盒由如下試劑構成提取緩衝液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)；樹脂；過濾柱(column)；清洗緩衝液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR緩衝液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；用於擴增出基因改造成分的PCR引物，為表一或表二中的PCR引物的全部或部分組合；用於酶切鑑定PCR產物的限制性內切酶，為表一或表二中的限制性內切酶的全部或部分組合。
全文摘要
本發明公開了一種基因改造農作物及其加工產品的定性檢測方法和試劑盒,屬分子生物學檢測領域。具體的是從基因改造農作物及其加工產品中提取脫氧核糖核酸(DNA),應用多聚酶鏈式反應(PCR)和限制性內切酶(R.E.)分析技術(酶切技術)對基因改造農作物及其加工產品中的基因改造成分(genetically modified organisms,GMOs)進行定性檢測的方法和試劑盒。採用本發明的方法和試劑盒,可以方便準確地判定一種農作物或其加工產品是否含有基因改造成分。
文檔編號C12Q1/68GK1370842SQ0110421
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月26日 優先權日2001年2月26日
發明者安利忻 申請人:安利忻