一種識別葉綠素的磁性分子印跡材料及其製備方法和應用與流程

2023-05-27 00:00:18 1

本發明涉及材料、分析化學技術領域，具體的說涉及一種識別葉綠素的磁性分子印跡材料及其製備方法和應用，。

背景技術：

農藥在作物和環境中的蓄積和殘留一直是威脅人類食品安全和健康的重要來源之一。為了增加世界糧食的生產量，現代農業廣泛使用化肥和農藥。其中農藥的使用種類繁多，包括有機磷(OOPs)，有機氯(OCPs)和擬除蟲菊酯類殺蟲劑等。大量使用這些農藥的後果便是這些化學物及其代謝產物在水和土壤等環境中殘留和富集，並通過食物鏈最終進入人體。許多研究已經證明，部分農藥具有致癌性，細胞毒性，遺傳毒性，致突變性，致畸性和免疫損傷等，而高毒和劇毒的農藥即使含量極低也會對非靶標生物和人類的健康存在危害。因此作物和環境中的農藥殘留監測也就成為了保障人類健康的必要手段。有鑑於此，農藥殘留檢測已經成為食品安全例行監測中重要的一環。

準確測定農藥殘留量，監控其在規定的殘留限量範圍內，是當前保障食品安全和避免貿易糾紛的有效手段。2014年8月1日，食品中農藥最大殘留限量新國標GB2763-2014實施，較此前標準分別增加了65種農藥、43種食品及1357項限量指標，約91％的限量等同或嚴於國際食品法典標準。因此建立農產品中痕量農藥殘留的準確、靈敏的檢測技術，進而對農產品質量安全風險評估提供大數據支持，以及保障國民健康均具有重要意義。

農藥殘留分析的常用方法有很多種：如氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜-質譜聯用(GC-MS/MS，UPLC-MS/MS)、免疫分析法、毛細管電泳分析等。大部分的方法在檢測過程中還需要進行前處理，目前報導的前處理技術有液液萃取、基質固相分散、單液滴微萃取、固相萃取和分散固相萃取等。尤其值得一提的是2003年美國農業部開發的一種突破性的樣品製備方法，簡化了農藥分析中樣品製備步驟，即QuEChERS方法。目前，此方法在歐盟和美國被廣泛使用。不過研究者發現其局限性是：QuEChERS方法中使用的石墨化炭黑(GCB)不僅對平面結構的分子如葉綠素有很強的吸附作用，可以去除基質中的色素雜質，而且對同樣具有平面結構的農藥分子也有很強的吸附能力，從而降低其回收率。而平面結構的農藥並不少，常見的有多菌靈，百菌清，部分三嗪類除草劑和氨基甲酸酯類殺蟲劑等。二者之間存在矛盾，若增加GCB的用量則除盡葉綠素的同時會顯著降低平面結構農藥的回收率，若減少GCB的用量兼顧平面結構農藥的回收率則葉綠素去除不完全而出現高色素農產品樣品中最常見的嚴重的基質幹擾問題，兩種情況都會影響農藥殘留量的準確定量。因此，需要開發一種可選擇性吸附葉綠素，而對平面結構農藥無吸附的新吸附材料，以彌補石墨化炭黑的不足。

近些年，分子印跡材料(MIPs,molecularly imprinted polymers)在固相萃取和傳感器製備等方面發揮了重大作用，引起了人們的廣泛重視。一般而言，分子印跡技術是指以某一特定的目標分子為模板，製備對該分子有特異選擇性識別的聚合物的技術。該技術已經廣泛運用在眾多領域，然而目前報導的適用於農藥檢測的分子印跡材料通常均為專一性檢測某種農藥分子(即模板分子)或結構相近的化合物，運用在農產品安全檢測中時無法實現多種類的農藥多殘留檢測。

技術實現要素：

本發明首先提供了一種識別葉綠素的磁性分子印跡材料的製備方法，該方法包括如下步驟：

(1)磁性納米粒子Fe3O4的合成：

將六水合物氯化鐵(FeCl3·6H2O)和四水合物氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)分別溶於水中，然後兩者混合併通入氮氣保護；

取水和氨水倒入燒瓶中，置於30-40℃水浴鍋中，攪拌並通氮除氧，然後加入上述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合水溶液，攪拌1-2h，反應完成後將得到的黑色物質用磁鐵分離，用水洗滌、，乾燥，得到磁性納米粒子Fe3O4；

(2)基丙烯酸(MAA)對磁性納米粒子Fe3O4表面進行修飾：

將上述磁性納米粒子Fe3O4分散於第一有機溶劑中，加入MAA，攪拌反應20-30h；

反應完成後，將得到的修飾好的Fe3O4用磁鐵分離，用水和乙醇分別洗滌、乾燥，得到MAA表面修飾的磁性納米Fe3O4顆粒；

(3)磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的合成：

將上述MAA表面修飾的磁性納米Fe3O4顆粒分散於第二有機溶劑中，稱取含卟啉環類化合物模板分子和功能單體也溶於第二有機溶劑中，超聲20-50min後兩者混合，再超聲20-50min；

向混合液中加入交聯劑和引發劑，通入氮氣2-7min後，密封容器；

在40-70℃下水浴搖床，自由基聚合反應16-30h；

反應完成後，將得到的分子印跡聚合物用磁鐵分離，分別用水和第三有機溶劑洗滌，最後至PH值6-7，乾燥，得到Fe3O4@MIP。

其中優選的方案為：

步驟(1)中FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的摩爾比是1：(1.5-2.5)；所述氨水濃度為25％-28％(質量比)，水和氨水的添加比例為(10-25)：1(體積比)；

其中步驟(2)中所述的第一有機溶劑為甲醇、乙醇或甲苯中的一種；所述Fe3O4磁性納米粒子在第一有機溶劑中的濃度為10-30mg/mL；所述MAA和第一有機溶劑的體積之比為(2-5)：10；

其中步驟(3)中所述的第二有機溶劑為乙腈、乙醇或甲苯中的一種；所述的含卟啉環類化合物模板分子為葉綠素、血晶素或四苯基卟啉；所述的功能單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯醯胺、對乙烯基苯甲酸、2-(三氟甲基)丙烯酸中的一種或多種；所述的交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯或甲基丙烯酸縮水甘油酯；所述的引發劑為偶氮二異丁腈；所述MAA修飾的Fe3O4磁性納米粒子在第二有機溶劑中的濃度為5-7mg/mL；所述卟啉環類化合物在第二有機溶劑中的濃度為3-10μmol/mL，所述功能單體在第二有機溶劑中的濃度為12-40μmol/mL，所述交聯劑在第二有機溶劑中的濃度為60-200μmol/mL，所述引發劑在第二有機溶劑中的濃度為3-10μmol/mL；所述的第三有機溶劑為乙腈、甲醇或甲醇乙酸混合液中的一種；

另外優選的方案中，在步驟(1)中所述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的混合水溶液在加入水和氨水的混合液中時，是邊攪拌邊逐滴加入的，其中攪拌的速率為400-800rpm/min；這樣可以得到分散性良好、粒徑均勻適中的磁性納米粒子Fe3O4；

步驟(2)中，為了得到均勻分散並均勻地將磁性納米粒子Fe3O4表面修飾MAA，攪拌第一有機溶劑、磁性納米粒子Fe3O4和MAA混合物時要均勻，攪拌的速率為500-1000rpm/min。

本發明還提供了一種由上述方法製備得到的識別葉綠素的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP。

本發明的識別葉綠素的磁性分子印跡材料用於農產品農藥殘留檢測時的用途，其用於吸附葉綠素，去除幹擾。

本發明所提供的分子印跡材料為磁性納米仿生識別材料，有特異性強的識別位點和較好的吸附性能，吸附速率快、吸附容量大、穩定性能較好，可實現對高色素農產品樣品中葉綠素幹擾物的高效選擇性識別和吸附，而對目標平面結構農藥無吸附，一舉解決了目前主流的葉綠素吸附劑GCB對二者無選擇性吸附的難題。

針對高葉綠素含量的農產品樣品，將本發明所提供的識別葉綠素的磁性分子印跡材料和QuEChERS方法相結合，可以建立一種高回收率、降低基質效應、快速、可靠的前處理方法，實現了農藥多殘留檢測，極具實際應用價值。

通過紅外光譜儀對所製備的磁性分子印跡納米材料Fe3O4@MIP等進行表徵，通過透射電鏡(TEM)觀察納米顆粒表面形貌。通過靜態和動態吸附性實驗，以紫外-可見光譜儀測定並比較優化的磁性分子印跡納米材料Fe3O4@MIP和非分子印跡材料Fe3O4@NIP對葉綠素的吸附容量和速率。並以QuEChERS前處理方法結合色譜質譜聯用儀(GC-MS/MS和UPLC-MS/MS)分析比較使用磁性分子印跡納米材料Fe3O4@MIP和石墨化炭黑(GCB)在吸附高色素農產品樣品如韭菜、菠菜、茶葉中的葉綠素幹擾物的效果，以及同等效果條件下評價所分析的68種目標平面結構農藥的添加回收率和重複性試驗的相對標準偏差。

本發明的識別葉綠素的磁性分子印跡材料改變了以往的一種分子印跡材料只能檢測一種農藥分子或相近結構農藥的局限，將目的由目標農藥分子捕捉變為幹擾物去除，拓寬了分子印跡技術的運用思路。開發了一種可選擇性吸附葉綠素，吸附容量大，而對平面結構農藥無吸附的新型分子印跡材料Fe3O4@MIP，彌補了石墨化炭黑(GCB)的不足。針對高葉綠素含量農產品樣品，將分子印跡技術和QuEChERS方法相結合，建立一種高回收率、降低基質效應、快速、可靠的前處理方法，實現了農藥多殘留檢測，極具實際應用價值。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)本發明以磁性四氧化三鐵為載體製備磁性分子印跡材料，既保證了材料良好的磁學性質、分散性和穩定性，還便於根據實驗目的對載體進行化學修飾。

(2)本發明在磁性四氧化三鐵載體表面修飾MAA，採用表面分子印跡技術將聚合物接枝到載體表面，得到了表面覆蓋有納米級別尺寸的識別葉綠素分子的印跡薄層磁性功能化納米材料。反應條件簡便，材料形貌可控，選擇性吸附性能、分散性和穩定性良好。

(3)本發明通過嘗試幾種含卟啉環類結構化合物模板分子，優化篩選功能單體、交聯劑和引發劑種類，成功製備了能夠識別葉綠素的磁性分子印跡納米材料Fe3O4@MIP，可應用於高色素農產品樣品中農藥多殘留檢測的去除幹擾物的前處理。

(4)本發明所提供的磁性分子印跡材料具有選擇性識別葉綠素的吸附性能，而對目標平面結構農藥無吸附。將該材料和QuEChERS方法相結合，建立了一種針對高葉綠素含量的農產品樣品中農藥多殘留檢測的高回收率、基質效應低、快速、可靠的前處理方法。彌補了目前農產品的農藥殘留前處理中重要幹擾物葉綠素的特異性高效吸附的技術空白。

附圖說明

圖1包含圖1(a)和圖1(b)，是實施例1製備的磁性納米粒子Fe3O4的透射電鏡圖(圖1(a))和磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的透射電鏡圖(圖1(b))。

圖2是實施例1製備的磁性納米粒子Fe3O4，甲基丙烯酸(MAA)接枝改性磁性納米粒子Fe3O4和磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的紅外譜圖。

圖3是實施例1製備的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP和非分子印跡材料Fe3O4@NIP對葉綠素的吸附等溫曲線。

圖4是實施例1製備的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP和非分子印跡材料Fe3O4@NIP對葉綠素的動態吸附曲線。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

實施例1

磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的製備。

具體包括如下步驟：

S11：磁性四氧化三鐵(Fe3O4)納米粒子的合成

稱取6.763g六水合物氯化鐵和1.99g四水合物氯化亞鐵，然後分別溶於25mL和5mL超純水後，兩者混合併通入N2保護。取237mL超純水和15mL氨水倒入500mL三口燒瓶中，置於35℃水浴鍋中，在機械攪拌器作用下充分攪拌，並通入N2，除去溶液中的O2，然後將含有Fe3+和Fe2+的混合溶液逐滴加入，反應在35℃，N2保護和充分機械攪拌下進行1h，反應完成後將得到的黑色物質用超強磁鐵分離，用超純水洗滌，再用永久磁鐵分離，重複用超純水洗滌分離5次，置於60℃真空乾燥，得到磁性Fe3O4納米粒子。

S12：甲基丙烯酸(MAA)接枝改性磁性Fe3O4納米粒子的製備

稱取0.2g Fe3O4並加入10mL甲苯，超聲分散30min後，加入2mL甲基丙烯酸(MAA)，充分機械攪拌24h。反應完成後，將得到的修飾好的Fe3O4用超強磁鐵分離，用水和乙醇洗滌，再用永久磁鐵分離，重複用水和乙醇洗滌分離3次，置於60℃真空乾燥，得到甲基丙烯酸表面修飾的磁性Fe3O4納米粒子(Fe3O4-MAA)。

S13:識別葉綠素的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的製備

稱取0.2g Fe3O4-MAA溶於5mL乙腈中，超聲30min，再稱取0.0892g模板分子葉綠素和0.0334g MAA溶於25mL乙腈中，超聲30min後，然後兩者混合後倒入單口燒瓶中超聲30min。向混合液中加入360μL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和40mg偶氮二異丁腈(AIBN)，通N2 5min後，用實心橡膠塞密封單口燒瓶，然後將單口燒瓶放入水浴搖床中，60℃，搖24h。反應完成後，將得到印跡聚合物用超強磁鐵分離，用超純水洗滌兩次，超強磁鐵分離，然後用甲醇/乙酸(v/v,9:1)洗滌四次，超強磁鐵分離，60℃真空乾燥，得到Fe3O4@MIP。

實施例2

磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的製備。

具體包括如下步驟：

S21：磁性四氧化三鐵(Fe3O4)納米粒子的合成

稱取3.38g六水合物氯化鐵和0.995g四水合物氯化亞鐵，然後分別溶於15mL和3mL超純水後，兩者混合併通入N2保護。取118mL超純水和8mL氨水倒入500mL三口燒瓶中，置於35℃水浴鍋中，在機械攪拌器作用下充分攪拌，並通入N2，除去溶液中的O2，然後將含有Fe3+和Fe2+的混合溶液逐滴加入，反應在35℃，N2保護和充分機械攪拌下進行1h，反應完成後將得到的黑色物質用超強磁鐵分離，用超純水洗滌，再用永久磁鐵分離，重複用超純水洗滌分離5次，置於60℃真空乾燥，得到磁性Fe3O4納米粒子。

S22：甲基丙烯酸(MAA)接枝改性磁性Fe3O4納米粒子的製備

稱取0.4g Fe3O4並加入20mL甲苯，超聲分散30min後，加入4mL甲基丙烯酸(MAA)，充分機械攪拌24h。反應完成後，將得到的修飾好的Fe3O4用超強磁鐵分離，用水和乙醇洗滌，再用永久磁鐵分離，重複用水和乙醇洗滌分離3次，置於60℃真空乾燥，得到甲基丙烯酸表面修飾的磁性Fe3O4納米粒子(Fe3O4-MAA)。

S23:識別葉綠素的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的製備

稱取0.4g Fe3O4-MAA溶於10mL乙腈中，超聲30min，再稱取0.1372g模板分子血晶素和0.0668g MAA溶於50mL乙腈中，超聲30min後，然後兩者混合後倒入單口燒瓶中超聲30min。向混合液中加入760μL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和80mg偶氮二異丁腈(AIBN)，通N2 5min後，用實心橡膠塞密封單口燒瓶，然後將單口燒瓶放入水浴搖床中，60℃，搖24h。反應完成後，將得到印跡聚合物用超強磁鐵分離，用超純水洗滌兩次，超強磁鐵分離，然後用甲醇/乙酸(v/v,9:1)洗滌四次，超強磁鐵分離，60℃真空乾燥，得到Fe3O4@MIP。

實施例3

磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的製備。

具體包括如下步驟：

S31：磁性四氧化三鐵(Fe3O4)納米粒子的合成

稱取5.07g六水合物氯化鐵和1.49g四水合物氯化亞鐵，然後分別溶於18mL和4mL超純水後，兩者混合併通入N2保護。取178mL超純水和11mL氨水倒入500mL三口燒瓶中，置於35℃水浴鍋中，在機械攪拌器作用下充分攪拌，並通入N2，除去溶液中的O2，然後將上述含有Fe3+和Fe2+的混合溶液逐滴加入，反應在35℃，N2保護和充分機械攪拌下進行1h，反應完成後將得到的黑色物質用超強磁鐵分離，用超純水洗滌，再用永久磁鐵分離，重複用超純水洗滌分離5次，置於60℃真空乾燥，得到磁性Fe3O4納米粒子。

S32：甲基丙烯酸(MAA)接枝改性磁性Fe3O4納米粒子的製備

稱取0.8g Fe3O4並加入40mL甲苯，超聲分散30min後，加入8mL甲基丙烯酸(MAA)，充分機械攪拌24h。反應完成後，將得到的修飾好的Fe3O4用超強磁鐵分離，用水和乙醇洗滌，再用永久磁鐵分離，重複用水和乙醇洗滌分離3次，置於60℃真空乾燥，得到甲基丙烯酸表面修飾的磁性Fe3O4納米粒子(Fe3O4-MAA)。

S33:識別葉綠素的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP的製備

稱取0.1g Fe3O4-MAA溶於5mL乙腈中，超聲30min，再稱取0.0317g模板分子四苯基卟啉，0.0167g MAA溶於15mL乙腈中，超聲30min後，然後兩者混合後倒入單口燒瓶中超聲30min。向混合液中加入180μL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和20mg偶氮二異丁腈(AIBN)，通N2 5min後，用實心橡膠塞密封單口燒瓶，然後將單口燒瓶放入水浴搖床中，60℃，搖24h。反應完成後，將得到印跡聚合物用超強磁鐵分離，用超純水洗滌兩次，超強磁鐵分離，然後用甲醇/乙酸(v/v,9:1)洗滌四次，超強磁鐵分離，60℃真空乾燥，得到Fe3O4@MIP。

對比例

對比例提供磁性非分子印跡材料Fe3O4@NIP的製備方法，參照實施例1，對比例中具體的製備過程除在步驟S13中不添加模板分子外，其餘步驟均與實施例1相同。

實施例4

為了驗證本發明的有益效果，採用本發明實施例1所製備的分子印跡材料進行性能測試，步驟如下：

(1)分別稱取13份5mg實施例1製備的Fe3O4@MIP和對比例製備的Fe3O4@NIP分別加入到15mL的離心管中，再分別加入10mL初始濃度為0.03-0.72mg/mL的葉綠素乙醇溶液，在恆溫水浴搖床中30℃振蕩30min，通過超強磁鐵分離上層液後，用紫外-可見光譜儀測定並計算各上層液中葉綠素濃度，波長掃描範圍為400-750nm，葉綠素最大吸收波長在670nm。檢測結果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著葉綠素溶液濃度的增加，磁性分子印跡材料和非分子印跡材料對葉綠素的吸附能力都趨於增加，但磁性分子印跡材料對葉綠素的吸附能力顯著高於非分子印跡材料，這說明所製備的磁性分子印跡材料Fe3O4@MIP對葉綠素的吸附是特異性的。經計算，Fe3O4@MIP和Fe3O4@NIP對葉綠素的飽和吸附容量分別為135.4mg/g、478.9mg/g。

(2)將20mg實施例1製備的Fe3O4@MIP和對比例製備的Fe3O4@NIP分別加入到40mL葉綠素濃度為0.36mg/mL的乙腈溶液中，在恆溫水浴搖床中30℃振蕩2h，期間定時通過超強磁鐵分離，取同等體積的上層液出來，用紫外-可見光譜儀測定並計算各上層液中葉綠素濃度。檢測結果如圖4所示，可以看出，製備的磁性納米材料50min內對葉綠素的吸附即可達到平衡。

(3)以QuEChERS前處理方法結合色譜質譜聯用儀(GC-MS/MS和UPLC-MS/MS)分析比較使用磁性分子印跡納米材料Fe3O4@MIP和石墨化炭黑(GCB)在吸附高色素農產品樣品即韭菜、菠菜、茶葉中的葉綠素幹擾物的效果，以及同等效果條件下評價所分析的68種目標平面結構農藥的添加回收率和重複性試驗的相對標準偏差。

稱取10g勻漿粉碎後的樣品(韭菜、菠菜)或2g粉碎後的茶葉(綠茶)，加10mL水渦旋混勻水化，置於50mL離心管中，加入10mL預冷乙腈。加入2顆陶瓷均質子，手搖快速震蕩約30s；然後加入提取鹽包(含無水硫酸鎂4g、氯化鈉1g、檸檬酸鈉1g及檸檬酸氫二鈉0.5g)，手搖快速震蕩混勻約1min，防止鹽類結塊。於25℃，5000rpm/min離心10min。分別取1mL提取液分別放入含不同量的Fe3O4@MIP和GCB的2mL離心管內(按照各自的飽和吸附量通過預實驗確定加入量，使得提取液中葉綠素被吸附的水平一致)，充分渦旋震蕩使充分吸附去除葉綠素雜質。含GCB吸附劑的樣品於25℃，6000rpm/min離心10min，含Fe3O4@MIP吸附材料的樣品在超強磁鐵作用下分離得到上清液。過0.2μm的微孔濾膜，分別用GC-MS/MS和UPLC-MS/MS進樣分析。

針對68種目標平面結構農藥，3種基質樣品每種測試了3組添加濃度水平，每組濃度6個平行樣品(即n＝6)，計算平均添加回收率(AVE，％)和相對標準偏差(RSD，％)，結果如表1-表3所示。

表1 Fe3O4@MIP和GCB作為淨化葉綠素的吸附劑對68種平面結構農藥添加回收率和相對標準偏差的結果比較(韭菜)

表2 Fe3O4@MIP和GCB作為淨化葉綠素的吸附劑對68種平面結構農藥添加回收率和相對標準偏差的結果比較(菠菜)

表3 Fe3O4@MIP和GCB作為淨化葉綠素的吸附劑對68種平面結構農藥添加回收率和相對標準偏差的結果比較(茶葉)

由結果可知，在3種高色素農產品的多殘留分析檢測中，用Fe3O4@MIP作為吸附劑去除葉綠素的同時，對選取的68種目標平面結構農藥均無明顯吸附，使得幾乎所有目標平面結構農藥在3種濃度測試水平的添加回收率都在70％～120％之間，RSD≤30％，符合國家標準對於農藥多殘留分析的檢測要求。而相應地用GCB作為吸附劑，絕大多數平面結構農藥在3種高色素農產品基質的3種濃度添加水平測試下，其平均回收率在70％以下，多數在40％～60％之間，甚至有一部分農藥的添加回收率在20％～30％，有相當一部分的RSD波動範圍也超過30％。因此可以得出結論，Fe3O4@MIP對葉綠素的吸附存在選擇性，它通過分子印跡材料的識別位點對葉綠素進行特異性吸附，而不影響平面結構農藥。GCB對目標平面結構農藥存在不同程度的吸附，從而影響農藥的添加回收率和相對標準偏差，使得農藥殘留測定的定量結果不準確，而Fe3O4@MIP對葉綠素的選擇性吸附，其效果大大優於GCB通過物理方式對含有平面結構的物質均吸附的特性。