雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法
2023-05-27 14:27:31 2
雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法
【專利摘要】雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，包括如下步驟：選取目標雞飼料、設定添加外源碳水化合物酶類型和劑量水平、體外模擬雞的胃腸道消化、測定飼料的體外消化能值、分析目標飼料的最優碳水化合物酶譜。本發明通過體外法模擬動物消化過程，使用飼料體外能值表徵碳水化合物酶的作用效果，快速獲取雞飼料最優的外源碳水化合物酶譜。
【專利說明】雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，特別是涉及利用體外模擬消化法快速優化雞飼料外源碳水化合物酶譜的方法。
【背景技術】
[0002]碳水化合物是飼料的主體部分，也是動物的主要能量來源。隨著飼料成本持續上漲，人們不斷尋求較低廉的飼料原料(如:玉米加工副產物)部分替代傳統的玉米和豆柏飼料原料。然而，這些加工副產物常含有較高的日糧纖維，而這些日糧纖維不能被動物機體充分利用(Anguita et al.，2006)。目前，通常採用添加外源碳水化合物酶來提高日糧纖維的利用率，碳水化合物酶常以非澱粉多糖酶為主，如木聚糖酶(Engberg et al.，2006;丁雪梅等,2009 ；Selle et al., 2003)、纖維素酶(Nahm et al., 1985 ;陳曉春等,2005)、β -葡聚糖酶(Philip et al., 1995 ；Yu et al.，1998)等,而碳水化合物酶的作用效果與日糧組成、酶的活性、酶譜配伍密切相關。然而，外源碳水化合物酶的類型和配伍等不確定因素，導致目前普遍對外源酶的添加具有一定的盲目性。
[0003]篩選飼料的最優酶譜的方法主要有體內法(in vivo)和體外法(in vitro)。體內法就是進行動物試驗，常常耗資、費力、費時，系統誤差和偶然誤差影響因素多(陳亮等，2013)。而體外法具有快速、簡便、費用低等優點，但目前體外法選擇的參數和條件常常缺乏理論的解釋，具有一定的隨意性(Coles et al.，2005)。因此，選取合理的體外模擬消化參數，模擬雞飼料的消化過程，針對不同雞飼料外源碳水化合物成分特性，篩選與之相適應的碳水化合 物酶譜，對於充分發揮飼料潛能，提高飼料利用率和增加養殖生產效益具有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明的技術解決問題:為了克服目前雞飼料中添加外源酶的盲目性，提供一種雞飼料外源碳水化合物酶譜的快速篩選方法，通過體外法模擬動物消化過程，使用雞飼料體外能值表徵碳水化合物酶的作用效果，快速獲取雞飼料最優的外源碳水化合物酶譜。
[0005]本發明的技術解決方案如下:雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選法，包括步驟如下:
[0006](I)選取目標的雞飼料，並在所述雞飼料中添加多種已知類型的外源碳水化合物酶，每種外源碳水化合物酶的添加劑量設置系列的濃度梯度；
[0007](2)將已知重量的加酶雞飼料樣品置於三角瓶中，並加入已知配比的模擬胃消化的緩衝液和消化酶液，混合均勻，其中飼料、緩衝液和消化酶液的重量百分比範圍是2:6:I~2:10:1，並在設定的模擬胃消化參數下將雞飼料樣品進行模擬胃的消化過程；
[0008](3)待模擬胃消化結束後，在三角瓶中加入已知配比的模擬小腸消化的緩衝液和消化酶液，其中緩衝液和消化酶液的重量百分比範圍是19:1~21:1，並繼續在設定的模擬小腸消化參數下將雞飼料樣品進行模擬小腸的消化過程；[0009](4)待模擬小腸消化結束後，將消化殘渣烘乾至恆重，測定殘渣體外消化能值，計算出添加每種碳水化合物酶的雞飼料體外消化能值，並根據碳水化合物酶和體外消化能值的回歸關係，得出每種碳水化合物酶能提高目標的雞飼料體外消化能值的臨界點；
[0010](5)將每種碳水化合物酶依據所述臨界點進行編碼，採用回歸正交旋轉組合設計，以體外消化能值為特徵指標，篩選外源碳水化合物酶的最優酶譜。
[0011]所述步驟(1)中目標的雞飼料中添加3~7種外源碳水化合物酶，添加劑量設置O~1000 μ g/g系列濃度梯度。
[0012]所述步驟(2)中模擬胃消化的緩衝液為:pH為2.0，摩爾質量比90:8~100:11=氯化鈉:氯化鉀的混合緩衝溶液；模擬胃消化的酶液為:pH2.0的900~1500U/mL胃蛋白酶
液。
[0013]所述步驟(2)中模擬胃消化參數為:溫度40~42°C，搖床轉速120~180rpm，消化時間4~6h。
[0014]所述步驟(3)中模擬小腸消化的緩衝液為:pH為6.3~6.6，摩爾質量比90:18:152~98:22:186=氯化鈉:氯化鉀:磷酸鹽的混合緩衝溶液；模擬小腸消化的酶液為:ρΗ6.3~6.6，單位酶活力比37:8:386:1~46:12:464:2=胰蛋白酶:糜蛋白酶:澱粉酶:脂肪酶的混合酶液。
[0015]所述步驟(3)中模擬小腸消化的參數為:溫度40~42°C，搖床轉速120~180rpm，消化時間15~18h。
[0016]所述步驟(5)中將每種碳水化合物酶依據所述臨界點進行編碼時，根據添加的多種碳水化合物酶的種類，設置對應數量的影響因子，每個影響因子設置5個水平，採用回歸正交旋轉組合設計分析體外消化能值，並利用體外消化能值與碳水化合物酶添加劑量關係，表徵出最優的碳水化合物酶譜。回歸正交旋轉組合設計具有計算簡單，並可以消除回歸係數之間的相關性，達到快速優化最優酶譜的目的。
[0017]本發明與現有技術相比的優點在於:
[0018](1)本發明以大量動物體內實驗數據為依據，選取的體外模擬參數更加貼近動物的實際生理狀況，具有較好的模擬飼料在雞體內消化過程的效果；
[0019](2)本發明克服了以往篩選外源碳水化合物酶的盲目性，使用快捷的體外手段模擬飼料在雞胃腸道的消化過程，並提出體外消化能值表徵最優酶譜，達到了快速優化碳水化合物酶譜的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為本發明實現的流程圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖及具體實施例詳細介紹本發明。但以下的實施例僅限於解釋本發明，本發明的保護範圍應包括權利要求的全部內容，不僅僅限於本實施例。
[0022]實施例1，
[0023]如圖1所示，本發明具體操作方法可以如下方式實施:
[0024]( I)選取玉米-豆柏日糧，並在飼料中分別添加四種外源碳水化合物酶，即木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶和果膠酶，每種外源碳水化合物酶添加劑量的濃度梯度水平分別設為 0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μ g/g。
[0025](2)準確稱取I~2g (粉碎過60目篩)飼養樣品(精確至0.0002g)，置於100mL具塞三角瓶中，向三角瓶中加入模擬胃消化的緩衝液和消化酶液，其中飼料、模擬胃緩衝液和模擬胃消化酶液的重量百分比為2:8:1 ;模擬胃消化的緩衝液為pH為2.0，摩爾質量比90:8=氯化鈉:氯化鉀的混合緩衝溶液；模擬胃消化酶液為PH2.0的1000U/mL胃蛋白酶液。小心混合均勻後，用橡膠塞封口，於42°C恆溫水浴搖床中(150rpm),放入5min後開始計時，消化時間為6h。
[0026](3)待胃消化階段結束後，向三角瓶中加入模擬小腸消化的緩衝液和消化酶液，其中緩衝液和消化酶液的重量百分比是20:1 ;模擬小腸消化的緩衝液為pH為6.4，摩爾質量比90:18:152=氯化鈉:氯化鉀:磷酸鹽混合緩衝溶液；模擬小腸消化的酶液為:pH6.4，單位酶活力比37:8:386:1的胰蛋白酶:糜蛋白酶:澱粉酶:脂肪酶混合酶液。小心混合均勻後，用橡膠塞封口，於42°C恆溫水浴搖床中(150rpm),放入5min後開始計時，消化時間為ISh0將消化殘渣烘乾至恆重，並測定殘渣能值，計算在不同濃度的每種碳水化合物酶作用下日糧的體外消化能值；並根據碳水化合物酶和體外消化能值的回歸關係，得出木聚糖酶、纖維素酶、β -葡聚糖酶和果膠酶能提高目標日糧體外消化能值的臨界點為600 μ g/g。
[0027](4)四種碳水化合物酶設為4個影響因子，每個因子設置5個水平，將每種碳水化合物酶的臨界添加量(600 μ g/g)編碼為0，採用四元二次回歸正交旋轉組合設計，酶添加水平400、500、600、700、800 μ g/g分別用-2、-1、O、1、2進行編碼(具體的設計因素及水平見表1)，建立體外消化能值與四種碳水化合物酶添加量的四元二次回歸方程，其方程為:玉米 _ 豆柏日糧的體外消化能值=a0+alxl+a2x2+a3x3+a4x4+al2xlx2+al3xlx3+al4xlx4+a23x2x3+a24x2x4+a34x3x4+allxl2+a22x22+a33x32+a44x42 (a,回歸方程係數；xl，木聚糖酶；x2，纖維素酶；χ3，β-葡聚糖酶；χ4，果膠酶)。使用偏導數法求解回歸方程中最優的碳水化合物酶譜組合以及各個碳水化合物酶添加劑量。
[0028]表1
[0029]
【權利要求】
1.雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於實現步驟如下: (1)選取目標的雞飼料，並在所述雞飼料中添加多種已知類型的外源碳水化合物酶，每種外源碳水化合物酶的添加劑量設置系列的濃度梯度； (2)將已知重量的加酶雞飼料樣品置於三角瓶中，並加入已知配比的模擬胃消化的緩衝液和消化酶液，混合均勻，其中飼料、緩衝液和消化酶液的重量百分比範圍是2:6:1~2:10:1，並在設定的模擬胃消化參數下將雞飼料樣品進行模擬胃的消化過程； (3)待模擬胃消化結束後，在三角瓶中加入已知配比的模擬小腸消化的緩衝液和消化酶液，其中緩衝液和消化酶液的重量百分比範圍是19:1~21:1，並繼續在設定的模擬小腸消化參數下將雞飼料樣品進行模擬小腸的消化過程； (4)待模擬小腸消化結束後，將消化殘渣烘乾至恆重，測定殘渣體外消化能值，計算出添加每種碳水化合物酶的雞飼料體外消化能值，並根據碳水化合物酶和體外消化能值的回歸關係，得出每種碳水化合物酶能提高目標的雞飼料體外消化能值的臨界點； (5)將每種碳水化合物酶依據所述臨界點進行編碼，採用回歸正交旋轉組合設計，以體外消化能值為特徵指標，篩選外源碳水化合物酶的最優酶譜。
2.根據權利要求1所述的雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(1)中目標的雞飼料中添加3~7種外源碳水化合物酶，添加劑量設置O~1000 μ g/g系列濃度梯度。
3.根據權利要求1所述的雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(2)中模擬胃消化的緩衝液為:pH為2.0，摩爾質量比90:8~100:11=氯化鈉:氯化鉀的混合緩衝溶液；模擬胃消化的酶液為:pH2.0的900~1500U/mL胃蛋白酶液。
4.根據權利要求1所述的雞飼料外`源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(2)中模擬胃消化參數為:溫度40~42°C，搖床轉速120~180rpm，消化時間4~6h。
5.根據權利要求1所述的雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(3)中模擬小腸消化的緩衝液為:pH為6.3~6.6，摩爾質量比90:18:152~98:22:186=氯化鈉:氯化鉀:磷酸鹽的混合緩衝溶液；模擬小腸消化的酶液為:pH6.3~6.6，單位酶活力比37:8:386:1~46:12:464:2=胰蛋白酶:糜蛋白酶:澱粉酶:脂肪酶的混合酶液。
6.根據權利要求1所述的雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(3)中模擬小腸消化的參數為:溫度40~42°C，搖床轉速120~180rpm，消化時間15 ~18h。
7.根據權利要求1所述的雞飼料外源碳水化合物酶譜的篩選方法，其特徵在於:所述步驟(5)中將每種碳水化合物酶依據所述臨界點進行編碼時，根據添加的多種碳水化合物酶的種類，設置對應數量的影響因子，每個影響因子設置5個水平，採用回歸正交旋轉組合設計分析體外消化能值，並利用體外消化能值與碳水化合物酶添加劑量關係，表徵出最優的碳水化合物酶譜。
【文檔編號】C12Q1/34GK103882094SQ201410018289
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】陳亮, 張宏福, 侯小峰, 付生慧, 何科林 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所