一種細胞接觸抑制的檢測裝置及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-27 08:37:11

專利名稱：一種細胞接觸抑制的檢測裝置及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測細胞增殖調控的裝置，具體說涉及一種細胞接觸抑制的檢測裝置及其製備方法和應用。
接觸抑制是正常細胞所具有的特性，它是指正常細胞在一定的培養環境中，貼附於培養容器表面進行貼壁生長，當細胞生長達到匯合狀態及一定的密度後，細胞出現的生長增殖停止的狀態。
惡性腫瘤細胞是一種不受正常的細胞增殖調控機制約束的無限制生長細胞。體外培養的腫瘤細胞與正常細胞生長的最重要區別性特徵之一就是腫瘤細胞生長接觸抑制的喪失。此方面的研究，對於認識正常細胞的癌變過程，即癌症的發生機理，進而深入研究探索治療癌症的方法具有十分重要的意義。
目前多數理論認為，與細胞增殖有關的癌基因、抑癌基因的改變或被認為屬於細胞間重要連接結構且可行使細胞間通信功能的縫隙連接(Gap junction)獨自的功能異常，均可導致細胞的異常生長，如接觸抑制的喪失。據認為，縫隙連接是細胞傳遞生長調控信號的重要結構，細胞縫隙連接可以通過將生長抑制信息從生長靜止的細胞傳遞到生長活躍的細胞，並在達到一定閾值時，使後者停止生長。而出現細胞生長接觸抑制的喪失，主要是縫隙連接功能的異常，致使通過縫隙連接的信號物質傳遞發生障礙，從而引起細胞生長的異常；其檢測方法目前主要是通過傳統的貼壁培養細胞H3-TDR標記法，即檢測細胞增殖狀態的方法。其原理為，經某種方式處理的細胞，生長達到匯合狀態的一定密度時，用H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)標記，再經放射自顯影檢測若細胞有增殖生長，則H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)被摻入到細胞內的DNA中而產生標記；反之，則H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)不能摻入到細胞內的DNA中進行標記。因此，依據標記指數可判定細胞的增殖生長狀態。當檢測細胞是否發生轉化時多採用軟瓊脂培養法，即將細胞接種於夾層的軟瓊脂中，觀察其能否形成克隆，能形成克隆的則為轉化細胞或腫瘤形成細胞。上述方法為檢測細胞增殖狀態的方法，均非直接研究細胞增殖調控機理的方法；而利用檢測裝置，尤其是利用專一的器皿對細胞生長的接觸抑制進行研究，至今還未見報導。
本發明的另一目的是提供細胞接觸抑制檢測裝置的製備方法以及該裝置在檢測細胞接觸抑制中的應用。
本發明的目的是由如下技術方案實現的。
由培養皿、蓋玻片、不乾膠透明膠帶、石蠟塗層、細胞培養觀察池組成。置於培養皿內的蓋玻片中央粘有矩形不乾膠透明膠帶，膠帶上有數條被切斷但彼此緊鄰的小膠帶，每條小膠帶的一端有可揭起的端頭，膠帶的表面除端頭外塗有一層石蠟，在蓋玻片上的膠帶一邊，有一因小膠帶和其上的石蠟被揭起而由石蠟圍成的細胞培養觀察池。
所述的小膠帶是至少兩個緊鄰的幾何圖形樣膠帶之一。
所述的小膠帶是指被切斷成2～5條彼此緊鄰的矩形膠帶之一。
所述的細胞培養觀察池的形狀隨小膠帶的形狀而改變。
所述的細胞培養觀察池的容積隨相鄰小膠帶的揭起而增加。
所述的細胞培養觀察池的底面與其邊緣壁的夾角為45～100度。
細胞接觸抑制的檢測裝置的製備方法，該方法的步驟順序如下(1)取一潔淨蓋玻片，將比蓋玻片面積略小的不乾膠透明膠帶平整無氣泡地貼於蓋玻片中央；(2)用刀片在上述膠帶中部刻一矩形框，並將其切割成兩條以上的小膠帶；(3)用刀尖在二條緊鄰的小膠帶的一端，分別挑起一可揭的端頭，備用；(4)將上述膠帶及其周邊均勻塗布一層融化的石蠟，然後冷卻使石蠟固化；(5)夾住步驟(3)製備的小膠帶端頭中的一個，向膠帶另一端方向揭去小膠帶及敷於其上的石蠟，使蓋玻片表面形成一面積同小膠帶的凹池；(6)修整上述凹池，使其底面與其邊緣壁的夾角為45～100度，然後對其消毒、滅菌即製作成細胞培養觀察池；(7)根據實驗需求，可重複步驟(5)、(6)的操作，使細胞培養觀察池的容積不斷擴大；(8)將上述帶有細胞培養觀察池的蓋玻片放於一帶蓋的潔淨培養皿中，共同組成細胞接觸抑制檢測裝置。
應用細胞接觸抑制檢測裝置進行細胞接觸抑制檢測的方法，其具體步驟如下(1)取貼壁生長的對數生長期實驗細胞，製成單細胞懸液，並調整細胞濃度為1×108～1×1013個/ml；(2)取上述實驗細胞懸液，滴注於檢測裝置中的細胞培養觀察池內，懸液量10～30μl為宜；(3)將上述檢測裝置蓋好，置於5％CO2，37℃，100％相對溼度的培養箱中，培養至細胞貼壁；(4)從培養箱中取出上述檢測裝置，無菌條件下，避開細胞培養觀察池，向檢測裝置的皿體中加入培養液，其液量以高出細胞培養觀察池1mm為宜；(5)重新蓋好檢測裝置，放回原培養條件繼續培養8～20小時後，觀察細胞培養觀察池內的細胞生長，以檢測實驗細胞接觸抑制的情況；
(6)若實驗細胞生長達到匯合狀態且與池壁密切接觸後停止生長，即為初步接觸抑制，再繼續培養經過2～5個細胞周期，實驗細胞仍停止分裂，即確定為實驗細胞出現接觸抑制；反之，在繼續培養後，實驗細胞仍能進行分裂，且呈現堆積生長，並能出現跨越池壁生長現象，則為非接觸抑制；(7)對步驟(6)中，證實已出現接觸抑制的實驗細胞，可以通過揭去與其細胞培養觀察池緊鄰的小膠帶和其表面石蠟的方法，增加其培養觀察池的容積，進行細胞接觸抑制釋放現象的觀察。
本發明的檢測裝置及應用方法為直接研究細胞增殖調控機理的方法，具有較傳統的軟瓊脂克隆和同位素標記方法更方便、客觀且無放射性汙染的優越性。該裝置及方法的建立，改變了傳統的接觸抑制理論，證明了細胞生長接觸抑制的產生與細胞及細胞外基質的幾何空間結構密切相關，任何影響細胞與細胞外基質間應力消除的因素(包括異常的縫隙連接)均可能導致細胞生長接觸抑制的喪失。這一發現對於自然界的動物細胞增殖調控具有廣泛的生物學意義，並且對於進一步深入研究細胞增殖調控的機理，揭示生命現象和癌變誘因具有十分重要的理論與實際意義。
利用上述檢測裝置及應用方法進行的實驗表明在不具有縫隙連接的條件下，或不存在信號物質通過縫隙連接在細胞間傳遞的情況下，培養的正常細胞依然會出現接觸抑制。當培養的貼壁細胞達到接觸抑制狀態時，在不更新細胞培養液的條件下，如果將與細胞培養觀察池緊鄰的小膠帶及其上的石蠟去除，可觀察到原與觀察池的石蠟壁密切接觸、已停止生長的細胞又恢復增殖，並沿因小膠帶和石蠟被揭起而在蓋玻片上新形成的暴露玻璃表面貼附生長，表現為「接觸抑制的釋放」。
對於貼壁細胞(包括正常細胞、腫瘤細胞及轉化細胞)，利用上述檢測裝置及應用方法進行培養，在未達到匯合狀態密度時，細胞可呈現沿細胞培養觀察池表面的遷移運動，但當細胞遷移至細胞培養觀察池壁並與其石蠟壁緊密接觸時，細胞原朝向石蠟壁方向的運動即行停止，即使是腫瘤細胞也不出現越過石蠟壁區域的現象，表現為細胞的運動性接觸抑制。但是出現運動性接觸抑制的細胞，仍可向石蠟壁以外的其他方向移動。除非是建系的腫瘤細胞及轉化細胞，當其生長達到單層匯合狀態密度並與細胞培養觀察池壁的石蠟壁緊密接觸以後，在不改變培養條件的情況下，細胞仍會出現繼續增殖，並呈堆積性生長狀態；增殖的細胞能越過石蠟壁，並貼附於石蠟表面向外周擴散性生長，表現為非接觸抑制。
取貼壁生長的對數生長期細胞，如人胚肺成纖維細胞，BEL-7402肝癌細胞，SGC胃癌細胞之一，用胰酶常規方法消化成單細胞懸液；調整細胞濃度為1×1012個/ml，取20μl滴注入檢測裝置中的細胞培養觀察池5內，沿接種面長軸方向將細胞懸液接種成一條帶狀，避免細胞懸液與其兩邊的石蠟壁接觸；接種完畢後，立即將檢測裝置的蓋封好，置於5％CO2，37℃，100％相對溼度的培養箱中，培養至細胞貼壁；取出上述檢測裝置，在無菌條件下，避開細胞培養觀察池5，向檢測裝置的皿體中加入高出細胞培養觀察池1mm量的培養液，封好檢測裝置放回原培養條件繼續培養，12小時後觀察細胞培養觀察池5內的細胞生長，以確定實驗細胞接觸抑制的有無。
若實驗細胞生長達到匯合狀態且與池壁密切接觸後停止生長，即為初步接觸抑制，再繼續培養經過4個細胞周期，實驗細胞仍停止分裂，即確定為實驗細胞出現接觸抑制；反之，在繼續培養後，實驗細胞仍能進行分裂，且呈現堆積生長，並能出現跨越池壁生長現象，則為非接觸抑制。
對於已證實已出現接觸抑制的實驗細胞，可以通過揭去與其細胞培養觀察池緊鄰的小膠帶和其表面石蠟的方法，增加其培養觀察池的容積，進行細胞接觸抑制釋放現象的觀察。
權利要求
1.一種細胞接觸抑制的檢測裝置，由培養皿、蓋玻片、不乾膠透明膠帶、石蠟塗層、細胞培養觀察池組成，其特徵在於置於培養皿內的蓋玻片中央粘有矩形不乾膠透明膠帶，膠帶上有數條被切斷但彼此緊鄰的小膠帶，每條小膠帶的一端有可揭起的端頭，膠帶的表面除端頭外塗有一層石蠟，在蓋玻片上的膠帶一邊，有一因小膠帶和其上的石蠟被揭起而由石蠟圍成的細胞培養觀察池。
2.如權利要求1所述的細胞接觸抑制的檢測裝置，其特徵在於所述的小膠帶是至少兩個緊鄰的幾何圖形樣膠帶之一。
3.如權利要求2所述的細胞接觸抑制的檢測裝置，其特徵在於所述的小膠帶是指被切斷成2～5條彼此緊鄰的矩形膠帶之一。
4.如權利要求1所述的細胞接觸抑制的檢測裝置，其特徵在於所述的細胞培養觀察池的形狀隨小膠帶的形狀而改變。
5.如權利要求1所述的細胞接觸抑制的檢測裝置，其特徵在於所述的細胞培養觀察池的容積隨相鄰小膠帶的揭起而增加。
6.如權利要求1所述的細胞接觸抑制的檢測裝置，其特徵在於所述的細胞培養觀察池的底面與其邊緣壁的夾角為45～100度。
7.如權利要求1所述的細胞接觸抑制的檢測裝置的製備方法，該方法的步驟順序如下(1)取一潔淨蓋玻片，將比蓋玻片面積略小的不乾膠透明膠帶平整無氣泡地貼於蓋玻片中央；(2)用刀片在上述膠帶中部刻一矩形框，並將其切割成兩條以上的小膠帶；(3)用刀尖在二條緊鄰的小膠帶的一端，分別挑起一可揭的端頭，備用；(4)將上述膠帶及其周邊均勻塗布一層融化的石蠟，然後冷卻使石蠟固化；(5)夾住步驟(3)製備的小膠帶端頭中的一個，向膠帶另一端方向揭去小膠帶及敷於其上的石蠟，使蓋玻片表面形成一面積同小膠帶的凹池；(6)修整上述凹池，使其底面與其邊緣壁的夾角為45～100度，然後對其消毒、滅菌即製作成細胞培養觀察池；(7)根據實驗需求，可重複步驟(5)、(6)的操作，使細胞培養觀察池的容積不斷擴大；(8)將上述帶有細胞培養觀察池的蓋玻片放於一帶蓋的潔淨培養皿中，共同組成細胞接觸抑制檢測裝置。
8.應用如權利要求1所述的細胞接觸抑制檢測裝置進行細胞接觸抑制檢測的方法，其具體步驟如下(1)取貼壁生長的對數生長期實驗細胞，製成單細胞懸液，並調整細胞濃度為1×108～1×1013個/ml；(2)取上述實驗細胞懸液，滴注於檢測裝置中的細胞培養觀察池內，懸液量10～30μl為宜；(3)將上述檢測裝置蓋好，置於5％CO2，37℃，100％相對溼度的培養箱中，培養至細胞貼壁；(4)從培養箱中取出上述檢測裝置，無菌條件下，避開細胞培養觀察池，向檢測裝置的皿體中加入培養液，其液量以高出細胞培養觀察池1mm為宜；(5)重新蓋好檢測裝置，放回原培養條件繼續培養8～20小時後，觀察細胞培養觀察池內的細胞生長，以檢測實驗細胞接觸抑制的情況；(6)若實驗細胞生長達到匯合狀態且與池壁密切接觸後停止生長，即為初步接觸抑制，再繼續培養經過2～5個細胞周期，實驗細胞仍停止分裂，即確定為實驗細胞出現接觸抑制；反之，在繼續培養後，實驗細胞仍能進行分裂，且呈現堆積生長，並能出現跨越池壁生長現象，則為非接觸抑制；(7)對步驟(6)中，證實已出現接觸抑制的實驗細胞，可以通過揭去與其細胞培養觀察池緊鄰的小膠帶和其表面石蠟的方法，增加其培養觀察池的容積，進行細胞接觸抑制釋放現象的觀察。
全文摘要
本發明公開了一種細胞接觸抑制檢測裝置及其製備方法和應用。該裝置主要由置於培養皿內的蓋玻片,粘於其上的不乾膠透明膠帶以及塗布於膠帶之上的石蠟和蓋玻片上由石蠟圍成的細胞培養觀察池構成。應用該裝置可準確地進行細胞生長的接觸抑制、非接觸抑制及運動接觸抑制的檢測,以及進行「細胞接觸抑制釋放現象」的觀察。該裝置操作簡單,結果直觀、準確。
文檔編號C12M3/00GK1354256SQ0113520
公開日2002年6月19日 申請日期2001年11月30日 優先權日2001年11月30日
發明者國前, 於金明, 廖湘魯, 李敏, 王興武, 魏玲, 鄭燕 申請人:國前