以調節化學發光為手段分析被分析物的方法
2023-05-27 04:38:16 1
專利名稱：以調節化學發光為手段分析被分析物的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用標記了化學發光物質的材料而進行的分析物質的方法。更具體地說，本發明涉及一種在較寬範圍內，通過減少化學發光的數量而進行的分析試驗方法。
背景技術：
在所有的針對實驗中的被分析物的分析方法中，溶液都被探針標記了化學發光物質。通過測量化學發光的數量，該方法被廣泛地用於高靈敏地確定被分析物質的量。該方法用於合適數量的被分析物。然而，當存在大量的被分析物(例如通過象聚合酶鏈反應產生許多拷貝時)時，化學發光的數量超出了該方法測量裝置的測定極限，使準確的分析變得不可能了。測量結果超過分析上限的樣品，通過稀釋試驗溶液再次測定。這種工藝非常費事。特別地，通過基因擴增而擴增的樣品，可能因稀釋而導致擴增產物的汙染。需要極端小心以避免汙染，更進一步增加了勞動。為了擴寬分析範圍而不需稀釋樣品，除了期待測量裝置的改進外別無選擇。
作為發明人，我們發現以上超過分析限制範圍的樣品的測定的問題可以通過減少化學發光的數量而加以解決，而不需要諸如稀釋樣品的費力操作，也不需要測量裝置的改進。這個發現使我們完成了本發明。
本發明的公開本發明是一種利用標記了化學發光物質的材料對物質進行分析的方法，該方法包括降低化學發光的數量。本發明進一步提供了一種分析方法，包括添加猝滅劑和/或降低化學發光物質標記的探針的特定活性。
以上表明，利用化學發光物質標記的材料進行物質的分析指的是，比如把含有被分析物的樣品與標記了化學發光物質的材料反應，然後測量該共軛物質的化學發光的數量以檢測或測定被分析物。
附圖的簡要說明
圖1表示添加酚紅對血清中HBV模板的定量擴增和檢測的影響；圖2表示添加未標記的探針對血清中HBV模板的定量擴增和檢測的影響。
本發明的最佳實施方式(1)通過添加猝滅劑降低化學發光的數量用於本發明的猝滅劑可以是任何能猝滅化學發光的物質。例如，它包括色料和印度油墨(印度油墨滴劑，即度油墨上清液)。色料的例子有結晶紫，溴酚藍，胭脂紅酸，氯酚紅，蘇木紫，溴酚紫，溴酚紅，玫紅酸，酚紅，甲酚紅，和異甲酚紅。
色料用作猝滅劑時，在測量化學發光時的色料濃度可在0.01-10％，最好在0.01-1％的範圍內，儘管它隨著所用色料不同而不同。另一方面，印度油墨用作猝滅劑時，其在測量化學發光時的量可以在0.01-50％，最好在1-20％的範圍內，依試液的量而定。猝滅劑可以在測量化學發光之前的任何時間加入。例如，可以在被分析物與標記探針反應前或反應後加入。
(2)通過降低化學發光物質標記的探針的特定活性而減少化學發光的數量。
本發明中，為了降低標記探針的特定活性，將一個未標記探針加到標記的探針上。未標記探針的加入量可以在0.1-105，最好10-103的範圍，相對於標記探針的1。
(3)結合方法(1)和方法(2)本發明中，猝滅劑的加入和化學發光物質標記的探針的特定活性的降低可以結合起來。這種結合使用兩種方法的條件是遵守上述的範圍。
按照本發明，分析方法的使用確保化學發光的數量能夠被準確地測量，甚至當樣液中被分析物的量大得超過分析的極限範圍時也是如此。舉例來說，從微生物或細胞的遺傳信息(DNA或RNA)的基因擴增產物，可以很容易地檢測或定量測定被分析物。這個辦法可以從將在後面提供的實施例1-4中得到證實。
在涉及加入猝滅劑的方法中，不僅正信號而且背景(噪聲)的水平也降低了。這種化學發光數量的降低使得定量地測量強的正信號成為可能，而背景(噪聲)水平的降低使得分辨弱的正信號成為可能。總之，猝滅劑的加入確保了分析高強正信號的樣品又不影響弱的正信號的分辨。這種作用將為以後將要提供的實施例1-3所證實。
將本發明用於減少化學發光的數量，檢測或定量測定超過分析極限範圍的樣品或具有高強正信號水平的樣品。特別地，添加猝滅劑的方法也降低了背景(噪聲)水平。這樣，有高強正信號的樣品可以得到測量而不影響弱的正信號的樣品的分析。因此，本發明的方法證明是極好的方法，它能擴寬分析範圍而不用稀釋樣品或改進測量裝置。
實施例現在參考實施例更加詳細地說明本發明，對於實施例的說明並不限定本發明。
〔實施例1〕方法5μl含有HBV-DNA序列的人血清(Galibert，F.，Mandavt，E.，FitioussiF.，Tiollais，P.and Charnay，P.，Nature281,646-650(1979)(每次擴增50-5,000份)與20μl鹼溶液(pH13)混和，然後在97℃加熱5分鐘。在室溫下，讓混和物涼10分鐘，再用緩衝液中和。加入兩種引物，在室溫下退火。加入DNA和RNA聚合酶後，在37℃進行基因擴增(用正式出版的日本專利公報號500759/92所述的方法)。擴增產物與吖啶酯標記的探針在60℃雜交，之後，用HPA方法檢測擴增產物(Arnold JR，L.J.，Hammond，P.w.，Wiese，W.A.andNelson，N.C.，Clinical Chemistry 35，1588-1594(1988))。通過測量化學發光來檢測擴增產物時，研究了添加酚紅的影響。酚紅以0.05％的量加入到用於化學發光測量的試液中以測量化學發光的數量。測量結果與從不含酚紅的試液得到的結果比較。結果如圖1所示。
討論如圖1所示，不含酚紅的樣品在大約500GE(基因組當量)/AMP時，幾乎達到了分析極限(飽和值)，在該值以上，化學發光的數量不再呈線性關係。對於含有酚紅的樣品，化學發光的數量甚至在5000GE/AMP時還保持線性關係。這意味著添加酚紅使得500GE/AMP或以上的分析變為可能。與不含酚紅的樣品相比，含酚紅的樣品顯著地降低了背景(噪聲)水平(DNA含量＝0)，這樣就使分析弱的正當信號的樣品(大約50GE/AMP)成為可能。換一句話說，酚紅的加入確保能分析強正信號的樣品而不會影響弱的正信號的樣品的測定。
〔實施例2〕方法在檢測如實施例1中通過基因擴增得到的擴增產物時，加入不同量的酚紅以研究添加酚紅的影響。以0.025-0.2％的量，將酚紅加入到用於化學發光測量的試液中以測量化學發光的數量。測量結果與用不含酚紅的試液得到的結果比較。結果如表1所示。
表1酚紅對測定化學發光數量的影響
討論如表1所示，正樣的化學發光的數量與負樣的化學發光數量的減少依賴於所添加的酚紅的量。這些發現表明，在很寬的酚紅濃度範圍內，本發明方法都是可行的。
〔實施例3〕方法以與實施例2同樣的方式進行試驗，除了用商業上可得到的印度油墨代替酚紅之外。
向用於化學發光測量的試液中加入1.25％-10％體積的印度油墨，測量化學發光的數量。結果如表2所示，與不含印度油墨的試液的測量結果比較。
表2印度油墨對測定化學發光數量的影響
討論如表2所示，正樣的化學發光的數量與負樣的化學發光(背景)數量的減少依賴於所添加的印度油墨的數量。這些發現證明本發明方法可在很寬的印度油墨濃度範圍內使用。
方法與實施例1中同樣的方式進行基因擴增。擴增產物與吖啶酯標記的探針在60℃下雜交，同時加入不同數量的未標記探針。相對於標記探針的1，未標記探針的量為10-1000。雜交後，樣品中化學發光的數量用HPA方法測量。結果如圖2所示，與不含未標記探針的試液的測量結果比較。
討論如圖2所示，不含未標記探針的樣品在500-5000GE/AMP時幾乎達到分析極限(飽和值)，高於該值，化學發光的數值不再呈線性。相反，含有未標記探針的樣品，表現出化學發光的數量的減少依賴於添加的未標記探針的數量。當添加的未標記探針的量與標記探針的量的相對值為100(未標記探針)1(標記探針)或更高時，甚至在大約500,000GE/AMP時，分析都是可能的。這樣，添加未標記探針使得分析500-500,000 GE/AMP或更高值變得可能。
權利要求
1.一種利用化學發光物質標記的材料對被分析物進行分析的方法，包括減少化學發光的數量。
2.權利要求1所述的分析方法，包括添加猝滅劑和/或降低化學發光物質標記的探針的特定活性。
3.權利要求1所述的分析方法，包括添加一種猝滅劑。
4.權利要求1所述的分析方法，包括降低一種化學發光物質標記的探針的特定活性。
5.權利要求3所述的分析方法，其中色料和/或印度油墨用作猝滅劑。
6.權利要求4所述的分析方法，其中把未標記的探針加到化學發光物質標記的探針上以降低其特定活性。
全文摘要
一種利用化學發光物質標記的材料對被分析物進行分析的方法,包括添加猝滅劑和/或降低化學發光物質標記的探針的特定活性,從而減少化學發光的數量。
文檔編號G01N21/76GK1172530SQ96191746
公開日1998年2月4日 申請日期1996年2月2日 優先權日1995年2月2日
發明者逵保宏, 上參鄉慶一, 大光男 申請人:中外製藥株式會社