一種生物大分子的分離技術及其應用的製作方法
2023-05-27 14:31:26
一種生物大分子的分離技術及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種從凝膠塊中分離生物大分子的分離裝置,以及該分離裝置的使用方法；進一步的,本發明提供了所述分離裝置和分離方法在生物大分子分離中的應用,利用所述分離方法和裝置,能夠快速、高效地分離凝膠塊中含有的生物大分子。
【專利說明】 一種生物大分子的分離技術及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種從凝膠塊中分離生物大分子的分離裝置、方法及其應用。
【背景技術】
[0002]電泳是指帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現象。利用帶電粒子在電場中移動速度的不同，而使其得到分離的技術被稱為電泳技術。1937年瑞典科學家蒂塞利烏斯首次設計製造了移動界面電泳儀，利用電泳技術對馬血清中3種白蛋白進行了分離。
[0003]目前應用的電泳技術大致可分為顯微電泳、自由界面電泳和區帶電泳三類，其中又以區帶電泳、尤其是瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳的應用最為廣泛。在生物大分子分離純化過程中，瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠電泳是兩種最常見的電泳技術，用於分離純化包括核酸、蛋白質和糖在內的多種生物大分子物質。在蛋白質或核酸分析過程中，經常需要將被分離的特定成分從凝膠中提取出來，用於後續的研究工作，因此獲得經過凝膠分離的大分子物質不僅是一項常規的實驗操作，也是核酸、蛋白質研究中的一項關鍵步驟。
[0004]從凝膠中獲得經電泳分離的生物大分子是分子生物學實驗中常用的技術手段和重要的操作步驟，常用的方案大體分為利用化學方法的樣本純化技術和利用物理方法的電洗脫技術。以Qiagen為代表的公司採用有機試劑溶解瓊脂肪凝膠，可進一步分離純化其中的核酸成分。雖然該類技術通過簡單的有機試劑溶膠、純化柱分離就能獲得所需的核酸樣本，但回收率較低，尤其是對分子量比較大的核酸分子，極大地制約了相關研究的發展；該技術的另一個缺陷是由於使用了高濃度的化學試劑，不適合活性蛋白質樣本的純化。
[0005]電洗脫技術是一項應用廣泛的凝膠分離技術，可用於不同凝膠中多種生物大分子物質的分離。透析袋電洗脫法是其中最簡單的一種技術方案，其步驟是首次將含有所待分離樣本的凝膠區帶切下，裝入透析袋內並加入緩衝液浸泡，再將透析袋浸入緩衝液中進行電泳；凝膠中帶電荷的生物大分子成分就會依其電性，分別向正、負電極方向遷移，離開凝膠進入透析袋內的緩衝液中，從而實現從凝膠中分離生物大分子成分的目的。雖然透析袋電洗脫法所需設備簡單，但操作較為複雜，技術的穩定性不好，同時存在洗脫後樣品體積較大，回收效率較低的缺陷。
[0006]為了簡化電洗脫技術的操作難度、提高樣本回收率，許多生物技術和儀器公司東開發了相關技術和產品，市場上具有代表性的產品有G-B1sciences公司的G_Capsule、Gerardb1tech 公司的 GeBAflex tube、Novagen 公司的 D-Tube、Whatman 公司的 Elutrap、以及 B1-Rad 公司的 Whole Gel Eluter and Mini Whole Gel Elute 系統。這些設備通常依賴具有不同孔徑的半透膜，除了價格昂貴以外，半透膜的切割和安裝過程較為複雜，一旦失誤易發生樣本洩露。此外，與周圍電解質溶液環境相比，凝膠樣本的電阻較大；在相同的電場條件下，大多數電流會通過電阻率較低的周圍電解質溶液傳遞，只有極少量的電流會流經凝膠，從而使得樣品從凝膠中游離的速度非常緩慢。這一方面極大地延長了電洗脫時間，不利於生物大分子的活性保持，另一方面也影響了電洗脫效率，降低了樣本的回收率。
[0007]因此，迫切需要建立一種快速、高效地從凝膠中回收生物大分子樣本的電洗脫技術。
【發明內容】
[0008]從以上分析可以看出，現有電洗脫技術中最主要的問題是為了克服目前存在的洗脫時間長、回收效率低和操作繁瑣的問題，本發明使含有待分離樣本的凝膠在電場中形成一個能夠完全阻擋電流通路的凝膠層，使所有電流均通過該凝膠層傳遞，從而極大地降低了電洗脫的時間，提高了樣本的回收率。
[0009]本發明涉及以下按順序編號的段落中定義的主題:
[0010]1、一種電分離槽，該電分離槽包括分離的陽極區域和陰極區域、以及設置在陽極區域和陰極區域之間的凝膠區域，陽極區域中裝置有正電極，陰極區域中裝置有負電極。
[0011]2、段落I所述的分離槽，其特徵在於所述電分離槽陽極區域的容積為0.01-10mL。
[0012]3、段落I所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽由內、外兩個嵌套的垂直套管組成，陽極區域位於外套管中，陰極區域位於內套管中，凝膠區域位於內套管中的與外套管交界的區域，內套管底部為可通透的。
[0013]4、段落I所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽由內、外兩個嵌套的垂直套管組成，陽極區域位於內套管中，陰極區域位於外套管中，凝膠區域位於內套管中的與外套管交界的區域，內套管底部為可通透的。
[0014]5、段落1-4任一項所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽的凝膠區域為上寬下窄的漏鬥形結構。
[0015]6、段落1-5任一項所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽的凝膠區域下端具有支持性的且不影響電流通過的結構。
[0016]7、段落1-6任一項所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽的述凝膠區域下端設置有可拆卸的封閉裝置。
[0017]8、段落7所述的電分離槽，其特徵在於所述的可拆卸的封閉裝置為可拆除的錫箔紙。
[0018]9、段落1-8任一項所述的電分離槽，其特徵在於所述的電分離槽還包括冷卻裝置。
[0019]10、一種電分離裝置，其特徵在於包括段落1-9任一項所述的電分離槽和電源系統。
[0020]11、一種從凝膠塊中分離生物大分子的方法，該方法包括以下步驟:
[0021]I)獲得段落1-9任一項所述的電分離槽；
[0022]2)獲得含有待分離生物大分子的凝膠塊，利用該凝膠塊製備凝膠層，使其能夠在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸；
[0023]3)使待分離的生物大分子在電場作用下從凝膠層中遷移出來；
[0024]4)收集分離的生物大分子。
[0025]12、段落11所述的方法，其特徵在於步驟2中製備所述凝膠層的方法為:熔解含有待分離生物大分子的凝膠塊，將凝膠熔液加入到電分離槽的凝膠區域中，凝固後形成所述凝膠層。
[0026]13、段落11所述的方法，其特徵在於步驟2中製備所述凝膠層的方法為:將含有待分尚生物大分子的凝膠塊與一定量不含有生物大分子的凝膠熔液加入到電分尚槽的凝膠區域中，使其共同凝固形成所述凝膠層。
[0027]14、段落11所述的方法，其特徵在於所述凝膠塊選自瓊脂糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠。
[0028]15、段落11所述的方法，其特徵在於分離電壓為5-50伏，優選為10-20伏。
[0029]16、段落11所述的方法，其特徵在於分離電流為Ι-lOmA，優選為2_4mA。
[0030]17、段落11所述的方法，其特徵在於所述的待分離生物大分子選自核酸、蛋白質和多糖。
[0031]一方面，本發明提供了一種用於從凝膠中分離生物大分子的電分離槽，該電分離槽包括分離的陽極區域和陰極區域、以及設置在陽極區域和陰極區域之間的凝膠區域，陽極區域中裝置有正電極，陰極區域中裝置有負電極，其特徵在於凝膠區域的凝膠能夠在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸。本發明提供的電分離槽能夠方面地實現本發明的技術效果，解決了現有技術中分離步驟繁瑣的問題。
[0032]一方面，本發明所提供了一種使用於本發明提供的分離方法的電分離槽，該電分離槽的陽極區域的容積為0.0l-1OmL ;優選的，電分離槽的陽極區域的容積為0.l-5mL。
[0033]一方面，本發明提供的電分離槽由內、外兩個嵌套的垂直套管組成，陽極區域位於外套管中，陰極區域位於內套管中，凝膠區域位於內套管中的與外套管交界的區域。
[0034]一方面，本發明提供的電分離槽由內、外兩個嵌套的垂直套管組成，陽極區域位於內套管中，陰極區域位於外套管中，凝膠區域位於內套管中的與外套管交界的區域。
[0035]一方面，本方面提供的電分離槽的凝膠區域為上寬下窄的漏鬥形結構。
[0036]一方面，本方面提供的電分離槽的凝膠區域下端具有支持性的且不影響電流通過的結構。
[0037]—方面，本方面提供的電分離槽的凝膠區域下端設置有可拆卸的封閉裝置。
[0038]一方面，本方面提供的電分離槽的凝膠區域下端設置有可拆卸的封閉裝置為可拆除的錫箔紙。
[0039]一方面，本方面提供的電分離槽還包括冷卻裝置。所述冷卻裝置可以是循環水冷卻系統、或預冷的可與被冷卻部位密切結合的預冷的金屬結構。
[0040]另一方面，本發明提供了一種電分離裝置，其特徵在於包括上述電分離槽和電源系統。優選的，本發明提供的電分離裝置還包括冷卻裝置。
[0041]另一方面，本發明提供了一種從凝膠塊中分離生物大分子的方法，包括以下步驟:1)獲得一種電分離槽，該電分離槽包括分離的陽極區域和陰極區域、以及設置在陽極區域和陰極區域之間的凝膠區域，陽極區域中裝置有正電極，陰極區域中裝置有負電極；2)獲得含有待分離生物大分子的凝膠塊，利用該凝膠塊製備凝膠層，使其能夠在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸；3)使待分離的生物大分子在電場作用下從凝膠塊中遷移出來；4)收集分離的生物大分子。本發明通過在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間製備包含待分離生物大分子樣本的凝膠層，並使該凝膠層在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸，從而將所有電流都應用於生物大分子的分離過程。這一改變克服了現有技術中僅有及少量電流實際用於生物大分子分離的缺陷，解決了電分離時間過長和回收效率過低的問題。
[0042]一方面，在本發明提供的從凝膠中分離生物大分子的方法中，一種製備步驟2中所述凝膠層的方法為:熔解含有待分離生物大分子的凝膠塊，將凝膠熔液加入到電分離槽的凝膠區域中，凝固後形成所述凝膠層。該方法可用於分離具有溫度穩定性或對完整性要求不高的生物大分子。
[0043]一方面，在本發明提供的從凝膠中分離生物大分子的方法中，一種製備步驟2中所述凝膠層的方法為:將含有待分離生物大分子的凝膠塊與一定量不含有生物大分子的凝膠熔液加入到電分離槽的凝膠區域中，使其共同凝固形成所述凝膠層。具體操作可以是將含有生物大分子的凝膠塊利用物理方法破碎，包括且不限於切碎、利用離心管進行破碎、擠壓破碎等。隨後，將破碎的含有生物大分子的凝膠碎塊與一定量融化狀態的不含有所述生物大分子的凝膠熔液一同、或先後加入到電分離槽的凝膠區域中，使其共同凝固形成所述凝膠層。所述不含有所述生物大分子的凝膠熔液優選為自瓊脂糖凝膠熔液、製備聚丙烯醯胺凝膠的溶液、或其他常用的凝膠製備試劑。無論使用何種試劑或凝膠層形成方案，所形成的凝膠層應能夠在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸。這個凝膠層製備方法可用於分離溫度敏感的生物大分子，其中所述凝膠溶液加入時的溫度應該低於能使所述待分離生物大分子變性或破壞其正常物理化學性質的溫度。
[0044]—方面，本發明提供的從凝膠中分離生物大分子的方法中，所述凝膠塊選自瓊脂糖凝膠、聚丙烯酞胺凝膠、或其他在生物醫學研究中常用的電泳或其他分離方法所使用的凝膠種類。
[0045]一方面，本發明提供的從凝膠中分離生物大分子的方法中，所述分離電壓可以為1-100伏，優選為5-50伏，更優選為10-20伏。
[0046]—方面，本發明提供的從凝膠中分離生物大分子的方法中，所述分離電流為l-50mA,優選為1-1OmA,更優選為2_4mA。
[0047]另一方面，本發明提供了所述電洗脫槽和所述電洗脫方法的應用。所述待分離的生物大分子可選自核酸、蛋白質、多糖、或其他適合本發明提供的方法進行分離的生物大分子。
[0048]與現有技術相比，本發明的有益效果是:1)電洗脫時間短，樣本回收率高。由於將含有待分離樣本的凝膠在電場中形成一個能夠完全阻擋電流通路的凝膠層，使所有電流均通過該凝膠層傳遞，從而極大地縮短了電洗脫時間，提高了樣本的回收率。2)操作步驟簡單。簡化了從凝膠中回收生物大分子的操作步驟，避免了有毒化學試劑的使用，同時也避免了蛋白質或核酸樣品提取、切碎等步驟中的樣品的失活和損失。3)技術簡單，適合高通量地實現多種生物大分子成分的分離。
【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例及附圖，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不能用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0050]圖1、內套管和包括凝膠層的內套管示意圖。
[0051]圖2、外套管和電分離槽整體結構示意圖。
[0052]實施例一、電分離槽的組成和使用方法
[0053]電洗脫裝置的組裝:電分離槽內套管及包括凝膠層的內套管示意圖見圖1，電分離槽外套管和電分離槽整體結構示意圖見圖2。按照圖1和圖2的指示、以及說明書的相關內容，組裝用於後續試驗的電泳槽。
[0054]從凝膠中分離生物大分子的試驗方法具體如下:1)獲得電分離槽；2)以暫時性的封閉裝置如Parafilm膜暫時性封閉圖1所示的電泳槽內套管的底部；3)獲得包含待分離生物大分子的瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠塊；4)用手術刀片將瓊脂糖凝或聚丙烯醯胺凝膠塊切成1_大小的凝膠碎塊，與預先熔解並降溫至60°C左右的I %瓊脂糖凝膠熔液混合，加入到的電泳槽內套管下部的凝膠區；5)使凝膠碎塊和瓊脂糖凝膠熔液共同凝固，在電泳槽內套管的下部凝膠區形成凝膠層，該凝膠層在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，能夠完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸；6)分別在電泳槽的陽極區域和陰極區域加入適量的TAE緩衝液，按圖2所示的方式組裝電分離槽，在電分離槽的陰極區域加入少量核酸或蛋白電泳上樣緩衝液，該上樣緩衝液下沉至凝膠層的頂部，在電分離過程中由陰極向陽極方向遷移；7)將電分離槽的正極和負極分別與電泳儀的相應電極連接，在3mA恆流條件下進行電泳；8)電泳過程中，原來位於電泳槽陰極區域底部的上樣緩衝液會在電場作用下進入凝膠層，向電泳槽的陽極區域遷移，當上樣緩衝液中的染料條帶均由凝膠層中遷移到電泳槽的陽極區域後，停止電泳；9)以適合的方式分離純化分布於電分離槽陽極區緩衝液中的被分離的生物大分子。
[0055]實施例二、從瓊脂糖凝膠中回收不同分子量的DNA片段
[0056]為了研究本發明提供的分離技術對不同大小DNA片段的分離效率，我們從Promega公司購置了 PCR Markers (#G3161),利用瓊脂糖凝膠電泳對不同大小的DNA片段進行分離，隨後用本發明提供的分離技術將不同大小的DNA片段從凝膠中分離出來，計算分離效率。實驗步驟和結果具體如下。
[0057]步驟一:瓊脂糖凝膠電泳。製備含有EB的1.2%的瓊脂糖凝膠，將1uL購置於Promega公司的PCR Markers上樣後進行電泳分離，電泳緩衝液為TAE,電泳條件為恆壓4V / cm。
[0058]步驟二:DNA條帶的分離純化。電泳後共獲得6條DNA條帶，分別為lOOObp，750bp，500bp，300bp，150bp和50bp DNA條帶。將凝膠移至紫外燈下，用高壓滅菌過的無菌手術刀片迅速分離每個DNA條帶，按照實施例一所述的方法從這些凝膠塊中分別獲得其中含有的DNA分子。陽極緩衝液為TAE，陽極區域的緩衝液的體積為0.5mL。
[0059]步驟三:分離DNA的定量。利用Qiagen公司的PCR產物純化試劑盒(#28104)，回收陽極緩衝液中分離的DNA，將純化後的DNA溶於50uL去離子水。
[0060]步驟四:對照實驗。為了鑑定從凝膠中回收DNA分子的準確效率，我們將1uLPCR Markers直接加到0.5mLTAE緩衝液中，利用步驟三中描述的方法，對其中的DNA分子進行了分離純化，將獲得的DNA溶於300uL去離子水。
[0061 ] 步驟五:DNA分離效果驗證。製備一塊含有EB的1.2%的瓊脂糖凝膠，將步驟三中獲得的分離的DNA樣本進行混合，總體積為300uL，取其中的60uL上樣到一個加樣孔中；同樣取步驟四中的DNA溶液60uL上樣到另一個加樣孔中。在4V / cm恆壓條件下進行電泳，電泳緩衝液為TAE。電泳結束後，利用紫外凝膠成像儀對DNA條帶成像，用圖像分析軟體分別獲得每個DNA條帶的灰度值，並進行定量。
[0062]實驗結果及分析:為了準確計算從凝膠中分離獲得的DNA量，需要從分離後的陽極緩衝液中進一步獲得待分離的DNA分子，這個過程中的DNA分離效率會直接影響到計算結果。為了排除這個影響，我們在對照試驗中，將同樣量的DNA Markers直接加入到同樣劑量的TAE溶液中，利用同樣的試劑盒對其中的DNA進行分離純化。以對照試驗中獲得的DNA條帶的灰度值為參照，我們對步驟二從凝膠中分離DNA的效果進行了計算，每條DNA條帶的分離效率如下:從凝膠中分離100bp DNA條帶的效率為95%，分離750bp DNA條帶的效率為97%，分離500bp DNA條帶的效率為99%，分離300bp DNA條帶的效率為96%，分離150bp DNA條帶的效率為95%，分離50bp DNA條帶的效率為95%。從試驗結果可以看出，本發明提供的技術方案可以有效分離不同長度的DNA片段。
[0063]實施例三、從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段樣本並進行PCR擴增
[0064]為了研究本發明提供的技術方案對分離的DNA性質的影響，我們對被分離的DNA進行了 PCR擴增實驗。
[0065]步驟一:獲得包含人類Actin基因cDNA序列的質粒，將200ng質粒上樣到含有EB的1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，按照上述實施例的方法切割質粒電泳條帶所在位置的凝膠塊，用本發明提供的技術方案分離凝膠塊中的質粒DNA，將獲得的質粒DNA溶於50uL去離子水。
[0066]步驟二:針對人Actin基因序列，設計一對PCR擴增引物，序列分別為上遊引物 5 ' -CCTCGCCTTTGCCGATCC 和下遊引物 5 ' -GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC。使用天根生化科技公司的 HotMaster Taq DNA polymerase (cat#:ET106-01_01)對分離的質粒 DNA 中的目標片段進行擴增，具體方法按產品說明書進行，步驟如下:取0.5uL分離的質粒DNA溶液，加入 2.5uL10XHotMaster Taq Buffer, 0.5uL(1uM)上遊引物，0.5uL(1uM)下遊引物，IuL dNTP 混合物(各 2.5uM), IuL SYBR Green(5X), 0.2uL HotMaster Taq DNApolymerase (2.5u / ul),最後加入17.3uL ddH20,反應總體積為25 μ L。混勻後短暫離心，置於Eppendorf PCR儀中進行PCR擴增反應，反應參數為95°C預變性2分鐘，95°C變性15秒，58°C退火15秒，72°C延伸30秒；循環次數為40個循環。每個反應設置3個重複。
[0067]步驟三:取PCR產物2uL，上樣到含有EB的1.2 %的瓊脂糖凝膠中，在4V / cm電壓條件下電泳30分鐘，電泳緩衝液為TAE。電泳結束後，用紫外凝膠成像儀對DNA條帶進行成像。
[0068]實驗結果及分析:以本發明提供的技術方案分離的質粒DNA為模板進行PCR擴增，能夠獲得預期長度的擴增片段，說明本發明提供的分離方案不影響被分離DNA的擴增性質。
[0069]實施例四、從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段樣本並進行亞克隆
[0070]為了進一步研究本發明提供的技術方案對分離的DNA性質的影響，我們對被分離的DNA樣本進行了克隆實驗。
[0071]步驟一:獲得實施例三步驟四中的PCR產物，將400ng PCR產物上樣到含有EB的1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳，按照上述實施例的方法切割質粒電泳條帶所在位置的凝膠塊，用本發明提供的技術方案分離凝膠塊中的質粒DNA，將獲得的PCR產物溶於50uL去離子水。
[0072]步驟二:利用Promega的T載體克隆試劑盒，按照說明書的方案，將本實施例步驟一中獲得的PCR產物克隆到T載體中，然後按照分子克隆的實驗方案將PCR與T載體的連接產物導入E.Coli感受態細胞，隨後進行克隆培養。
[0073]步驟三:利用實施例三步驟二中的PCR擴增引物和擴增條件，對本實施例步驟二種獲得的陽性克隆進行驗證。
[0074]實驗結果及分析:實驗結果表明，所有檢測的5個陽性克隆中均包含預期插入的PCR產物，說明本發明提供的技術方案不影響被分離DNA片段的可克隆性質。
[0075]實施例五、從瓊脂糖凝膠中回收RNA樣本並進行RT-PCR擴增
[0076]為了進一步研究本發明提供的技術方案對被分離的RNA轉錄本的影響，我們對被分離的RNA樣本進行了 RT-PCR擴增研究。
[0077]步驟一:獲得Hela細胞來源的總RNA樣本，進行定量。
[0078]步驟二:18S rRNA片段的電分離。取1ug總RNA樣本，按照分子克隆的方法，進行I %的變性瓊脂糖凝膠電泳。按照上述實施例所描述的方法，獲得包含18S rRNA轉錄本的凝膠塊。用本發明提供的技術方案分離凝膠塊中的RNA轉錄本，將獲得的18S rRNA轉錄本溶於50uL RNase-free的去離子水。
[0079]步驟三:18S rRNA的逆轉錄和實時螢光定量PCR擴增:利用針對人18S rRNA設計的正向引物 5' -AAACGGCTACCACATCCAAG 和反向引物 5' -CCTCCAATGGATCCTCGTTA,對分離的18S rRNA轉錄本進行RT-PCR擴增。具體步驟如下:
[0080]I) RNA逆轉錄:使用天根生化科技公司的逆轉錄試劑盒(TIANScript M-MLV, cat:ER104-03)進行RNA樣本的逆轉錄反應，具體按照試劑盒說明書的方法進行，步驟如下:取luL18S rRNA樣本，加入2uL(1uM)6鹼基隨機逆轉錄引物，2uLdNTP(1mM)，混勻後置70°C水浴變性5分鐘；冰上放置3分鐘後取出，加入4uL5 XFirst-Strand Buffer, 0.5uL RNaseinhibitor (40U / uL)，IuL M-MLV (200U / uL)，總體積為 20 μ L ;混勻後短暫離心，置於Eppendorf PCR儀中進行逆轉錄反應，反應參數為25°C，10分鐘；42°C，50分鐘；95°C，5分鐘；隨後置於4°C保存。其中，RNase inhibitor (cat#N211)為Promega公司的產品。[0081 ] 2)實時螢光定量PCR:使用天根生化科技公司的的HotMaster Taq DNApolymerase (cat#:ET106-01-01)對樣本中目標轉錄本的含量進行測定，具體方法按產品說明書進行，步驟如下:取2uL逆轉錄產物，加入2.5uL10 X HotMasterTaq Buffer, 0.5uL (1uM)上遊引物，0.5uL (1uM)下遊引物，IuL dNTP 混合物(各
2.5uM), IuLSYBR Greenl (5 X), 0.2uL HotMaster Taq DNA polymerase (2.5u / uL),最後加入17.3uLddH20，反應總體積為25 μ L。混勻後短暫離心，置於Eppendorf PCR儀中進行PCR擴增反應，反應參數為95°C預變性2分鐘，95°C變性15秒，58°C退火15秒，72°C延伸30秒；循環次數為40個循環。每個反應設置3個重複。
[0082]步驟四:18S rRNA轉錄本的擴增產物分析。取2uL擴增產物，上樣到含有EB的1.2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳30分鐘後，在紫外凝膠成像儀下檢測擴增片段的大小。
[0083]實驗結果及分析:實驗結果表明，以電分離的人源18S rRNA轉錄本為模板，能夠獲得預期的擴增片段，說明本發明提供的技術方案不影響被分離RNA片段的RT-PCR擴增性質。
[0084]實施例六、從瓊脂糖凝膠中回收蛋白樣本並研究分離過程對蛋白質免疫原性的影響
[0085]為了研究本發明提供的技術方案對被分離蛋白質性質的影響，我們利用該技術對胰凝乳蛋白酶原進行了電分離，並對分離的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性進行了檢測。
[0086]步驟一:按照《分子克隆》的方法，配製用於蛋白質分離的瓊脂糖凝膠，將5mg購自Sigma的胰凝乳蛋白酶原(1500U / mg,貨號C4879)溶解在上樣緩衝液中，上樣後在100伏電壓條件下進行瓊脂糖電泳。電泳結束後取出凝膠，利用其他樣本孔的考馬斯亮藍染色標誌，獲得含有經電泳分離但未經染色的胰凝乳蛋白酶原的凝膠塊。
[0087]步驟二:利用上述實施例描述的方法，對凝膠塊中的胰凝乳蛋白酶進行電分離，對其中的蛋白成分用考馬斯亮藍G-250染色法進行定量，計算回收率。
[0088]步驟三:免疫血清的製備。獲得約9周齡的雄性C57小鼠，體重約22_25g。用去離子水將步驟二製備的胰凝乳蛋白酶和未經處理的胰凝乳蛋白酶稀釋到0.3ug / uL, 0.22uM除菌濾膜過濾。將兩種蛋白分子分別和免疫佐劑(QucikAntibody-Mouse5W,北京康碧泉生物科技有限公司，貨號:KX0210041，Iml /支)1:1混合後，小鼠後肢肌肉注射，每組6隻，20uL/只；對照組注射生理鹽水與佐劑1:1混合液，3隻，同樣方式注射。
[0089]2周後，重複注射加強免疫一次。首次注射後4周後，摘眼球取血。取血清後，室溫放置2h，4°C過夜，3000rpm離心15分鐘後，小心取血清，_80°C凍存備用。
[0090]步驟四:免疫原性分析。從上海恆斐生物公司購置小鼠al抗胰糜蛋白酶(AACT)酶聯免疫分析試劑盒。按照試劑盒說明書的要求，對經本技術方案處理的胰凝乳蛋白酶原和未處理的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性進行檢測。
[0091]實驗結果及分析:實驗結果表明生理鹽水處理組小鼠無抗體產生，電分離處理組與未處理組小鼠產生的抗體水平相當，統計結果無顯著性差異，說明經本發明技術處理不會影響蛋白質的空間構象及免疫原性。胰凝乳蛋白酶原的回收率為92%。
[0092]實施例七、從PAGE凝膠中回收DNA片段樣本並進行PCR擴增
[0093]為了進一步研究本發明提供的技術方案對PAGE凝膠中分離的DNA的性質的影響，我們開展了被分離的DNA樣本的PCR擴增實驗。
[0094]步驟一:獲得實施例三步驟二中的PCR擴增產物400ng，按照《分子克隆》所記載的實驗方案配置5%的PAGE DNA凝膠，將獲得的DNA上樣電泳，用上述實施例的方法切割DNA電泳條帶所在位置的凝膠塊，用本發明提供的技術方案分離凝膠塊中的DNA樣本，將獲得的質粒DNA溶於50uL去離子水。
[0095]步驟二:利用上遊引物5' -CCTCGCCTTTGCCGATCC和下遊引物
[0096]5' -GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC對分離的DNA樣本進行擴增，以檢測該分離過程對被分離樣本可擴增想的影響，具體如下。使用天根生化科技公司的HotMaster Taq DNApolymerase (cat#:ET106-01-01)對分離的質粒DNA中的目標片段進行擴增，具體方法按產品說明書進行，步驟如下:取0.5uL分離的質粒DNA溶液，加入2.5uL10XHotMaster TaqBuffer, 0.5uL (1uM)上遊引物，0.5uL (1uM)下遊引物，IuL dNTP 混合物(各 2.5uM)，IuLSYBR Green (5 X), 0.2uL HotMaster Taq DNA polymerase (2.5u / ul),最後加入 17.3uLddH20,反應總體積為25 μ L。混勻後短暫離心，置於Eppendorf PCR儀中進行PCR擴增反應，反應參數為95°C預變性2分鐘，95°C變性15秒，58°C退火15秒，72°C延伸30秒；循環次數為40個循環。每個反應設置3個重複。
[0097]步驟三:取PCR產物2uL，上樣到含有EB的1.2 %的瓊脂糖凝膠中，在4V / cm電壓條件下電泳30分鐘，電泳緩衝液為TAE。電泳結束後，用紫外凝膠成像儀對DNA條帶進行成像。
[0098]實驗結果及分析:步驟三的PCR擴增得到了預期長度的DNA片段，說明本發明提供的分離方案不影響從PAGE凝膠中分離的DNA樣本的可擴增性質。
[0099]實施例八、從PAGE凝膠中回收蛋白樣本並研究分離過程對蛋白質免疫原性的影響
[0100]為了研究本發明提供的生物大分子分離技術方案對從PAGE凝膠中分離的蛋白質的性質的影響，我們利用該技術對胰凝乳蛋白酶原進行了電分離，並對分離的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性進行了檢測。
[0101]步驟一:按照《分子克隆》的方法，配製用於蛋白質分離的SDS-PAGE凝膠，將5mg購自Sigma的胰凝乳蛋白酶原(1500U / mg,貨號C4879)溶解在上樣緩衝液中，進行PAGE凝膠電泳。電泳結束後取出凝膠，利用其他樣本孔的胰凝乳蛋白酶原電泳樣本的考馬斯亮藍染色標誌，獲得含有經電泳分離但未經染色的胰凝乳蛋白酶原的凝膠塊。
[0102]步驟二:利用上述實施例描述的方法，對凝膠塊中的胰凝乳蛋白酶進行電分離，對其中的蛋白成分用考馬斯亮藍G-250染色法進行定量，計算回收率。
[0103]步驟三:免疫血清的製備。獲得約9周齡的雄性C57小鼠，體重約22_25g。用去離子水將步驟二製備的胰凝乳蛋白酶和未經處理的胰凝乳蛋白酶稀釋到0.3ug / uL, 0.22uM除菌濾膜過濾。將兩種蛋白分子分別和免疫佐劑(QucikAntibody-Mouse5W,北京康碧泉生物科技有限公司，貨號:KX0210041，Iml /支)1:1混合後，小鼠後肢肌肉注射，每組6隻，20uL /只；對照組注射生理鹽水與佐劑1:1混合液，3隻，同樣方式注射。
[0104]2周後，重複注射加強免疫一次。首次注射後4周後，摘眼球取血。取血清後，室溫放置2h，4°C過夜，3000rpm離心15分鐘後，小心取血清，_80°C凍存備用。
[0105]步驟四:免疫原性分析。從上海恆斐生物公司購置小鼠al抗胰糜蛋白酶(AACT)酶聯免疫分析試劑盒。按照試劑盒說明書的要求，對經本技術方案處理的胰凝乳蛋白酶原和未處理的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性進行檢測。
[0106]實驗結果及分析:實驗結果表明生理鹽水處理組小鼠無抗體產生，電分離處理組與未處理組小鼠產生的抗體水平相當，統計結果無顯著性差異，說明經本發明技術處理不會影響蛋白質的空間構象及生物學活性。胰凝乳蛋白酶原的回收率為94%。
【權利要求】
1.一種電分離槽，該電分離槽包括分離的陽極區域和陰極區域、以及設置在陽極區域和陰極區域之間的凝膠區域，陽極區域中裝置有正電極，陰極區域中裝置有負電極。
2.權利要求1所述的分離槽，其特徵在於所述電分離槽陽極區域的容積為0.0l-1OmL0
3.權利要求1所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽由內、外兩個嵌套的垂直套管組成，陽極區域位於外套管中，陰極區域位於內套管中，凝膠區域位於內套管中的與外套管交界的區域，內套管底部為可通透的。
4.權利要求1所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽由內、外兩個嵌套的垂直套管組成，陽極區域位於內套管中，陰極區域位於外套管中，凝膠區域位於內套管中的與外套管交界的區域，內套管底部為可通透的。
5.權利要求1-4任一項所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽的凝膠區域為上寬下窄的漏鬥形結構。
6.權利要求1-5任一項所述的電分離槽，其特徵在於所述電分離槽的述凝膠區域下端設置有可拆卸的封閉裝置，所述可拆卸的封閉裝置優選為可拆除的錫箔紙。
7.—種從凝膠塊中分離生物大分子的方法，該方法包括以下步驟: 1)獲得權利要求1-6任一項所述的電分離槽； 2)獲得含有待分離生物大分子的凝膠塊，利用該凝膠塊製備凝膠層，使其能夠在電分離槽的陽極區域和陰極區域之間形成完整的分隔層，完全阻斷陽極區域緩衝液和陰極區域緩衝液之間的接觸； 3)使待分離的生物大分子在電場作用下從凝膠層中遷移出來； 4)收集分離的生物大分子。
8.權利要求7所述的方法，其特徵在於步驟2中製備所述凝膠層的方法為:熔解含有待分離生物大分子的凝膠塊，將凝膠熔液加入到電分離槽的凝膠區域中，凝固後形成所述凝膠層。
9.權利要求7所述的方法，其特徵在於步驟2中製備所述凝膠層的方法為:將含有待分離生物大分子的凝膠塊與一定量不含有生物大分子的凝膠熔液加入到電分離槽的凝膠區域中，使其共同凝固形成所述凝膠層。
10.權利要求7所述的方法，其特徵在於所述的待分離生物大分子選自核酸、蛋白質和多糖。
【文檔編號】C07H1/06GK104415661SQ201310402991
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】杜權 申請人:杜權