A型肉毒毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白與應用的製作方法

2023-05-26 23:18:01

專利名稱：A型肉毒毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因及其編碼蛋白與應用，特別是涉及一個A型肉毒毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白與其在製備A型肉毒毒素疫苗中的應用。
背景技術：
肉毒毒素(Botulinum Toxin，BoNT)是目前已知毒力最強的蛋白，1.0g肉毒毒素結晶物足以殺死100萬人，由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在厭氧環境中產生的外毒素有7個血清型(A-G)，其中，A、B型肉毒毒素是致人中毒的常見型，E、F型偶爾引起食物中毒流行，C、D型則僅引起動物、禽類中毒，G型引起中毒的報導較少。臨床觀察表明，A型肉毒毒素相比其它型可引起更嚴重的中毒症狀，並導致更高的死亡率。肉毒毒素中毒在人群中發病機率小，但其毒性大，致死率高，對公共衛生安全危害極大，必須引起人們的高度重視。由於產生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界廣泛存在，並且其芽孢對外界環境具有較強的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一個十分嚴重的公共衛生問題。近年，我國許多地區均發生數例肉毒中毒的疫情，甚至有群體肉毒毒素中毒事件發生。尤其是A型肉毒毒素還被數十個國家(如前蘇聯和伊拉克)用於製造生物武器，同時其也可被恐怖組織利用以製造生物恐怖。因此，進行肉毒毒素的防治研究無論是對國家生物安全，公共衛生安全，還是對人們的生命健康安全都具有重要的實際意義。
目前，類毒素疫苗(PBT)由於存在許多缺點，如工藝複雜、有危險性、保護性不好、免疫周期長，無法進行推廣應用，且未能獲得FDA批准，因此，研製高效、安全、方便的新型疫苗勢在必行。肉毒毒素由二硫鍵連接的兩條鏈組成(輕鏈50KD、重鏈100KD)，輕鏈是BoNT的毒性成分，而重鏈是結合神經細胞的毒素受體，是保護性結合和進入神經細胞所必需的，但其本身不具神經毒性。重鏈的50KDa C末端(簡稱為Hc)參與神經特異性結合，免疫學實驗已證明此受體區是保護性抗原。肉毒毒素新型疫苗研究主要集中在重組蛋白Hc亞單位疫苗和核酸疫苗兩個方向，此新型疫苗較類毒素疫苗有以下優點費用低，生產過程較安全，多次免疫後可以激發機體產生較強的免疫應答。
在大腸桿菌中有效地表達Hc片段能夠保護小鼠抵禦高劑量的肉毒毒素攻擊，具有良好的免疫原性。但惟一不盡如人意之處是以前無論是原始的，還是優化序列人工合成的A型肉毒毒素Hc基因在大腸桿菌中重組蛋白的表達量較低，常常為包涵體，並且產物不穩定，這在一定程度上限制了它的使用。為了解決重組蛋白Hc的表達問題，研究人員嘗試利用酵母系統中高效表達A型肉毒毒素重組蛋白Hc並獲得成功，人工合成的A型肉毒毒素Hc基因已經在酵母系統中得到了高效表達(Smith LA.，Toxicon，1998，361539-1548)，此外，用純化的重組蛋白Hc免疫動物(小鼠和非人類靈長類動物)可誘導產生針對高劑量的肉毒毒素的保護性免疫反應。下一個裡程碑是以其為候選Hc亞單位疫苗進行臨床試驗。最近，有兩篇文獻報導原始的A型肉毒毒素Hc基因在大腸桿菌中得到了有效地可溶性表達，其純化的表達水平為10-20mg/L，所用的原核表達載體為pET28，表達條件為在25℃或16℃下培養20小時或過夜(MahmoodTavallaie，et al，FEBS，2004，572299-306；Baldwin MR，et al，Infection andImmunity，2005，73(10)6998-7005)。天然的A型肉毒毒素受體結合區Hc片段基因序列A和T含量高達76％，並且經常出現連續的A和T串，另外，遍布整個基因序列有大量的稀有密碼子出現，使得該天然的基因在異種宿主細胞中的表達存在一定困難並且表達產物不穩定，產量極低。本發明的發明人曾嘗試直接PCR擴增原始的BoNT/A Hc基因，再將其克隆入原核表達載體並進行表達，結果Hc的表達水平很低並且為包涵體，與前人的實驗結果一致(LaPenotiere HF，et al.，Toxicon，1995，331383-1386)。
肉毒毒素的新型疫苗發展的另一個研究方向是研究肉毒毒素核酸疫苗。DNA疫苗優於類毒素疫苗和亞單位疫苗的主要優點是，操作簡便靈活、生產周期短、產品易於純化並方便儲藏。生產DNA疫苗不需要培養病原菌，較類毒素疫苗具有更高的生產安全性。抗原蛋白在免疫動物的細胞中產生，不需要進行蛋白純化，較亞單位疫苗使用更加方便。有兩篇文獻報導用含有A型肉毒毒素Hc基因的傳統DNA載體免疫小鼠後，能夠產生對A型肉毒毒素的保護作用(Jennifer Clayton，et al.，Vaccine，2000，181855-1862；Shyu RH，et al.，J Biomed Sci，2000，751-57)。但是，DNA疫苗免疫後產生的抗體水平較低，其相應的保護作用不高。複製型核酸疫苗是一種新型疫苗，它具有諸多優點，如仍具有複製子載體的全部特點，DNA製備簡單、成本低，疫苗更加安全，不像重組病毒顆粒疫苗存在病毒汙染問題，也不像傳統DNA疫苗，可能發生DNA整合到基因組，它是「自殺性」DNA疫苗，具有良好的安全性。到目前為止，利用基於DNA的SFV複製子研製A型肉毒毒素新型核酸疫苗還未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一個可激發機體對A型肉毒毒素產生免疫保護作用的A型肉毒毒素受體結合區Hc基因。
本發明所提供的A型肉毒毒素受體結合區Hc基因，名稱為HcA，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發機體對A型肉毒毒素產生免疫保護作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交並洗膜。
序列表中的SEQ ID NO1由1287個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1-1287鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的胺基酸殘基序列的蛋白質。
所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA編碼的蛋白(HcA)，是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發機體對A型肉毒毒素產生免疫保護作用的蛋白質。
序列表中的SEQ ID NO2由429個胺基酸殘基組成。
所述取代、缺失或添加的一至十個胺基酸殘基可以是非結構域中的胺基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。
含有本發明基因HcA的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
含有本發明基因HcA的表達載體包括原核表達載體、傳統真核表達載體及基於DNA的複製子載體等。
所述重組原核表達載體中A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的上遊還可連接有硫氧還蛋白基因Trx(來源於Novagen公司的pET-32a(+)載體中的Trx基因序列，位於該載體的自5』端第366-692鹼基處，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO8，編碼109個胺基酸殘基)。
用於構建含有本發明A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的重組原核表達載體的出發載體為任意一種原核表達載體，如pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等。
以pET-22b(+)為出發載體，構建的含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA和硫氧還蛋白基因Trx的重組原核表達載體為pTIG-Trx-Hc。
用於構建含有本發明A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的傳統真核表達載體的出發載體為任意一種真核表達載體，如pcDNA(pcDNA3.1(+)等)、pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(購於Promega公司)、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5等。
以pcDNA3.1(+)為出發載體，構建的含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的重組真核表達載體為pcDNASHc。
為使HcA分泌到胞外，所述基於DNA的複製子表達載體中A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的5』端還可連接有分泌信號肽(Murine Ig□-chain V-J2-C signalpeptide，簡稱S)編碼序列(來源於pSecTag，Invitrogen公司)，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO6，編碼序列表中SEQ ID NO7的胺基酸序列。
用於構建含有本發明A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的複製子表達載體的出發載體為任意一種複製子表達載體，如pSCAR(餘雲舟等，生物化學與生物物理進展，2006，33(1)87-94)。
以pSCAR為出發載體，構建的含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA和分泌信號肽S編碼序列的複製子表達載體為pSCARSHc。
上述重組表達載體可按照常規方法構建。
擴增HcA中任一片段的引物對也是本發明要保護的。
本發明還提供了一種表達上述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白HcA的方法。
本發明所提供的表達上述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白HcA的方法，是將上述含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白HcA。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS或E.coli Top10等。
所述酵母菌優選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏畢赤酵母優選為巴氏畢赤酵母GS115、KM71(購自美國Invitrogen公司)或SMD1168(購自美國Invitrogen公司)。
上述重組菌可按照常規方法構建。
培養含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的宿主細胞的培養基和培養條件，均可為培養出發宿主的培養基和培養條件。其中，培養所述重組大腸桿菌宿主時需加入誘導劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0.1-1.0mmol/L，優選為0.2mmol/L，誘導溫度為16-37℃，優選為30℃，誘導時間為2-4小時，優選為3小時。
本發明的A型肉毒毒素受體結合區Hc基因可用於製備A型肉毒毒素核酸疫苗，該基因的編碼蛋白可用於製備A型肉毒毒素亞單位疫苗。
所述DNA疫苗中的A型肉毒毒素受體結合區Hc基因可存在於基於DNA的複製子表達載體中，其中，以pSCAR為出發載體，構建的含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA和分泌信號肽S編碼序列的複製子表達載體為pSCARSHc。
需要的時候，以A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白製備的A型肉毒毒素亞單位疫苗中還可以融入顆粒白細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一種或多種細胞因子的基因或蛋白質作為分子免疫佐劑。
本發明的疫苗可以製成注射液、乾粉針劑或噴霧劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。
上述核酸疫苗和亞單位疫苗的用量可採用藥學領域中核酸疫苗和亞單位疫苗的常規劑量，如3-30μg(核酸疫苗)和1-10μg(亞單位疫苗)，並可根據實際情況調整。
本發明提供了一個A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA及其編碼蛋白。該基因是根據A型肉毒毒素受體結合區Hc片段的基因序列和胺基酸殘基序列優化後得到的，使A和T含量由76％降低至57％，並用大腸桿菌常用的密碼子替代稀有密碼子，同時兼顧真核細胞常用的密碼子，並保證所編碼的胺基酸殘基序列不變。將上述HcA基因克隆到原核表達載體中構建得到原核表達載體pTIG-Trx-Hc，將其轉化大腸桿菌(例如BL21(DE3)等)後培養重組菌，可使A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA在宿主菌中獲得了高效可溶性表達，可溶性表達產物佔細菌可溶性總量的36％以上，經一步小量純化可獲得30mg/L以上的重組蛋白HcA，用其免疫動物能誘導產生特異性的高滴度ELISA抗體、中和抗體及細胞免疫應答反應，並能對抗A型肉毒毒素的攻擊，實驗證明，A型肉毒毒素重組蛋白HcA以1μg劑量免疫二次或三次即可保護106LD50A型肉毒毒素的攻擊，表明本發明的重組蛋白HcA具有良好的免疫原性，可用於製備A型肉毒毒素亞單位疫苗。此外，針對傳統DNA載體免疫後產生的免疫保護力仍不夠強的缺點，本發明還將上述基因HcA克隆到基於DNA的SFV複製子載體中構建得到了SFV複製子載體，與所構建的含有HcA的傳統真核表達載體pcDNASHc相比，複製子載體可產生更高水平的體液和細胞免疫應答，並且所需免疫劑量更低，該複製子DNA載體能夠保護免疫動物免受更高水平的A型肉毒毒素的攻擊，可用於製備A型肉毒毒素核酸疫苗。本發明的A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA及其編碼蛋白將在製備A型肉毒毒素疫苗中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為製備抗A型肉毒毒素的亞單位疫苗和核酸疫苗的技術路線2為HcA大腸桿菌BL21(DE3)表達產物的SDS-PAGE檢測結果圖3為經親和層析純化的重組HcA的SDS-PAGE檢測結果圖4為含HcA的基於DNA的SFV複製子載體pSCARSHc和傳統的真核表達載體pcDNASHc的部分結構示意圖。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英俊生物技術有限公司合成。
實施例1、A型肉毒毒素受體結合區Hc基因HcA的獲得根據A型肉毒毒素受體結合區Hc片段的基因序列和胺基酸殘基序列(BoNT/A，A62，國際標準株，序列號M30196)優化Hc基因，使A和T含量由76％降低至57％，並用大腸桿菌常用的密碼子替代稀有密碼子，同時兼顧真核細胞常用的密碼子，並保證所編碼的胺基酸殘基序列不變，再根據優化後基因序列設計23對(46條)引物人工合成該基因片段，引物序列如下23條正向引物序列如下(5』-3』端)F1 CGGAATTCACCATGGCTGAATACATCAAGF2 AACATCATCAATACCTCCATCCTGAACCTGCGTTACGAATCCAATCACCTGATCGACCTF3 GTCTCGTTACGCTTCCAAAATCAACATCGGTTCTAAAGTTAACTTCGATCCAATCGACAF4 AGAATCAGATCCAGCTGTTCAATCTGGAATCTTCCAAAATCGAAGTTATCCTGAAGAATF5 GCTATCGTATACAACTCTATGTACGAAAACTTCTCCACCTCCTTCTGGATTCGTATCCCF6 AAAATACTTCAACTCCATCTCTCTGAACAATGAATACACCATCATCAACTGCATGGAAAF7 ACAATTCTGGTTGGAAAGTATCTCTGAACTACGGTGAAATCATCTGGACTCTGCAGGACF8 ACTCAGGAAATCAAACAGCGTGTTGTATTCAAATACTCTCAGATGATCAACATCTCTGAF9 CTACATCAATCGTTGGATCTTCGTTACCATCACCAACAATCGTCTGAATAACTCCAAAAF10 TCTACATCAACGGCCGTCTGATCGACCAGAAACCAATCTCCAATCTGGGTAACATCCACF11 GCTTCTAATAACATCATGTTCAAACTGGACGGTTGCCGTGACACTCACCGTTACATCTGF12 GATCAAATACTTCAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATCAAAGATCTGTF13 ACGACAACCAGTCCAATTCTGGTATCCTGAAAGACTTCTGGGGTGACTACCTGCAGTAC
F14 GACAAACCATACTACATGCTGAATCTGTACGATCCAAACAAATACGTTGACGTCAACAAF15 TGTAGGTATCCGTGGTTACATGTACCTGAAAGGTCCACGTGGTTCTGTTATGACTACCAF16 ACATCTACCTGAACTCTTCCCTGTACCGTGGTACCAAATTCATCATCAAGAAATACGCGF17 TCTGGTAACAAGGACAATATCGTTCGTAACAATGATCGTGTATACATCAATGTTGTAGTF18 TAAGAACAAAGAATACCGTCTGGCTACCAATGCTTCTCAGGCTGGTGTAGAAAAAATCTF19 TGTCTGCTCTGGAAATCCCAGACGTTGGTAATCTGTCTCAGGTAGTTGTAATGAAATCCF20 AAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAATGCAAAATGAATCTGCAGGACAACAATGGTAAF21 CGATATCGGTTTCATCGGTTTCCACCAGTTCAACAATATCGCTAAACTGGTTGCTTCCAF22 ACTGGTACAATCGTCAGATCGAACGTTCCTCTCGTACTCTGGGTTGCTCTTGGGAGTTCF23 ATCCCAGTTGATGACGGTTGGGGTGAACGTCCACTGCATCATCATCATCATCATTAAGCGGCCGCAAGCTTGGG與上述23條正向引物對應的23條反向引物如下(5』-3』端)B1CCCAAGCTTGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGTGGB2ACGTTCACCCCAACCGTCATCAACTGGGATGAACTCCCAAGAGCAACCCAGAGTACGAGB3AGGAACGTTCGATCTGACGATTGTACCAGTTGGAAGCAACCAGTTTAGCGATATTGTTGB4AACTGGTGGAAACCGATGAAACCGATATCGTTACCATTGTTGTCCTGCAGATTCATTTTB5GCATTTGTTAGTGATACCCTGGTCGTTCTTGGATTTCATTACAACTACCTGAGACAGATB6TACCAACGTCTGGGATTTCCAGAGCAGACAAGATTTTTTCTACACCAGCCTGAGAAGCAB7TTGGTAGCCAGACGGTATTCTTTGTTCTTAACTACAACATTGATGTATACACGATCATTB8GTTACGAACGATATTGTCCTTGTTACCAGACGCGTATTTCTTGATGATGAATTTGGTACB9CACGGTACAGGGAAGAGTTCAGGTAGATGTTGGTAGTCATAACAGAACCACGTGGACCTB10TTCAGGTACATGTAACCACGGATACCTACATTGTTGACGTCAACGTATTTGTTTGGATCB11GTACAGATTCAGCATGTAGTATGGTTTGTCGTACTGCAGGTAGTCACCCCAGAAGTCTTB12TCAGGATACCAGAATTGGACTGGTTGTCGTACAGATCTTTGATTTCTTTTTCGTTCAGTB13TCTTTGTCGAACAGATTGAAGTATTTGATCCAGATGTAACGGTGAGTGTCACGGCAACCB14GTCCAGTTTGAACATGATGTTATTAGAAGCGTGGATGTTACCCAGATTGGAGATTGGTTB15TCTGGTCGATCAGACGGCCGTTGATGTAGATTTTGGAGTTATTCAGACGATTGTTGGTGB16ATGGTAACGAAGATCCAACGATTGATGTAGTCAGAGATGTTGATCATCTGAGAGTATTTB17GAATACAACACGCTGTTTGATTTCCTGAGTGTCCTGCAGAGTCCAGATGATTTCACCGTB18AGTTCAGAGATACTTTCCAACCAGAATTGTTTTCCATGCAGTTGATGATGGTGTATTCAB19TTGTTCAGAGAGATGGAGTTGAAGTATTTTGGGATACGAATCCAGAAGGAGGTGGAGAAB20GTTTTCGTACATAGAGTTGTATACGATAGCATTCTTCAGGATAACTTCGATTTTGGAAGB21ATTCCAGATTGAACAGCTGGATCTGATTCTTGTCGATTGGATCGAAGTTAACTTTAGAAB22CCGATGTTGATTTTGGAAGCGTAACGAGACAGGTCGATCAGGTGATTGGATTCGTAACGB23CAGGTTCAGGATGGAGGTATTGATGATGTTCTTGATGTATTCAGCCATGGTGAATTCCG。
如圖1中的步驟A-C所示，首先，通過人工拼接的方法(重疊延伸PCR)，利用23對引物相互互補將全長序列拼接為三段，分別命名為A、B和C，反應結束後，對A、B和C三種PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用購自鼎國公司的DNA回收試劑盒回收長度分別約為500bp、400bp和400bp的目的片段並對其進行純化，將回收片段連接入到T-A載體pGEM-T(Promega公司)中，再將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞(TIANGEN)，篩選陽性克隆，提質粒，得到分別含有回收片段A、B、C的重組質粒，分別命名為pGEM-T-A、pGEM-T-B、pGEM-T-C，對其進行測序，測序結果表明擴增片段A具有序列表中的SEQ ID NO3的核苷酸序列，由484個鹼基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第1-161位胺基酸殘基；擴增片段B具有序列表中的SEQ ID NO4的核苷酸序列，由413個鹼基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第162-299位胺基酸殘基；擴增片段C具有序列表中的SEQ ID NO5的核苷酸序列，由390個鹼基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第300-429位胺基酸殘基，再將B和C拼接，50μl PCR反應體系為作為模板DNA的片段B和C各0.5μl，pfu Taq 0.5μl，10×PCR緩衝液(含Mg2+)5μl，dNTPs(各25mM)4μl，引物F10和B23各0.5μl，用ddH2O補充反應體系至50μl，PCR反應條件為先95℃3min；然後94℃50s，62℃50s，72℃60s，共25個循環；最後72℃10min，得到片段BC，最後將片段A和片段BC拼接，除模板外，PCR反應體系和反應條件與上述相同，對拼接後獲得的目的片段進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒回收長度分別為1287bp的目的片段並對其進行純化，將回收片段連接入到載體pGEM-T中，再將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，得到含有目的片段的重組質粒，命名為pGEM-Hc，對其進行測序，測序結果表明目的片段具有序列表中的SEQ ID NO1的核苷酸序列，由1287個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1-1287位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的胺基酸殘基序列的蛋白質，位於A型肉毒毒素的868aa-1296aa間，蛋白分子量約為50KD。測序結果表明獲得了序列正確的經優化的全長Hc基因，將該基因命名為HcA，其編碼蛋白命名為HcA。
實施例2、原核表達載體pTIG-Trx-Hc的構建及重組蛋白HcA在大腸桿菌中的表達與純化如圖1中的步驟D和E所示，用下述方法使HcA在大腸桿菌中獲得表達及純化，得到重組HcA一、原核表達載體pTIG-Trx-Hc的構建硫氧還蛋白(Trx)是參與新生蛋白肽鏈摺疊的輔助蛋白，當重組蛋白HcA與之共表達時，它可促進下遊正在摺疊的目的蛋白通過異構反應獲得正確的摺疊，另外，也能夠增強胞內蛋白質的二硫鍵的形成，使表達產物不易形成包涵體，能夠以可溶性形式表達，因此用下述方法構建含有Trx基因的HcA基因的原核表達載體1、重組載體pTIG-Trx的構建首先，通過普通PCR方法克隆(以載體pET-32a(+)為模板)硫氧還蛋白基因序列(來源於Novagen公司的pET-32a(+)載體中的Trx基因序列，位於該載體的自5』端第366-692位鹼基處，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO8，編碼109個胺基酸殘基)，然後將獲得的Trx基因序列連接入質粒載體pET-22b(+)(Novagen公司)的NdeI和EcoR I酶切位點之間，得到含有Trx基因的重組載體，命名為pTIG-Trx，其多克隆位點的後面具有編碼6個組氨酸的標籤序列(pET-22b(+)自帶)，多克隆位點的結構如下5』-Nde I-Trx-GCGGGATCCGG AATTCGA…-Sac I-Sal I-Hind III-Not I-XhoI-6His-TAG-3』RBS EcoR I。
2、原核表達載體pTIG-Trx-Hc的獲得以實施例1獲得的質粒pGEM-Hc為模板，在引物F-HcE5』-GCCGGAATTC GAATACATCAAGAACATCATC-3』(帶單下劃線鹼基為限制性內切酶EcoR I識別位點，方框內鹼基為終止密碼子，帶雙下劃線鹼基為起始密碼子)和引物R-HcX5』-CTAGCTCGAGAGTGGACGTTCACCCCAAC-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶XhoI識別位點)的引導下，PCR擴增全長HcA基因序列，並在序列兩端分別添加EcoR I和Xho I識別位點，反應結束後，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒回收長度約1300bp的目的片段並對其進行純化，將回收片段用EcoR I和Xho I進行雙酶切後與經相同酶雙酶切的載體pTIG-Trx連接，將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，測序，測序結果表明得到了序列及插入位置均正確的HcA的原核表達載體，命名為pTIG-Trx-Hc。
二、HcA在大腸桿菌中的表達及表達產物的純化1、HcA在大腸桿菌中的表達及表達產物的SDS-PAGE檢測將步驟一構建的HcA的原核表達載體pTIG-Trx-Hc轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(TIANGEN公司)，篩選陽性重組子，以轉化有pTIG-Trx空載體的重組菌為陰性對照，然後按1∶100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨苄青黴素的1000mL LB液體培養基中，在37℃、250rpm下進行大量培養，培養至對數生長期(OD600約為0.4-0.6)時加入化學誘導劑IPTG至終濃度為0.2mmol/L，在30℃下繼續誘導培養5小時，分別於誘導前、誘導3小時和5小時後取樣。培養結束後，超聲打碎細胞，離心收集上清進行12％SDS-PAGE檢測，結果如圖2所示(泳道1為誘導5小時的表達產物，泳道2為誘導3小時的表達產物，泳道3為蛋白標準分子量，泳道4為未誘導對照，泳道5為空載體對照)，結果顯示經誘導表達的重組蛋白以可溶性方式表達，分子量約為50KD，與預期的分子量一致，而未誘導的菌株和誘導的空載體對照未出現該目的蛋白帶，說明所表達的蛋白可能就是目的蛋白HcA，且由圖2可以看出，在30℃下誘導表達3小時後蛋白的表達量可達到較高水平，經分析，表達產物約佔細菌可溶性總蛋白的36％，5小時後可達53％。
2、表達產物的純化、Western blot和ELISA鑑定及穩定性檢測1)目的蛋白的純化步驟1所表達的重組蛋白HcA的C端含有六個組氨酸標籤，因此用Ni-NTA親和層析柱(購自法瑪西亞公司)並參照說明書對可溶性表達產物進行純化，純化方法為先將超聲上清與平衡後的Ni-NTA親和層析樹脂結合，然後用含10-100mM咪唑(10T和100mM的濃度均進行洗滌)的結合緩衝液洗滌，再用含500mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫，得到純化蛋白，然後對經純化的蛋白進行12％SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖3所示(泳道1為低分子量蛋白Marker，分子量範圍14.4-116KD，泳道2為經含500mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫後得到的純化產物，泳道3為PBS透析脫鹽後的產物)，檢測結果表明得到了高純度的目的蛋白，經薄層掃描分析，純化到的蛋白質純度達95％，產量可達30mg/L以上。
2)表達產物的Western blot和ELISA鑑定分別以鼠抗His-tag mAb(購自MERCK)和馬源抗BONT/A多抗(購自中國藥品生物製品檢定所)為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)或HRP標記兔抗馬IgG(購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗對空載體對照、誘導表達的超聲上清及純化的重組蛋白進行Western blot分析，結果誘導表達或經純化的重組蛋白與鼠抗His-tag mAb和馬源抗BoNT/A多抗均能特異性結合，大小位置與電泳位置一致，分子量約為50KD，表明誘導表達或經純化的重組蛋白即為目的蛋白HcA。另外，還用A型肉毒抗毒素對空載體對照、誘導表達的超聲上清及純化的重組蛋白進行了ELISA檢測，結果A型肉毒抗毒素與表達並經純化的BoN/A HcA蛋白具有特異結合活性，而與空載體誘導表達產物不結合，表明重組表達蛋白具有天然蛋白的分子構象，可以被特異性抗毒素所識別。
3)重組蛋白HcA的穩定性檢測從上述表達及純化過程中可見，表達的重組蛋白HcA比較穩定，在表達及純化過程中沒有發生降解。為了進一步鑑定純化的重組蛋白HcA在保存條件下的穩定性，對在不同溫度下保存一定時期(4℃(1個月)，-20℃和-80℃(3個月和6個月))的重組蛋白HcA進行12％SDS-PAGE檢測，結果純化的重組蛋白HcA在4℃(1個月)，-20℃和-80℃(3個月和6個月)均保持穩定，即使是經反覆凍融也沒有發生降解，表明本發明用上述方法表達獲得的重組HcA具有較高的穩定性。
實施例3、重組HcA蛋白亞單位疫苗免疫小鼠後體液和細胞免疫水平檢測及體內中和活性測定以實施例2中表達並經純化的重組蛋白HcA作為亞單位疫苗免疫小鼠，以檢測其免疫原性，具體方法為將Balb/c小(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫學科學院實驗動物中心)隨機分為4組，每組6隻，免疫組I、II和III分別免疫10μg、5μg和1μg重組蛋白HcA，而對照組免疫不含重組蛋白HcA的PBS。免疫前，將重組蛋白HcA溶於200μlPBS，再與相同劑量的福氏完全佐劑(Sigma公司)按1∶1比例混合完全，然後皮下多點注射進行初次免疫，2周後將相同劑量的重組蛋白HcA溶於200μl PBS後與相同劑量的福氏不完全佐劑(Sigma公司)按1∶1比例混合完全皮下多點注射進行加強免疫，2周後再以相同劑量進行加強免疫一次，皮下多點及腹腔注射免疫一次。每次免疫前，以及最後一次免疫後第2和第4周，小鼠尾部或眼球採血，分離血清，用ELISA法(用酶聯免疫板包被HcA抗原，濃度為2μg/mL，用分離的免疫小鼠血清為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)為二抗)測定血清抗體。淋巴細胞的增殖能力是細胞免疫應答的一個重要指標，用MTS法測定淋巴細胞的增殖能力，方法為最後一次免疫後第4周取脾細胞，製備濃度為106個/mL的脾細胞懸液，在體外用抗原HcA，濃度為10μg/mL進行刺激，4天後用MTS法檢測T細胞增殖能力。
ELISA檢測結果免疫一次後，免疫組I(10μg高劑量組)、II(5μg中劑量組)和III(1μg低劑量組)血清抗體滴度分別達到12800、6400和3200，隨著免疫次數的增加，抗體滴度也得到相應提高，免疫4次後即可產生高水平的抗體滴度，分別達409600、409600和204800，並且對照免疫組血清與免疫前相比始終為陰性，上述檢測結果表明重組蛋白HcA免疫小鼠後可使其體內產生較高滴度的特異性抗體。
淋巴細胞的增殖能力的MTS法測定結果表明免疫組小鼠體內誘導產生了特異的T細胞免疫反應，其SI值分別為1.9、2.5和2.4，而對照免疫組小鼠的SI值為1.1(P＜0.05，差異顯著)。
上述檢測結果表明各劑量免疫組均能夠誘導動物產生特異性的高滴度抗體並可引起細胞免疫應答。
此外，還用經典的體內中和實驗測定了免疫小鼠血清抗體的體內中和活性及中和抗體效價，方法為將免疫組I、II和III血清抗體按1∶10稀釋後能夠保護10LD50和100LD50A型肉毒毒素的攻擊；然後，進一步將免疫組I血清抗體分別按1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000比例進行稀釋後，用10LD50和100LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標準株，購自蘭州生物製品研究所)進行攻擊，結果血清抗體按1∶1000稀釋時能夠完全保護10LD50A型肉毒毒素的攻擊，血清抗體按1∶10000比例稀釋時，也能部分保護10LD50A型肉毒毒素的攻擊，上述結果表明免疫小鼠血清中含有較高水平的A型肉毒毒素中和抗體，免疫血清也可中和體內A型肉毒毒素，預防中毒，因此，本發明的HcA可用於製備高滴度免疫血清，用於體內中和A型肉毒毒素(抗毒素)或用於製備A型肉毒毒素亞單位疫苗。
實施例4、檢測重組HcA蛋白亞單位疫苗免疫小鼠後對A型肉毒毒素的保護作用實施例3的實驗結果表明1μg重組蛋白HcA免疫小鼠3次後即可產生高滴度的抗體水平和中和抗體，用下述方法進一步評價重組蛋白HcA免疫小鼠後對A型肉毒毒素保護作用用1μg重組蛋白HcA按實施例3的方法免疫二或三次的Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫學科學院實驗動物中心)進行攻毒試驗，以PBS免疫的小鼠為對照，統計存活率及時間，首先對1μg重組蛋白HcA免疫二次的小鼠用104LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標準株，購自蘭州生物製品研究所)進行攻毒，結果如表1所示，表明其能保護A型肉毒毒素攻擊，隨後加大劑量，用105或106LD50A型肉毒毒素對二次免疫的其它組小鼠以及用105和106LD50A型肉毒毒素對經三次免疫的小鼠進行攻毒，結果如表1所示，表明這些免疫組小鼠均可保護A型肉毒毒素攻擊，並且免疫組小鼠無異常症狀，但對照組小鼠用102LD50A型肉毒毒素進行攻毒，小鼠均發生肉毒毒素中毒症狀，在5小時內死亡。以上試驗結果表明，HcA具有良好的免疫原性，以1μg劑量免疫二次即可保護106LD50A型肉毒毒素的攻擊，故可用於製備A型肉毒毒素亞單位疫苗，以預防A型肉毒毒素中毒。
表1 重組蛋白HcA免疫小鼠保護A型肉毒毒素攻毒的試驗結果

實施例5、HcA的SFV複製子載體和傳統真核表達載體的構建用下述方法構建含有本發明基因HcA的SFV複製子載體和傳統的真核表達載體一、HcA的SFV複製子載體的構建pSFV1為Invitrogen公司的基於RNA的複製子表達載體，本發明的發明人以semliki森林病毒衍生的複製子載體pSFV1為骨架，通過在5′UTR上遊克隆入CMV啟動子，在3′UTR下遊插入BGH轉錄終止子序列和自我剪切核酶HDVr序列，將其改造成基於DNA的複製子載體系統，命名為pSCAR，該載體的部分結構示意圖見圖4中的圖A，該複製子載體可在體內外高水平表達外源基因，其詳細構建方法見文獻(餘雲舟等，生物化學與生物物理進展，2006，33(1)87-94)。首先，以質粒pGEM-Hc為模板，在引物F-HcN5』-GCCGCATATGGGAATACATCAAGAACATCATCAATACCTCC-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Nde I識別位點)和序列R-HcC5』-TGACATCGATTTACAGTGGACGTTCACCCCAAC-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Cla I識別位點)的引導下，PCR擴增長度約為1.3kb基因HcA的全長序列，回收並純化該目的片段後，將其用限制性內切酶Nde I和Cla I進行雙酶切後與經相同酶雙酶切的載體pSCARS(在pSCAR的引入一個分泌信號肽編碼序列(即Ig□-chain leader sequence，命名為S(來源於pSecTag，Invitrogen公司)，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO6，編碼序列表中SEQ ID NO7的胺基酸序列)後得到的重組載體，該序列位於pSCAR的BamH I和Nde I酶切位點之間)連接，將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，測序，測序結果表明得到了序列及插入位置均正確的HcA的SFV複製子載體，命名為pSCARSHc，其部分結構示意圖見圖4中的圖A。
二、HcA的傳統的真核表達載體的構建將步驟一構建的含HcA的SFV複製子載體pSCARSHc用限制性內切酶BamH I和SpeI進行雙酶切後，回收並純化約2.0Kb的含有基因HcA的DNA片段，將其與經相同酶雙酶切的載體的pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)連接，將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，測序，測序結果表明得到了序列及插入位置均正確的HcA的傳統真核表達載體，命名為pcDNASHc，其部分結構示意圖見圖4中的圖B。
實施例6、HcA的SFV複製子載體和傳統真核表達載體體外表達A型肉毒毒素受體結合區Hc的檢測首先，將pSCARSHc轉染BHK21細胞和CHO細胞(均購自ATCC公司)，以pSCAR空載體為對照，分別以實施例3獲得的重組蛋白HcA免疫小鼠後獲得的多抗血清和A型肉毒毒素抗毒素多抗(購自衛生部北京生物製品研究所)為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)和HRP標記兔抗馬IgG(購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗，用免疫螢光法(IFA)檢測經pSCARSHc轉染的BHK21細胞和CHO細胞，結果均呈陽性，而pSCAR空載體轉染細胞無螢光，檢測結果表明HcA在轉染細胞中得到了表達。
然後，提取經pSCARSHc轉染的BHK21細胞和CHO細胞，以及pSCAR空載體轉染細胞的總蛋白，再對上述總蛋白及上述轉染細胞的培養上清液，分別以重組蛋白HcA免疫小鼠後獲得的多抗血清和A型肉毒毒素抗毒素多抗為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)和HRP標記兔抗馬IgG(購自北京中杉金橋生物有限公司)為二抗進行Western blot檢測，結果經pSCARSHc轉染的BHK21細胞和CHO細胞，及其培養上清在50kDa位置有特異條帶產生，與HcA重組蛋白大小一致，而對照細胞中則無此條帶，表明HcA在pSCARSHc轉染細胞中獲得表達，pSCARSHc轉染細胞的培養上清中也含有BoNT/A Hc抗原，上述結果表明含分泌信號肽序列及HcA的SFV複製子載體能夠有效地分泌表達BoNT/A Hc抗原，即HcA。
另外，還用ELISA法檢測了分別經pSCARSHc、pcDNASHc轉染的BHK21細胞和CHO細胞的裂解液與培養上清與A型肉毒抗毒素多抗和重組蛋白HcA免疫小鼠後獲得的多抗血清的特異結合活性，以pSCAR空載體轉染細胞為對照，結果pSCARSHc和pcDNASHc轉染細胞的細胞裂解液與培養上清均能與A型肉毒抗毒素多抗和重組蛋白HcA免疫小鼠後獲得的多抗血清特異結合，而與空載體對照不結合，表明重組表達蛋白HcA具有天然蛋白的分子構象，可以特異性被A型肉毒抗毒素多抗識別。
實施例7、HcA的SFV複製子載體和傳統真核表達載體疫苗的免疫原性比較經研究發現，複製型DNA載體在低劑量時就可誘導產生良好的免疫反應，其用量遠遠低於傳統DNA載體(Leitner WW，et al.，Cancer research，2000，60(1)51-55)。本實施例對不同劑量的HcA的SFV複製子載體(3-100μg)免疫小鼠後的免疫應答反應進行了評價，同時以HcA的傳統DNA真核表達載體為對照。具體方法為分別用3μg、30μg和100μg的SFV複製子載體pSCARSHe和傳統DNA載體pcDNASHc分別免疫Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫學科學院實驗動物中心)，每個劑量組6隻小鼠，免疫途徑為腿部肌肉注射，共免疫4次，間隔2周，以pSCAR空載體免疫組為對照。免疫結束後28天，用ELISA法檢測小鼠的體液免疫水平，用免疫後小鼠血清為一抗，用以HRP標記羊抗鼠IgG(購自Sigma公司)為二抗測定血清抗體。淋巴細胞的增殖能力是細胞免疫應答的一個重要指標，還用MTS法測定淋巴細胞的增殖能力，方法為最後一次免疫後第4周取脾細胞，製備濃度為106個/mL的脾細胞懸液，在體外用抗原HcA進行刺激，4天後用MTS法檢測T細胞增殖能力。
ELISA法檢測結果為3μg和30μg SFV複製子載體pSCARSHc免疫小鼠的體液抗體水平高於100μg免疫組的抗體水平(P＜0.05，說明差異顯著)，是後者的6-7倍，達到12800-25600，表明DNA複製子疫苗在較低劑量時能夠誘導產生更強的免疫反應，而在較高的劑量(100μg)時反而不能產生良好的免疫反應，這種表現正是複製子疫苗的特點，也與大多數已報導的試驗結果一致。而與傳統DNA載體相比，複製子載體在低劑量時產生更高的抗體水平(P＜0.01，說明差異極顯著)，在3μg時提高了近50倍，30μg提高了13倍以上，體現了DNA複製子疫苗用量少，效果好的優點。
MTS測定結果表明HcA的SFV複製子載體pSCARSHc和傳統DNA載體pcDNASHc疫苗的各免疫組均誘導產生了特異的T細胞免疫反應(P＜0.05，與空載體對照相比)，與100μg免疫組相比，複製子疫苗在3μg和30μg時可誘導較高T細胞增殖反應(P＜0.01)，複製子疫苗各免疫組顯著地高於傳統DNA疫苗免疫組(P＜0.05)，尤其是在低劑量時前者極顯著地高於後者(P＜0.01)。
上述檢測結果表明，HcA的SFV複製子載體pSCARSHc和傳統DNA載體pcDNASHc免疫小鼠後都能誘導產生特異性的體液免疫應答，經多次加強免疫後可達到一個相當高的水平，高於國外Hc核酸疫苗的同劑量報導水平，並且與傳統DNA載體相比，SFV複製子載體在低劑量時可誘導體內產生更高的抗體水平和細胞免疫水平，說明SFV複製子疫苗具有更好的免疫效果。
實施例8、檢測HcA的SFV複製子載體疫苗免疫小鼠後對A型肉毒毒素保護作用將30μg的HcA的SFV複製子載體pSCARSHc免疫Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫學科學院實驗動物中心)，共免疫3次，間隔兩周，免疫結束後用ELISA法檢測體液免疫水平。結果攻毒試驗前免疫組抗體滴度為1600-3200。然後進行攻毒試驗，方法為以pSCAR空載體免疫的小鼠為對照，統計抗體滴度及存活率，首先對上述經30μg的HcA的SFV複製子載體pSCARSHc免疫3次的Balb/c小鼠用102LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標準株，購自蘭州生物製品研究所)進行攻毒，結果如表2所示，表明SFV複製子載體pSCARSHc免疫小鼠3次即可完全保護102LD50A型肉毒毒素的攻擊，但對照組小鼠用102LB50A型肉毒毒素進行攻毒，小鼠均發生肉毒毒素中毒症狀，在5小時內死亡；隨後加大劑量，分別用103、106LD50A型肉毒毒素對3次免疫的小鼠進行攻毒，結果如表2所示，免疫組小鼠可保護103LD50A型肉毒毒素攻擊，並且免疫組小鼠無異常症狀，但106LD50A型肉毒毒素攻擊組小鼠發生肉毒毒素中毒症狀(與對照組相比，其中毒較輕，死亡時間延後)。以上試驗結果表明，本發明的HcA的SFV複製子載體疫苗具有良好的免疫原性，以30μg劑量免疫3次即可保護103LD50A型肉毒毒素的攻擊，故可用於製備A型肉毒毒素核酸疫苗，以預防A型肉毒毒素中毒。
表2 HcA的SFV複製子核酸疫苗免疫小鼠對保護A型肉毒毒素攻毒試驗結果

實施例9檢測HcA的SFV複製子核酸疫苗和HcA亞單位疫苗聯合應用免疫小鼠後的體液和細胞免疫水平及對A型肉毒毒素的保護作用實施例7和實施例8的實驗結果表明HcA的SFV複製子核酸疫苗經多次免疫後誘導體內產生了較高的抗體水平，但與重組蛋白HcA免疫組相比，還是有很大的差距，故其可能產生的保護作用不夠高，為了進一步提高HcA的SFV複製子核酸疫苗的免疫原性，將HcA複製子核酸疫苗和HcA亞單位疫苗聯合應用免疫小鼠檢測體液和細胞免疫水平及對A型肉毒毒素的保護作用，具體方法為將Balb/c小(6-8周齡，雌性，SPF級，購自軍事醫學科學院實驗動物中心)隨機分為4組，每組6或8隻，組1、組2和組3先用30μg的HcA的SFV複製子載體pSCARSHc免疫2次，間隔兩周，再將重組蛋白HcA溶於200μl PBS，然後與相同劑量的福氏完全佐劑(Sigma公司)按1∶1比例混合完全，皮下多點注射免疫1次，同時組4為對照組，用相同劑量的pSCARSHc免疫3次。免疫結束後2周，小鼠尾部或眼球採血，分離血清，用ELISA法檢測體液免疫水平。ELISA檢測結果表明，HcA亞單位疫苗加強免疫後能夠大幅度地提高體內抗體水平，聯合應用組產生的抗體水平與亞單位疫苗免疫組的水平相當，並且遠遠高於SFV複製子核酸疫苗組(P＜0.01)，顯著提高了SFV複製子核酸疫苗的抗體水平，另外細胞免疫水平也得到了增強。然後進行攻毒試驗，方法為統計抗體滴度及存活率，首先對上述經3次免疫的4組Balb/c小鼠用102、104、105和106LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，國際標準株，購自蘭州生物製品研究所)進行攻毒，結果如表3所示，表明HcA亞單位疫苗加強免疫後能夠大幅度地提高免疫小鼠對A型肉毒毒素的保護作用，聯合免疫組小鼠可保護104LD50A型肉毒毒素攻擊，但對照組組4的小鼠用102LD50A型肉毒毒素進行攻毒，小鼠即發生肉毒毒素中毒症狀，在5小時內死亡；隨後加大劑量，分別用105、106LD50A型肉毒毒素對3次免疫的聯合免疫組小鼠進行攻毒，結果如表3所示，免疫組小鼠對105、106LD50A型肉毒毒素攻擊均可保護，並且免疫小鼠無異常症狀。上述實驗結果表明，HcA的SFV複製子核酸疫苗初次免疫和HcA亞單位疫苗加強免疫策略(DNA-primeprotein-booster)能夠大幅度提高核酸疫苗的特異性體液免疫水平和細胞免疫水平，並能提高核酸疫苗的保護能力，故在提高A型肉毒毒素保護效果和減少核酸疫苗的免疫次數，以及豐富免疫應答途經等方面是一種良好的免疫策略，可用於研製A型肉毒毒素疫苗。
表3 HcA的SFV複製子核酸疫苗和HcA亞單位疫苗聯合應用免疫小鼠後保護A型肉毒毒素攻毒試驗結果

序列表160821012111287212DNA213人工序列220
223
4001gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac60ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat120ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc180ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt240cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc300atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg360caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc420tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc480aaaatctaca tcaacggccg tctgatcgac cagaaaccaa tctccaatct gggtaacatc540cacgcttcta ataacatcat gttcaaactg gacggttgcc gtgacactca ccgttacatc600tggatcaaat acttcaatct gttcgacaaa gaactgaacg aaaaagaaat caaagatctg660tacgacaacc agtccaattc tggtatcctg aaagacttct ggggtgacta cctgcagtac720gacaaaccat actacatgct gaatctgtac gatccaaaca aatacgttga cgtcaacaat780gtaggtatcc gtggttacat gtacctgaaa ggtccacgtg gttctgttat gactaccaac840atctacctga actcttccct gtaccgtggt accaaattca tcatcaagaa atacgcgtct900ggtaacaagg acaatatcgt tcgtaacaat gatcgtgtat acatcaatgt tgtagttaag960aacaaagaat accgtctggc taccaatgct tctcaggctg gtgtagaaaa aatcttgtct1020gctctggaaa tcccagacgt tggtaatctg tctcaggtag ttgtaatgaa atccaagaac1080gaccagggta tcactaacaa atgcaaaatg aatctgcagg acaacaatgg taacgatatc1140ggtttcatcg gtttccacca gttcaacaat atcgctaaac tggttgcttc caactggtac1200aatcgtcaga tcgaacgttc ctctcgtact ctgggttgct cttgggagtt catcccagtt1260gatgacggtt ggggtgaacg tccactg1287
2102211429212PRT213人工序列220
223
400 2Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr1 5 10 15Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn20 25 30Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln35 40 45Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala50 55 60Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile65 70 75 80Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr85 90 95Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn100 105 110Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln115 120 125Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile130 135 140Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser145150 155 160Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn165 170 175Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly180 185 190
Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe195 200 205Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln210 215 220Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr225 230 235 240Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val245 250 255Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro260 265 270Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr275 280 285Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp290 295 300Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys305 310 315 320Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu325 330 335Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln340 345 350Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys355 360 365Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly370 375 380Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr385 390 395 400Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu405 410 415Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu420 4252103211484212DNA
213人工序列220
223
4003gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac60ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat120ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc180ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt240cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc300atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg360caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc420tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc480aaaa 4842104211413212DNA213人工序列220
223
4004tctacatcaa cggccgtctg atcgaccaga aaccaatctc caatctgggt aacatccacg60cttctaataa catcatgttc aaactggacg gttgccgtga cactcaccgt tacatctgga120tcaaatactt caatctgttc gacaaagaac tgaacgaaaa agaaatcaaa gatctgtacg180acaaccagtc caattctggt atcctgaaag acttctgggg tgactacctg cagtacgaca240aaccatacta catgctgaat ctgtacgatc caaacaaata cgttgacgtc aacaatgtag300gtatccgtgg ttacatgtac ctgaaaggtc cacgtggttc tgttatgact accaacatct360acctgaactc ttccctgtac cgtggtacca aattcatcat caagaaatac gcg 4132105
211390212DNA213人工序列220
223
4005tctggtaaca aggacaatat cgttcgtaac aatgatcgtg tatacatcaa tgttgtagtt60aagaacaaag aataccgtct ggctaccaat gcttctcagg ctggtgtaga aaaaatcttg120tctgctctgg aaatcccaga cgttggtaat ctgtctcagg tagttgtaat gaaatccaag180aacgaccagg gtatcactaa caaatgcaaa atgaatctgc aggacaacaa tggtaacgat240atcggtttca tcggtttcca ccagttcaac aatatcgcta aactggttgc ttccaactgg300tacaatcgtc agatcgaacg ttcctctcgt actctgggtt gctcttggga gttcatccca360gttgatgacg gttggggtga acgtccactg 390210621163212DNA213人工序列220
223
4006atggagacag acacactcct gctctgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt60gac 63210721121212PRT213人工序列
220
223
4007Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp202108211327212DNA213人工序列220
223
4008agcgataaaa ttattcacct gactgacgac agttttgaca cggatgtact caaagcggac60ggggcgatcc tcgtcgattt ctgggcagag tggtgcggtc cgtgcaaaat gatcgccccg120attctggatg aaatcgctga cgaatatcag ggcaaactgg ccgttgcaaa actgaacatc180gatcaaaacc ctggcactgc gccgaaatat ggcatccgtg gtatcccgac tctgctgctg240ttcaaaaacg gtgaagtggc ggcaaccaaa gtgggtgcac tgtctaaagg tcagttgaaa300gagttcctcg acgctaatct ggcggga32權利要求
1.A型肉毒毒素受體結合區Hc基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發機體對A型肉毒毒素產生免疫保護作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.權利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.根據權利要求2所述的蛋白，其特徵在於所述蛋白是下述胺基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發機體對A型肉毒毒素產生免疫保護作用的蛋白質。
4.含有權利要求1所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於所述含有權利要求1所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的重組原核表達載體中所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的上遊還連接有硫氧還蛋白Trx基因；用於構建所述含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的重組原核表達載體的出發載體為pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a；以pET-22b(+)為出發載體，構建的含有所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因和硫氧還蛋白基因的重組原核表達載體為pTIG-Trx-Hc。
6.根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於用於構建含有權利要求1所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的傳統真核表達載體的出發載體為pcDNA、pCMV5、pSilence1.0-U6、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5；以pcDNA3.1(+)為出發載體，構建的含有所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的重組真核表達載體為pcDNASHc。
7.根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於所述含有權利要求1所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的重組原核表達載體中所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的5』端還連接有分泌信號肽S編碼序列，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO6，編碼序列表中SEQ ID NO7的胺基酸序列；用於構建含有所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的複製子表達載體的出發載體為pSCAR；以pSCAR為出發載體，構建的含有A型肉毒毒素受體結合區Hc基因和分泌信號肽S編碼序列的複製子表達載體為pSCARSHc。
8.一種表達權利要求2或3所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白的方法，是將含有權利要求1所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白。
9.權利要求1所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因在製備A型肉毒毒素核酸疫苗中的應用。
10.權利要求2或3所述A型肉毒毒素受體結合區Hc基因編碼蛋白在製備A型肉毒毒素亞單位疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一個A型肉毒毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白與應用。其目的是提供一個A型肉毒毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白與其在製備A型肉毒毒素疫苗中的應用。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發機體對A型肉毒毒素產生免疫保護作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的A型肉毒毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白將在製備A型肉毒毒素疫苗中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/66GK101054582SQ200710089588
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月3日 優先權日2006年10月23日
發明者俞煒源, 餘雲舟, 孫志偉, 劉志剛, 王雙 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所