L－絲氨酸在製備治療腦缺血的藥物中的應用的製作方法

2023-05-27 09:27:31 3

專利名稱：L－絲氨酸在製備治療腦缺血的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及L-絲氨酸的新醫藥用途。
背景技術：
腦血管病是由各種血管源性腦病變引起的腦功能障礙，腦卒中(又稱中風)是急性腦循環障礙迅速導致局限性或瀰漫性腦功能缺損的臨床事件。腦卒中包括缺血性和出血性卒中，前者佔70％。其主要特徵是病變血管支配區局灶性神經功能缺損，如意識障礙、偏癱、偏盲、偏身感覺障礙及失語等。據資料統計，我國腦卒中發病率為120～180/10萬人，每年新發卒中大於150萬人，腦卒中死亡率世界第二位(死亡率80～120/10萬人)，由此，每年因腦卒中死亡人數約120萬。如此高的腦卒中發病率、死亡率及其相當驚人的醫療費，給社會和家庭造成了沉重的負擔。針對缺血性腦卒中，目前除溶栓治療有肯定的療效外，神經保護藥物一直未能顯示確定的臨床效果。因此，缺血性卒中防治方面的研究極需創新性研究思路與研究方法。
研究表明，腦缺血後，在缺血缺氧性腦損傷發生發展的級聯反應過程中，神經元和膠質細胞大量釋放穀氨酸等興奮性胺基酸，而重攝取減少，細胞外間隙穀氨酸堆積，興奮性胺基酸/抑制性胺基酸比例大大增加，激活興奮性胺基酸受體，引起興奮性神經毒性被認為是極其關鍵的機制，並且與其它機制如胞內鈣超載、自由基及一氧化氮生成增加等相關聯，最後引起急性或遲發性神經元死亡，損傷腦組織。腦缺血後治療的成功與否，取決於能否及時建立再灌注和有效地保護神經元免受缺血缺氧損傷，神經保護劑和溶栓治療的聯合應用，被認為是一條較為合理的解決方法。神經保護劑能提高神經細胞對缺血缺氧的耐受性，延長溶栓治療時間窗，為有效建立再灌注爭取時間，還能阻止或減輕溶栓治療帶來的再灌注損傷。即使對於喪失溶栓治療時機的病人，使用神經保護劑，還可保護缺血半影區內的神經元，抑制遲發性神經元死亡。拮抗或抑制穀氨酸的興奮性神經毒性以保護腦組織成為這方面治療的一個重要切入點。然而，目前興奮性胺基酸受體阻斷劑或釋放抑制劑對缺血腦損傷的治療效果並不理想，一是治療時間窗窄，二是潛在的神經精神方面的副作用較大。我們從全新的角度入手，激動腦內抑制性胺基酸-甘氨酸受體，降低神經元的興奮性，抑制穀氨酸對神經元的興奮性毒性，從而起到保護大腦、抗缺血缺氧性腦損傷的作用，以治療缺血性中風等引起缺血缺氧性腦損傷的一些疾病。有研究報導激動γ-氨基丁酸(GABA)受體，在整體動物模型上能抑制興奮性神經毒性，並對缺血大腦有很好的保護作用。
中樞神經系統內存在γ-氨基丁酸能和甘氨酸(Gly)兩類抑制性神經遞質系統。通常認為GABA遞質系統在腦內發揮主要作用，而Gly能遞質系統主要在脊髓內發揮作用(徐天樂。中樞甘氨酸受體分子特性的研究。生理科學進展，2000，31(4)373-380)。然而，近年來的研究表明，腦內不僅存在一些Gly能神經元，Gly受體的分布更是非常廣泛。現有的研究資料顯示從腦幹到大腦皮質多處(如中腦腹側被蓋區、下丘腦、海馬、紋狀體、伏核、杏仁核、大腦皮質)有功能性Gly受體的分布。因此，Gly能抑制性神經遞質系統、Gly受體及配體在腦內的作用越來越受到人們的關注。研究表明，在腦內成熟的神經元，使用Gly可引起神經元膜的超極化。這樣即會降低神經元的興奮性，並且阻止NMDA受體通道中Mg2+的移出，抑制其通道的開放，抑制穀氨酸對神經元的興奮作用。腦缺血時使用，可望抑制穀氨酸等興奮性胺基酸對神經元的興奮性毒性，起到腦神經保護作用。
根據這一設想，我們研究比較了甘氨酸(Glycine)、牛磺酸(Taurine)、β-丙氨酸(β-alanine)、L-絲氨酸(L-serine)、L-α-丙氨酸(L-α-alanine)等五種甘氨酸受體激動劑對大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用。在五種甘氨酸受體激動劑中，L-serine的抗缺血腦損傷效果最佳；其對實驗性腦缺血再灌注損傷的保護作用具有劑量依賴性；L-serine的作用可能與激活腦內的甘氨酸受體，抑制缺血損傷後神經元的興奮性毒性，阻止神經元的凋亡及壞死有關。
在急性缺血性腦卒中的治療中，採用藥物或幹預措施幹擾缺血瀑布反應的各個環節、延長神經元存活稱為神經保護。急性缺血導致細胞能量代謝障礙，並導致一系列缺血瀑布反應，包括神經細胞膜去極化，興奮性胺基酸釋放增加，鈣離子通過NMDA/AMPA受體、代謝性穀氨酸受體和電壓依賴性鈣通道等大量進入細胞內，激活蛋白酶、脂酶、各種激酶、核酸酶和一氧化氮(NO)合酶，自由基生成增加，破壞細胞的正常結構和功能。同時，再灌注伴隨的炎症反應、白細胞的粘附和浸入、細胞因子作用等將進一步加劇缺血後的腦組織損害。上述過程不僅引起神經元的急性變性壞死，還啟動細胞凋亡過程，引起遲發性神經元死亡。正因為其病理生理機制極為複雜，因此治療難度極大。迄今報導已有50多種神經保護藥物在缺血性卒中患者中進行了臨床試驗，但卻沒有一種藥物取得令人滿意的療效。神經保護劑臨床試驗失敗的原因眾多，目前認為主要原因有不良反應重；研究類型、樣本大小和觀察指標不恰當；治療劑量和療程不合適；藥代動力學和藥效動力學不佳；治療時間窗狹窄等。
與大量的外源性藥物相比，近年來一些內源性化合物如白蛋白、胞二磷膽鹼，促紅細胞生成素等在預試驗中取得了一定的效果，引起研究者廣泛關注和深層次的思考。一方面這些內源性物質，機體在正常情況下就可產生，外源性使用一般不至於產生嚴重的不良反應；另一方面，在急性缺血損傷的情況下，這些物質會反應性釋放增加，這可能是機體缺血應激狀態下被迫進行的一種自我保護機制。
L-絲氨酸雖屬於非必需胺基酸，但具有許多重要的生理功能和作用，因此，在醫藥、食品、化妝品中均有較為廣泛的應用。但迄今為止沒有在針對腦缺血方面應用的報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種L-絲氨酸的新醫藥用途，是L-絲氨酸在製備治療腦缺血的藥物中的應用L-絲氨酸的製劑類型包括特別注射劑或輸液製劑、包括緩釋或控釋藥物製劑，包括腸腔給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物製劑。
我們進行了後述有關L-絲氨酸抗腦缺血/再灌注損傷和神經組織損傷的實驗研究，證實了L-絲氨酸具有明確的抗腦缺血損傷和神經組織損傷的作用，為其作為一種新型抗中樞神經系統損傷藥物及其臨床應用提供了較完整的實驗依據。
對於L-絲氨酸抗腦缺血作用，通過大鼠局灶性腦缺血模型，得到以下結論I.五種甘氨酸受體激動劑中，除牛磺酸外，L-絲氨酸可明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的神經行為障礙，減少腦梗死體積。
II.MRI動態觀察L-絲氨酸對缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響，表明L-絲氨酸可持續發揮腦缺血保護作用。
III.L-絲氨酸降低缺血引起的腦組織水腫和血腦屏障(BBB)的破壞L-絲氨酸可明顯降低缺血半球的腦水含量，同時L-絲氨酸可明顯降低皮質、皮質下結構和半球的BBB的破壞。
IV.L-絲氨酸的作用隨劑量增加而增強，168mg.kg-1.12h-1時效果接近飽和。
V.L-絲氨酸可減少腦缺血再灌注後海馬CA1區錐體細胞的變性壞死與丟失；免疫組化、Western-blot提示L-絲氨酸可抑制腦缺血損傷後凋亡相關基因(Caspase-3)的表達。
本發明的優點通過實驗證明，L-絲氨酸抗缺血腦損傷效果最佳；其對實驗性腦缺血再灌注損傷的保護作用具有劑量依賴性；L-絲氨酸的作用可能與激活腦內的甘氨酸受體，抑制缺血損傷後神經元的興奮性毒性，阻止神經元的凋亡及壞死有關。至此L-絲氨酸適用於製成藥物製劑，可製成緩釋或控釋藥物製劑；可製成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物製劑；可製成注射製劑或輸液製劑；也可與其它藥物組成複方藥物製劑。以上藥物製劑有明確的神經保護作用，可用於製成治療各種神經退化或損傷性疾病的藥物製劑，例如用於中風性腦損傷、老年痴呆和多種硬化症等的治療。
根據這一設想，我們研究比較了甘氨酸(Glycine)、牛磺酸(Taurine)、β-丙氨酸(β-alanine)、L-絲氨酸(L-serine)、L-α-丙氨酸(L-α-alanine)等五種甘氨酸受體激動劑對大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用。在五種甘氨酸受體激動劑中，L-serine的抗缺血腦損傷效果最佳；其對實驗性腦缺血再灌注損傷的保護作用具有劑量依賴性；L-serine的作用可能與激活腦內的甘氨酸受體，抑制缺血損傷後神經元的興奮性毒性，阻止神經元的凋亡及壞死有關。
研究證明，激動甘氨酸受體的五種抑制性胺基酸具有不同程度的抗缺血腦損傷作用，其中以L-serine的作用最佳。局灶性腦缺血再灌注後，使用L-serine治療，可以明顯縮小大鼠的腦梗死體積，改善神經行為學症狀，抑制腦水腫的形成，阻止缺血損傷後神經元的變性、壞死及神經元凋亡。L-serine的這種神經保護作用可被甘氨酸受體阻斷劑士的寧所抑制，說明L-serine的作用確實是通過激動腦內甘氨酸受體而實現的。
L-serine抗腦缺血再灌注損傷的可能機制是提高腦內抑制性胺基酸濃度，逆轉腦缺血時興奮性胺基酸/抑制性胺基酸比例失調，激動甘氨酸受體，降低神經元的興奮性，抑制穀氨酸對神經元的興奮性毒性，減少缺血半暗區Caspase-3的表達，減少神經元的急性壞死和遲發性死亡，從而減輕缺血再灌注帶來的損傷，保護腦組織。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
圖1是驗正本發明的實驗中缺血2h再灌注24h各組大鼠腦片TTC染色例圖。
注梗死區壞死組織呈蒼白色，而正常腦組織呈紅色，梗死區域與大腦中動脈支配的腦區基本一致，主要位於皮質及紋狀體區。L-絲氨酸組、牛磺酸組各層面腦片較其它處理組相比，梗死區域顯得較小。a假手術組；b牛磺酸組；cL-絲氨酸組；d甘氨酸組；eL-α-丙氨酸組；fβ-丙氨酸組；g腦缺血對照組。
圖2是缺血腦梗死典型MRI改變示圖注在MCAO(大腦中動脈栓塞)後2小時，DWI(Diffusionweightedimaging，彌散加權像)上就可以反映出缺血部位高密度信號，此時L-絲氨酸組(L-ser)與對照組(Vehicle)的腦梗死體積並沒有明顯差別；但在MCAO後5小時，可觀測到L-絲氨酸組腦梗死體積較對照組相比明顯減少。在MCAO後2小時，T2WI(T2Weighted imaging，T2加權像)上並沒有明顯的信號改變；5小時，可見缺血部位的高密度信號，此時L-絲氨酸組腦梗死體積明顯較對照組縮小；在MCAO後24、48小時，對照組腦梗死體積持續增加，而L-絲氨酸組可持續發揮腦缺血保護作用，腦梗死體積維持不變。
圖3是缺血2h再灌注24h各組大鼠尼氏染色圖注A對照組雙側海馬，圖片右側為缺血區；BL-絲氨酸組雙側區海馬，圖片右側為缺血區，；C假手術組(sham-operated)雙側區海馬；D對照組缺血側海馬CA1區；EL-絲氨酸組缺血側海馬CA1區；F假手術組缺血側海馬CA1區；G對照組缺血側皮質；HL-絲氨酸組組缺血側皮質；I假手術組缺血側皮質。除假手術組外，尼氏染色顯示對照組、L-絲氨酸組大鼠缺血側大腦半球不同程度的著色變淡，紋狀體、海馬及大腦皮層部神經元縮小變形，可見核溶解、核碎裂、核固縮，缺血周邊區受損神經元呈現細胞腫脹，尼氏體消失等神經元變性的特徵(圖3)。對照組缺血側海馬組織有明顯損傷，主要表現在CA1、CA2區大量錐體細胞缺失，殘留的錐體細胞排列鬆散不規則，多數細胞胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失(圖3A、D)；缺血側皮質部著色明顯變淡，神經元縮小變形，可見核溶解、核碎裂、核固縮，尼氏體消失等神經元變性的特徵(圖3G)。L-絲氨酸組缺血側海馬錐體細胞排列比較整齊緻密，胞核飽滿，核仁較清晰，僅有少量散在的CA1區錐體細胞缺失或胞核固縮(圖3B、E)；缺血側皮質部神經元形態基本完整，胞核較飽滿，核仁清晰，尼氏小體豐富(圖3H)。假手術組海馬組織無明顯損傷，CA1區錐體細胞核大而圓，核仁明顯，可見淺染的突起，錐體細胞2-3層，排列整齊緻密，形態完整，尼氏小體豐富(圖3C、F)；皮質部神經元形態無明顯異常，排列較緊密，胞核飽滿，核仁清晰(圖3I)。
圖4是大鼠Caspase-3免疫組化圖注A頂葉皮層缺血半暗帶區，方框區域為選擇計數Caspase-3陽性細胞區域；BL-絲氨酸組，有少量的Caspase-3陽性細胞位於正常神經元之間；C對照組，可見大量的Caspase-3陽性細胞，有少量的正常神經元；D假手術組，多見正常神經元，偶見Caspase-3陽性細胞。黑色箭頭所指為正常神經元，紅色箭頭所指為Caspase-3陽性細胞。
圖5是大鼠Caspase-3 Western-bolt分析圖注β-actin作為內參，在各組中有較均一的表達。各實驗處理組Caspase-3條帶深淺不一，對照組中Caspase-3的表達明顯；L-絲氨酸組中則表達明顯下調；假手術組(sham)中，Caspase-3基本未見表達。
具體實施例方式一種L-絲氨酸在製備治療腦缺血的藥物中的應用。
具體驗正實驗一、實驗材料和方法1材料1.1實驗動物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，體重240-260g，南通大學實驗動物中心提供。
1.2主要試劑與溶液牛磺酸(Taurine)粉劑購自Sigma-Aldrich；甘氨酸國藥集團化學試劑有限公司；L-絲氨酸中國醫藥(集團)上海化學試劑公司；β-丙氨酸Sigma公司(美國)；L-α-丙氨酸中國醫藥(集團)上海化學試劑公司；紅四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC)粉劑購自上海靈錦精細化工有限公司；抗β-actin單克隆抗體購自Sigma公司；Cleaved Caspase-3(Asp175)兔抗鼠單克隆抗體購自CellSignaling公司；二抗為北京中杉金橋生物技術有限公司SP免疫組化染色試劑盒。
2方法2.1模型製備參照Longa EZ方法並稍作改良的大腦中動脈線栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)製備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。尼龍線插入深度平均為18.5±0.5mm(從ECA分叉處算起)。結紮固定尼龍線，縫合皮膚，栓線外留1cm線頭。2h後再灌注，勿需再次麻醉和切開頸部，提拉栓線至有阻力時表明尼龍線頭端已達到ICA分叉切口處，血流再通。假手術組栓線只插入10cm，其餘步驟同模型組。動物甦醒後出現血管栓塞的同側Hornor徵和對側肢體運動障礙即為模型成功。
2.2神經行為學評分參考Zea Longa 6分制評分。評分標淮0分無神經損傷症狀；1分不能完全伸展對側前爪；2分向外側轉圈；3分向對側傾倒；4分不能自發行走，意識喪失；5分死亡。
2.3腦梗死灶測量大鼠迅速取腦，去除嗅腦、小腦和低位腦幹，冰凍10min，從額極到枕極作2mm厚度的連續額狀切片，切片置0.5％TTC溶液中，於37℃避光孵育30分鐘，間隔5分鐘搖動切片。再將切片置於4％多聚甲醛緩衝液中固定。24h後拍照並輸入計算機，用Image JScion Image圖像處理軟體計算梗死面積(粉紅色區為正常腦組織，白色區為梗死區)，梗死面積＝非缺血側半球面積-缺血側半球未梗死區面積，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2mm)為總的梗死體積，腦梗死灶體積與全腦體積比為腦梗死體積百分比。
2.4腦含水量測定缺血2h再灌注24h後，將大鼠迅速斷頭取腦，用乾濕法測腦組織含水率，在冰塊上迅速取腦，將取出的腦組織放在一個內有生理鹽水溼潤的定性濾紙的培養皿中，以防水分蒸發，同時快速去掉腦皮質表面的軟腦膜和凝血塊。用分析天秤準確稱取兩個半球的重量，然後置於100℃烤箱24小時後，再次稱重，以〔(溼重-乾重)/溼重〕×100％即為相對含水量。
2.5血腦屏障通透率缺血2h再灌注22h，經大鼠尾靜脈注射2％伊文氏藍(evans blue，EB)生理鹽水液(3ml/Kg)，循環2h後，將大鼠過度麻醉後，經心臟快速灌注生理鹽水直至右心房流出的液體無色為止，迅速斷頭取腦。從額極到枕極作2mm厚度的連續橫斷面切片，並將腦組織分為損傷側皮質、皮質下和健側皮質、皮質下4部分，在分析天平上稱重後置入50％三氯乙酸溶液中。勻漿和離心(10000r/min，20min)，取上清液按1∶2的比例用乙醇稀釋後，採用島津UV-2450型紫外分光光度儀在λ＝620nm處比色，根據標準曲線得出腦組織中EB的含量，以每克溼重腦組織內所含EB的量(μg)表示。
2.6 MRI檢查採用美國GE Healthcare 3.0T核磁共振機和肩關節正交線圈行MRI檢查。大鼠麻醉後，俯臥位，頭置於線圈中央，自主呼吸。除假手術組外，各組隨機抽取4隻大鼠連續測定缺血再灌注後2h、5h(DWI，T2WI)；24h、48h(T2WI)的缺血梗死灶的動態變化。T2WI和DWI上的梗死體積測定方法參照採用Heiland等描述，使用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟體，梗死體積＝梗死面積×(層厚+間距)。
2.7數據處理及統計分析所有數據用均數±標準誤表示(x±SE)，採用Stata 8.0統計軟體處理數據。兩組間比較採用t檢驗，組間差異採用成組設計的方差分析，兩兩比較用Scheffé法。
二、結果1五種甘氨酸受體激動劑抗局灶性腦缺血再灌注損傷的療效評價(藥物篩選)1.1神經行為學評分假手術組(Sham)動物無神經功能缺損，其它各組均有不同程度的神經功能缺損分值。缺血2h再灌注24h後，Taurine(牛磺酸)組(Tau)、L-serine組(L-ser)與對照組(Veh)神經行為學評分具有顯著性差異(p＜0.01)；Glycine組(Gly)與對照組差異亦有統計學意義(p＜0.05)；而L-α-alanine組(L-α-Ala)、β-alanine組(β-Ala)與對照組間無顯著性差異(p＞0.05)。說明Taurine、L-serine和Glycine能明顯改善大鼠的神經功能，似以L-serine的作用最佳。而L-α-alanine、β-alanine不能改善大鼠神經功能(參見表1)。
表1五種甘氨酸受體激動劑對神經功能學評分的影響。

注與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
1.2腦梗死體積的測定缺血2h再灌注24h後，行TTC染色，梗死區內壞死組織呈蒼白色，未壞死組織呈紅色。觀測發現梗死區域與MCA支配的腦區基本一致，與對照組相比，各藥物組腦梗死體積及梗死百分體積均有所縮小，以L-serine作用最顯著，其次為Taurine(p＜0.05)；其它治療組與對照組的差別無顯著性意義(p＞0.05，表2、圖1)。
表2 五種甘氨酸受體激動劑對腦梗死體積的影響

注與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2對L-serine藥效與藥理作用的深入研究2.1對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水量的影響表3顯示，與對照組相比，L-serine治療組腦含水量明顯降低，差別具有統計學意義(p＜0.05)，表明L-serine能抑制腦缺血再灌注損傷後腦水腫的形成。
表3 L-serine對大鼠腦含水量的影響


注與對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.2 L-serine對血腦屏障破壞的影響結果見表4。從結果看，缺血後應用L-serine可降低缺血所引起的血腦屏障破壞，尤以減少皮質區血腦屏障破壞為主(L-serine組皮質區EB含量較缺血對照組相比明顯減少，差別具有統計學意義)；L-serine組皮質下區EB含量雖也所減少，但與對照組相比，尚無統計學意義。
表4 L-serine對缺血引起的血腦屏障破壞的影響

注與對照組比較，**p＜0.01；△p＞0.05。
2.3 MRI(核磁共振)動態觀察L-serine對缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響在MCAO後2小時，DWI上就可以反映出缺血部位高密度信號，此時測得L-serine組與對照組的腦梗死體積並沒有明顯差別；但在MCAO後5小時，可觀測到L-serine組腦梗死體積較對照組相比明顯減少(p＜0.05)。在MCAO後2小時，T2WI上並沒有明顯的信號改變；5小時，可見缺血部位的高密度信號，此時L-serine組腦梗死體積較之前有所減少，較對照組相比，差別有統計學意義(p＜0.05)；在MCAO後24、48小時，對照組腦梗死體積持續增加，而L-serine組可持續發揮腦缺血保護作用，與對照組相比差別均有顯著性統計學意義(p＜0.01)(圖2，表5)。
表5 L-serine對缺血後腦梗死體積的影響

注與對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.4 L-serine抗局灶性腦缺血再灌注損傷的有效劑量範圍2.4.1神經行為學評分缺血2h再灌注24h後，L-serine 56mg.kg-1.12h-1劑量組神經行為學評分較對照組有所降低，但無顯著性意義(p＞0.05)；168mg.kg-1.12h-1組、504mg.kg-1.12h-1組與對照組相比，神經行為學評分顯著降低，差別都具有統計學意義(p＜0.01)，但這兩個劑量組之間無明顯差異。說明168、504mg.kg-1.12h-1劑量的L-serine能明顯改善大鼠的神經功能，並且這種作用具有劑量依賴關係，即低於56mg將不產生明顯作用，而高於504mg則作用趨於飽和(參見表6)。
表6不同劑量L-ser對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經功能學評分影響。


注與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.4.2腦梗死體積缺血2h再灌注24h後，56mg.kg-1.12h-1劑量組TTC法測得的腦梗死體積較對照組有所降低，但差別無統計學意義(p＞0.05)，這與神經行為學評分結果一致；168mg.kg-1.12h-1組、504mg.kg-1.12h-1組與對照組相比，腦梗死體積顯著降低，差異具有統計學意義(p＜0.05)，但這兩個劑量組之間無明顯差異。說明L-serine 168、504mg.kg-1.12h-1兩個劑量能明顯減少局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦梗死體積，且效果相似；但劑量在56mg.kg-1.12h-1時，還未顯示出顯著減少腦梗死體積的能力。提示L-serine減少大鼠腦缺血後梗死體積形成的作用存在著劑量依賴關係，至504mg.kg-1.12h-1劑量時效應已達飽和程度(參見表7)。
表7不同劑量L-ser對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積百分比的影響。

注與對照組相比，*p＜0.05。
2.5組織形態學觀察(尼氏染色)2.5.1對神經元數目的影響對照組海馬CA1區錐體細胞稀疏，有片狀缺失，有的細胞旁有空染區，可見核固縮，胞質濃染，胞體變小的細胞；細胞層次不清楚，神經元密度明顯降低。L-serine組海馬組織學特徵與假手術組相似，神經元密度較對照組相比顯著增加，差別具有統計學意義(p＜0.01)，表明L-serine組可部分阻止大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷造成的神經元缺失(結果見表8，圖3)。
表8海馬CA1區錐體層細胞密度

注與其它兩組比較，**p＜0.012.5.2對神經元形態的影響大鼠右側MCAO2h、再灌注24h後，行尼氏染色。除假手術組外，尼氏染色顯示對照組、牛磺酸治療組大鼠缺血側大腦半球不同程度的著色變淡，紋狀體、海馬及大腦皮層部神經元縮小變形，可見核溶解、核碎裂、核固縮，缺血周邊區受損神經元呈現細胞腫脹，尼氏體消失等神經元變性的特徵。對照組缺血側海馬組織有明顯損傷，主要表現在CA1、CA2區大量錐體細胞缺失，殘留的錐體細胞排列鬆散不規則，多數細胞胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失；缺血側皮質部著色明顯變淡，神經元縮小變形，可見核溶解、核碎裂、核固縮，尼氏體消失等神經元變性的特徵。L-serine組缺血側海馬錐體細胞排列比較整齊緻密，胞核飽滿，核仁較清晰，僅有少量散在的CA1區錐體細胞缺失或胞核固縮；缺血側皮質部神經元形態基本完整，胞核較飽滿，核仁清晰，尼氏小體豐富。假手術組海馬組織無明顯損傷，CA1區錐體細胞核大而圓，核仁明顯，可見淺染的突起，錐體細胞2-3層，排列整齊緻密，形態完整，尼氏小體豐富；皮質部神經元形態無明顯異常，排列較緊密，胞核飽滿，核仁清晰(如圖3所示)。
2.6凋亡相關基因Caspase-3(活化型)的表達2.6.1免疫組化檢測每例動物取連續的6張切片，在10×40倍光鏡下記數頂葉皮層缺血半暗帶區Caspase-3陽性細胞數，取其平均值為每隻的陽性細胞數。對照組Caspase-3陽性細胞數較多，僅有少量的正常神經元；L-serine治療組陽性細胞數較對照組明顯減少(p＜0.01，表9，圖4)，較少量的陽性細胞位於正常神經元之間。本實驗提示L-serine可使凋亡相關基因Caspase-3表達明顯下調，說明L-serine可以部分抑制腦缺血半暗帶區神經元凋亡，減少神經元遲發性死亡，從而發揮腦缺血保護作用。
表9高倍鏡下皮層缺血半暗帶區Caspase-3陽性細胞數

注與其它兩組比較，**p＜0.012.6.2 Western-blot分析β-actin作為內參，在各組中有較均一的表達。各實驗處理組Caspase-3條帶深淺不一，對照組中Caspase-3的表達明顯；L-serine組中則表達明顯下調；假手術組中，Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸酶)基本未見表達。經凝膠圖像分析系統掃描，用四星圖像處理系統測定各組Caspase-3表達量與內參表達量(β-actin)的比值，數據以x±SE表示。L-serine組與對照組相比，差別具有顯著性統計學意義(p＜0.01，表10，圖5)。進一步說明L-serine可抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷所誘導的凋亡相關蛋白Caspase-3的表達。
表10Caspase-3表達量化圖

注與對照組比較，**p＜0.0權利要求
1.一種L-絲氨酸在製備治療腦缺血的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種L－絲氨酸在製備治療腦缺血的藥物中的應用。L－絲氨酸治療腦缺血效果佳，適用於製成藥物製劑，可製成緩釋或控釋藥物製劑；可製成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物製劑；可製成注射製劑或輸液製劑；也可與其它藥物組成複方藥物製劑。
文檔編號A61P9/10GK101049295SQ20071002205
公開日2007年10月10日 申請日期2007年4月28日 優先權日2007年4月28日
發明者姜正林, 王國華 申請人:南通大學