含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉基因小鼠的製作方法及其用途的製作方法

2023-05-27 02:45:56

專利名稱：含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉基因小鼠的製作方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及製作癌症轉基因動物模型的方法；該動物模型在多種癌 症的癌變機理研究、致癌物或抑癌物的篩選研究、藥物的臨床前安全 性評價研究中的用途；以及由該模型動物衍生出來的細胞、組織、器 官及胚胎及其在上述領域中的用途。
背景技術：
自80年代初首例轉基因小鼠誕生以來，已經建立和發展了較多的 基因導入方法，包括顯微注射、反轉錄病毒介導的基因轉移、胚胎幹 細胞技術、核移植技術、基因敲除(敲入)技術與RNA幹涉，以及精子 載體等，並由此也產生了眾多專利(美國專利US6576811B1，2003)。
其中，因為其穩定性和成功率較高，顯微注射方法成為轉基因的最 為常用的方法之一。它是將含有重組DNA的溶液直接注射進入胚胎 中，在多數情況下，是將DNA注射到雄性前核中。在精製用於顯微注 射的DNA溶液時， 一般採用酶切、回收目的DNA片段，凝力交DNA 純化等步驟獲得純淨的DNA樣品。合適的顯微注射針和持定針是把 DNA成功注射入0.5天的胚胎雄性前核的關鍵。胚胎的質量也是轉基 因成功的關鍵，良好的胚胎形狀規則，飽滿。
把經顯微注射的胚胎移植到假孕母鼠受體是一項技術性強但很直 接的一項外科技術，它的全套操作必須做到無菌，快速和靈巧。待假 孕鼠懷孕生仔後，通過剪取幼仔尾尖或者通過打孔器取得部分耳闊， 獲取2 4周齡的可能的轉基因首建鼠的組織樣品，用於提取DNA， 通過PCR或者Southern雜交技術確定目的基因的整合情況。
小鼠在6 8周齡性成熟時可以用於交配建系。出生的轉基因後代 也通過PCR或Southern雜交方法鑑定，留存含有轉基因的動物，進一 步繁殖擴大，以便實現①通過幾代的繁育來觀察轉基因的表達和遺傳 性；②擴大群體數量為試驗研究提供更多的小鼠；以及③產生純合轉進行比較。
疾病動物模型的建立是轉基因研究的重要領域，其中癌症動物模型 的建立尤為受到重視。這是因為，癌症是威脅當今人類生命的第二大
疾病。據WHO報導，2005年全球有5800萬人因病死亡，二其中有 13%為罹患癌症死亡。世界各國不斷投入大量的資金和人力用於癌症發 生機理研究和治療性藥物的研製(Wynn, 2007; Clin InvesU 17:524-529; Galanski and Keppler， 2007， Anticancer Agents Med Chem, 7: 55-73)。但 是，無論是在基礎研究領域還是在藥物研發領域，都會遇到因缺乏合 適的評價手段和研究平臺而導致工作停滯不前的被動局面，為適應這 一需求，各種通過現代生物技術手段對受體動物基因組進行改造的遺 傳修飾動物模型(Genetic Modified Animal model)應運而生(Barone M etal， 2006， Mol Med， 12:115-23; Choedon et al, 2006， World J Gastroenterol, 12: 2517-2522)。癌症轉基因小鼠模型的出現有力的推動 了癌症研究的發展，它是在分子水平和整體水平開展有關癌發生、發 展、轉移(Tanakaeta1，2006， AnnN Y Acad Sci. 2006, 1086:1-10)和防 治石開究(Galanski and Keppler, 2007， Anticancer Agents Med Chem, 7: 55-73)的良好活體材料，也是癌相關藥物研製、新藥安全性評價的優 良平臺(Mitsummori，2003， J Toxicol Sci. 28: 371-383)。從中獲得的信 息和數據、以及這些數據與人體的相關性是其它離體手段難以取代的。
對於致癌性評價而言，傳統的致癌性實驗多採用大小鼠進行，時間 長(需2年)、費用高、結果針對性差。鑑於此，ICH等國際機構倡用 導新的手段來評價藥物的致癌性，轉基因癌症動物模型是理想替代手 段。因此，建立優秀的癌症動物模型十分必要。
rasH2轉基因小鼠和大鼠(美國專利US6576811 Bl)就是此類癌症 轉基因模型之一。該小鼠模型最先由日本實驗動物中心研究所於1989 年建立(Katsukietal， 1989)，導入的是人的正常全長ras基因(c-//"-my) (Sekiya et al, 1985)。 c-//a-ras是ras原癌基因家族的一員，編碼由189 個胺基酸組成的p21蛋白。p21蛋白是細胞內信號傳導系統中的重要信 號轉導因子，對細胞的增殖和分化起著調節作用(Douglas R, 1993)。 r似基因第12、 13、 61位編碼子突變可引起p21蛋白構象改變，導致 發生多種癌症(Mitsummori,2003)。 rasH2癌症模型在致癌性風險評價方面有著十分重要的用途。根據2003年國際生命科學研究所(ILSI)， 環境與健康科學研究所(HESI)和國際毒理項目(NTP)等多家國際 機構對幾十種已知遺傳毒性致癌物的聯合測試，發現該模型能夠準確 的區分致癌物和非致癌物，反應靈敏，結果可靠，實驗周期僅需26周， 是符合ICH新藥短期致癌性檢測指導原則的最佳替代模型(替代傳統 2年期大小鼠致癌性實驗)。
在誘導致癌的機理研究方面業己做了大量的工作，加深了人們對 致癌機理的認識(Mitsummori, 2003)。起初人們認為，轉入多拷貝人 原癌基因後，為化學致癌物將原癌基因轉化為癌基因提供了更多耙點
(Saitoh etal, 1990， Oncogene, 5: 1195-1200)，致使該模型對致癌物更 為敏感。轉基因點突變活化也是一個原因，如前胃和皮膚乳頭瘤的產 生(Ando et al， 1992， Cancer Res, 52: 978-982; Mori et al， 2000, Toxicol. Pathol. 13: 165-172);但對肝腫瘤而言，與點突變的相關性不甚明確
(Hayashi et al， 1998， Toxicol. Pathol. 26: 556-561 )。後來的研究顯示， 過表達的轉基因產物與癌變信號通路中其它的癌基因和抑癌基因相互 作用可能是該模型對致癌物敏感的深層原因(Tamaoki， 2001， Toxicol Pathol. 29 suppl: 81-89)。在致癌物誘導下，鼠內源ros基因表達上調， cfo"， 0m7， rect ge/so//"等癌相關基因轉錄水平改變的事實(Okamura M,etal,2007， Cancer Lett. 245: 321-330)為這一假設提供了部分證據。 儘管如此，由於該模型的基因來源於一個腫瘤病人(SekiyaTetal， 1984; 1985)，原本已經發生突變。為了獲得正常的轉基因，不得不經 過多步分子生物學操作，校正突變位點。另一方面，該模型的轉基因 較大，在5-端有較長的"冗餘"序列。這些不足會給基因操作增加難 度，而且不利於重複。
鑑於此，本申請人在實際工作中，構建了含有人原癌基因c-Ha-ras 的轉基因動物模型。該模型的轉基因來自於正常人基因組，分離完成 後可直接用於轉基因。對轉基因進行了優化，比以前使用的轉基因在 5-端減少了 0.4kb。
更為重要的是，獲得的動物模型具有獨到的表型。以前的轉基因 屬於誘導型模型，其外觀和體重與正常鼠幾乎無異
(http:〃www.rash2.com/-phenotype)， 一般只有在給予陽性致癌物時才
6誘導產生腫瘤，自發瘤的機率很低(<1.1%)，發生吋間晚(8 27周， 皮膚鱗狀細胞乳頭瘤，http:〃www.rash2.com/-background data)。而本 研究獲得的首建鼠出生後2周左右，即在背部自發產生可見瘤狀物， 生長速度快，並且由一處發展成多處。也就是說，與日本的rasH2模 型相比，本研究獲得的癌症轉基因模型由誘導型變成了自髮型，發生 的時間較之早，表明可以作為一個新的癌症動物模型，用於癌症發生 機理研究。主要表現在本模型為自髮型，而且發生時間比日本msH2 模型早，這暗示了本模型可能對於致癌物的反應比rasH2更為敏感， 更適合用於癌症發生機理方面的研究。鑑於人類癌症發生的深層原因 是"人體本身與環境因素長期相互作用的結果"，而一般情況下，人 體接觸類似大劑量強致癌物的機率很低，所以有理由相信，自髮型模 型得出的有關癌症機理的數據比誘髮型更接近人體真實。此外，本模 型是轉基因現象學研究的良好材料。已有研究表明，轉基因的表達強 烈的受到宿主染色體整合位點的影響，轉基因表達水平的高低與拷貝 數的關係不甚明星，而與整合位點有關。本研究中獲得轉基因首建鼠 在早期即出現了瘤狀物，暗示了轉基因的表達水平高或發生突變(奚 濤，2001，藥物生物技術，2001， 8: 301-305)。本模型與日本的模型 進行比較研究，可回答插入位點與轉基因表達的關係等基本問題。因 此，在基礎研究方面，本模型也必將有著重要的用途。
腫瘤的自發性與宿主的遺傳背景有較大的關係。自發腫瘤對模型 動物在安全評價中應用是不利的，因為自發腫瘤會與有致癌性風險的 待試物誘導產生的腫瘤混淆。為了解決這一問題，可與轉基因動物C57 與另一個近交系如BALB/c雜交，使用產生的F1即可。

發明內容
本發明涉及含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉基因小鼠的製作方法 及其用途。該動物模型被人為的轉入了人源原癌基因c-Ha-ras。該基因 來自人體正常組織，轉基因含有該基因的調控序列、全部外顯子和內 含子，以充分保證所表達蛋白的完整性。實施該發明的途徑主要有顯 微注射法，是本發明的實施方案之一。首先從人體組織中分離基因， 經過多級純化精製獲得轉基因，經顯微注射方法注入鼠胚胎中，然後移植到假孕鼠體內；經過分子生物學方法檢測，獲得含有轉基因的陽 性轉基因動物；進一步交配建系，獲得轉基因動物種群。在此基礎上， 可以進一步獲得該動物模型的細胞、器官及胚胎。
本發明所述的人原癌基因c-Ha-ras，其序列如SEQ1DN0: 1所示。 所述的人原癌基因c-Ha-ras含有4個編碼外顯子、啟動子區域及多聚 腺苷酸加尾信號序列polyA。其中所述的啟動子是嚙齒類絨毛蛋白啟動 子、巨細胞病毒CMV的啟動子；所述的加尾序列是SV40、 BGH的 polyA信號序列。
本發明還包括含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的宿主細胞，以及 由所述的宿主細胞形成的組織，器官。
本發明涉及所述的宿主細胞、組織或器官在致癌物篩選或評價、 抑癌物的篩選、藥物的安全性評價中的用途；在毒理學中的用途和在 免疫毒理學中的用途。
本發明涉及製備基因組中含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的齧齒
米離娃"口的七、>土 甘卑鵬水
3^C乂々67hu'j乂j y厶？ 六y^ k乂v :
(1) 分離獲得人原癌基因c-Ha-ras基因；
(2) 通過超排卵、交配、受精卵篩選分離步驟獲得嚙齒類受精卵；
(3) 通過顯微注射方法將c-Ha-ms基因注入受精卵中，獲得含有人 原癌基因c-Ha-ras的嚙齒類受精卵；
本發明還涉及製備基因組中含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的齧 齒類轉基因動物的方法，步驟為
(1) 製作輸精管結紮雄鼠，然後讓其與正常的發情期雌鼠交配，獲 得假孕鼠；
(2) 將如權利要求9所述的受精卵直接移植或者在C02培養箱中 過夜培養至2細胞時移植入假孕鼠的輸卵管內；
(3) 讓假孕鼠生仔，待離乳後通過分子生物學方法檢測獲得轉基因 陽性子代，即首建鼠；
(4) 在首建鼠性成熟後進行交配建系，獲得該轉基因動物。
本發明的有益效果在於本申請人對人原癌基因c-Ha-ras進行了優 化，使其比現有技術中的轉基因在5-端減少了0.4kb。更為重要的是，提供本發明的方法獲得的動物模型具有獨到的表型，所獲得的首建鼠 出生後2周左右，即在背部自發產生可見瘤狀物，生長速度快，並且 由一處發展成多處。即本發明獲得的癌症轉基因模型為自髮型，發生 的時間較早，表明可以作為一個新的癌症動物模型，用於癌症發生機 理研究。
此外，本模型是轉基因現象學研究的良好材料。己有研究表明， 轉基因的表達強烈的受到宿主染色體整合位點的影響，轉基因表達水 平的高低與拷貝數的關係不甚明星，而與整合位點有關。本研究中獲 得轉基因首建鼠在早期即出現了瘤狀物，暗示了轉基因的表達水平高
或發生突變(奚濤，2001，藥物生物技術，2001， 8: 301-305)。本模
型與日本的模型進行比較研究，可回答插入位點與轉基因表達的關係 等基本問題。因此，在基礎研究方面，本模型也必將有著重要的用途。 腫瘤的自發性與宿主的遺傳背景有較大的關係。自發腫瘤對模型 動物在安全評價中應用是不利的，因為自發腫瘤會與有致癌性風險的 待試物誘導產生的腫瘤混淆。為了解決這一問題，可與轉基因動物C57 與另一個近交系如BALB/c雜交，使用產生的F1即可。


圖1顯示本發明所用c-Ha-ms基因的結構示意圖及與現有技術中 (美國專利US6576811B1)公開的基因的長度對比。本發明所用轉基 因長度為6.5 kb (圖l-A)，含有4個外顯子，依次為Exl， Ex2， Ex3 和Ex4，以實心方框表示；現有技術公開的轉基因為6.9kb (圖l-B)， 在5'端側翼區比本發明所述的c-Ha-ras基因多出0.4kb。圖中表明了與 全基因拼接相關的酶切位點。
圖2顯示轉基因c-Ha-ms的全序列。畫線部分為4個外顯子區域。 圖3顯示轉基因c-Ha-ms的分離策略。從正常人血液中分離基因 組DNA，然後採用PCR方法分別擴增5，端1991bp、中段的1853bp， 以及3'端的3180bp。擴增的1853bp片段5'端含有Kpnl位點，而在3' 端，添加EcoRI位點。擴增片段用Kpnl+EcoRI雙切，獲得1400 bp的 片段，插入同樣雙切的pUC19載體中，獲得第一個中間載體pUC19-1400。然後將擴增的1991bp片段用HindlII+Kpnl，獲得具有兩 個粘端的l卯0bp片段，插入上述中間載體pUC19-1400，獲得第二個 中間載體pUC19-3300。將擴增獲得3180 bp的片段測序後，用EcoRI 再次切下，並將pUC19-3300用EcoRI線性化，並將3180片段插入， 獲得含有全長轉基因c-Ha-ms載體pUC19-6500。由於3180bp片段兩 端均為EcoRI位點，需要對插入的方向進行鑑定，以獲得插入方向正 確的載體。
圖4顯示首建鼠在出生2周內即在背部發生多處瘤狀物(箭頭所 示)。首先出現的前背部，圓形，較堅硬，約2x3mm大小，生長速度 快，6周左右最大者達lxl cm，並且由一處發展成多處。這一特性在 以前同類模型中未見描述。
圖5顯示首建鼠的自發腫瘤。在出生後一年左右，有兩隻首建鼠 在頸部出現顯著腫瘤， 一隻在後背部出現顯著腫瘤。圖4-A，在頸部出 現明顯的腫瘤；圖4-B，在肺部發現多處腫瘤，箭頭所示其中較大者圖。 4-C，從小鼠身體分離下來腫瘤，箭頭所示在大的腫瘤內部含有多個小 型腫瘤；圖4-D，顯示分離下來的長有腫瘤的肺葉。即使在這些轉基因 陽性小鼠發生明顯腫瘤時Z而其同窩轉基因陰性小鼠表型正常。
圖6顯示轉基因的突變檢測。從轉基因動物首建鼠、包括其子代 的尾尖組織提取DNA，通過高保真PCR擴增轉基因的部分片段。該片 段長1853bp，包含c-Ha-ras基因的4個外顯子，也既是包含了易發生 突變的部位，即12， 13和61位胺基酸編碼子。將PCR擴增所得片段 經T-A克隆後測序，並通過DNAssist軟體進行序列比對。圖中Sequence 0為原始序列，以此為基準，圖6-A中，第96-98鹼基、99-101鹼基分 別編碼12、 13胺基酸；圖6-B中，第510-512鹼基編碼第61位胺基酸。 可見，這3個敏感位點均未發生突變。
具體實施例方式
實施例1:人源原癌基因c-Ha-ras DNA的分離 1.人源原癌基因c-Ha-ras DNA的結構
本發明涉及基因組中整合了含有人源原癌基因c-Ha-ras DNA的嚙齒類轉基因動物的製作方法。本發明所用轉基因(Tmnsgene)為c-Ha-ras 基因，全長6.5kb，含有4個外顯子，含有該基因本身的啟動子、調控 序列和polyA信號序列。它來自於正常人血液組織，比前文獻報導所 用轉基因短0.4kb (圖l)，其全長序列見圖2。 2.人源原癌基因c-Ha-rasDNA的分離
在之前的文獻報導中，轉基因c-Ha-ras DNA獲得採用構建文庫的方 式進行(SekiyaTetal, 1984; 1985)，分離基因的起始DNA來自 一名惡 性黑色瘤日本病人。由於該原癌基因的12、 13和61位胺基酸易發生 突變，突變後往往導致該基因的活化，並進一步誘發癌變。而來自腫 瘤組織的DNA往往已經發生突變，這對進一步顯微注射不利。在以前 的文獻報導中，多採用分子生物學方法進行改造，獲得完整的未發生 突變的轉基因，增加較多的工作量。
由於文庫構建是一個較複雜，較費時費力的工作。而PCR技術如 今已很成熟，故本發明採用PCR方法分段擴增、T-A克隆測序，然後 拼接成完整基因的策略。根據序列特徵，將基因分成前、中、後三段 進行分離(圖3)。首先從正常人血液中分離基因組DNA，然後採用 PCR方法分別擴增5'端長度為1991bp的片段，擴增的引物對為 Pri .F6506 :gctaagcttggtcccggcggatcccagcctttc 禾口 Pri.R371 :gagaattccagcctctccctggtacctctcatgcc; 為了便於連接，在前端弓1 物Pri,F6506中添加了酶切位點HindIII;中段的1853bp的片段，擴增 的引物對為Pri.F4886:gct^g^ggcaggtggggcaggagaccctgtag，在引物中 f忝力口 了 HindIII {立點，禾口 Pri.RN1735: gcg§^ctgcggtcagcagcctcccttgtgcc， 在引物中添加了EcoRI位點；以及3'端的3180bp片段，擴增採用的引 物對為Pri.FN 1735: acg^etcctgacgcaggtgagggggactc，在引物中添加了 EcoRI，禾口 Pri.RXN(E): gctg^^aatgagggatccctggagggatgcctggtg，也在弓l 物中添加了EcoRI位點。擴增的1853bp片段5'端含有Kpnl位點，而 在3，端，添加EcoRI位點。將該擴增片段用Kpnl+EcoRI雙切，回收 1400bp的片段，插入同樣雙切的pUC19載體中，獲得第一個中間載體 pUC19-1400。然後將擴增的1991bp片段用HindlII+Kpnl，插入用中間 載體pUC19-1400，獲得第二中間載體pUC19-3300。將擴增獲得3180 bp 的片段經T-A克隆測序後，用EcoRI再次切下，回收純化，並將pUC19-3300用EcoRI線性化，並將3180片段插入，獲得含有全長轉 基因c-Ha-ras載體pUC9-6500。由於380bp片段的兩端均為EcoRl 位點，所以需對插入的方向進行鑑定，將插入方向正確的質粒保存用 於轉基因的擴增。
實施例2:人源原癌基因c-Ha-ras DNA的導入
如本領域人員所知，通過顯微注射(Microinjection )生產轉基因動物 的過程包括以下多個步驟(1)製備不育雄鼠和假孕母鼠；(2)超排卵； (3)收穫受精卵；(4)目的DNA的製備；(5)將目的DNA導入受精卵；
(6)受精卵的移植；(7)首建鼠Founder中目的DNA整合情況的檢 測；(8)通過雜交繁育轉基因小鼠品系。在本發明中，顯微注射方法 均根據標準方法進行的，故不作更多的敘述。但是，本發明在實施過 程中，建立了一種適用的將DNA溶液注入顯微注射針的方法，此方法 可在2分鐘左右完成DNA溶液的填充，非常迅速。這一技術大大推進 了顯微注射工作進程(生物技術通訊，2007年04期)。
實施例3:轉基因動物的選擇
任何適當的嚙齒類動物可作為受體動物以用於生產本發明所述的 "轉基因動物"。顯然，"轉基因動物"還包括轉基因動物所產生的新生兒、 年幼的子代、發育成熟的動物及其胚胎；以及轉基因動物的子代的新 生兒、年幼的子代、發育成熟的動物及其胚胎。轉基因動物及其子代 的例子包括小鼠、大鼠、豚鼠等等，優選的嚙齒類動物是小鼠，如C57 小鼠。這是引物C5.7為成熟的近交系，遺傳背景清楚，穩定，而且其 受精卵適合做顯微注射，相對易於製作模型動物。
實施例4:轉基因動物的表型
本發明獲得的首建鼠具有新的表型。日本rasH2屬於誘導型模型， 其外觀和體重與正常鼠幾乎無異(http:〃www.rash2.com/-phenotype)， 一般只有在給予陽性致癌物時才誘導產生腫瘤，自發瘤的機率很低(< 1.1%)，發生時間晚(8 27周，皮膚鱗狀細胞乳頭瘤， http:ASvww.rash2.com/-backgrounddata)。而本研究獲得的首建鼠出生後2周左右，即在背部自發產生可見瘤狀物(圖4)，生長速度快，6 周左右最大者達1X1 cm，並且由一處發展成多處。也就是說，與曰本 的相比，本研究獲得的癌症轉基因模型由誘導型變成了自髮型，發生 的時間較之早。在該模型出生1年後，在頸部即出現明顯的瘤(圖5)， 生長極其迅速。解剖後，在肺部肉眼可見多處腫瘤(圖5-B， D)。
在有關rw基因的轉基因動物模型研究中，在出生後兩周即出現 瘤狀物的模型尚未見報導(奚濤等，2001)。經繼續深入探索，有望實 現(1)獲得一個可用於藥物致癌性安全評價的動物模型。這是開展 本研究的初衷，即替代傳統的大小鼠，用於評價新藥的致癌性、篩選 抗癌藥物、檢測置入性醫療器械的致癌性等。用轉基因動物模型替代 傳統的大小鼠致癌性實驗可以大大縮短時間(6個月w2年)、節省經 費，減少動物的用量，符合國際上關於動物福利的"優化、替代、減少"3R 原則要求。因此，本動物模型具有重要的實際應用價值。(2)本模型 具有新的特性，可以作為一個新的癌症動物模型，用於癌症發生機理 研究。主要表現在本模型為自髮型，而且發生時間比日本rasH2模 型早，這暗示了本模型可能對於致癌物的反應比rasH2更為敏感，更 適合用於癌症發生機理方面的研究。鑑於人類癌症發生的深層原因是 "人體本身與環境因素長期相互作用的結果"，而一般情況下，人體接
觸類似大劑量強致癌物的機率很低，所以有理由相信，自髮型模型得 出的有關癌症機理的數據比誘髮型更接近人體真實。(3)早期瘤狀物 的出現，意味著在用於致癌性實驗時，比以前的同類模型更為敏感， 這是最為重要的。
實施例5:轉基因動物的交配與建系
採用如下方案交配建系對於雌性首建鼠則與正常雄鼠交配，選擇 周齡在10周，具有交配經歷、身體健壯的C57小鼠與之交配。同居， 1周後開始檢查妊娠情況，如果發現懷孕即將雌鼠單獨飼養，直至生產。 如果為雄性首建鼠，則選擇8周以上，健壯的雌鼠與之交配。每一隻 首建鼠的後代單獨標記，作為一個系對待。檢測發現轉基因能在後代 中穩定遺傳，每窩產仔數量與正常小鼠無異， 一般能成功餵養，少有 吃仔等母性不良現象。這些有利特性為下一步大規模繁殖建系打下了基礎。
實施例6:轉基因的突變檢測
從轉基因動物首建鼠、包括其子代的尾尖組織提取DNA，通過高 保真PCR擴增轉基因的部分片段。該片段長1853bp，包含c-Ha-ms基 因的4個外顯子，也既是包含了易發生突變的部位，即12， 13和61 位 氨 基 酸。 擴 增 的 引 物 對 為 Pri.F4886:gct§§g￡^ggcaggtggggcaggagaccctgtag 禾口 Pri.RN1735 : gcgaattcctgcggtcagcagcctcccttgtgcc (EcoRI)。糹各PCR擴增所得片段經 T-A克隆後測序，並通過DNAssist軟體進行序列比對。結果顯示這幾 個位點均未發生突變(圖6)。
實施例7:轉基因動物的生命周期
癌症轉基因動物模型的生命周期較短， 一般在6個月以上時出現自 發腫瘤的機率上升，易死亡。本發明中，首建鼠的生命周期達到一年 左右，且一般狀態正常。序列表 中國藥品生物製品檢定所
含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉基因小鼠的製作方法及其用途
〈160〉 1
Patentln version 3. 4
〈210〉 1
<211〉 6506
DNA
<213〉 人
1
cttggtcccggcggatcccagcctttccccagcccgtagccccgggacctccgcggtggg60
cggcgccgcgctgccggcgc鄉gagggcctctggtgcaccggcaccgctgagtcgggtt120
ctctcgccggcctgttcccgggagagcccggggccctgctcggagatgccgccccgggcc180
cccagac3ccggctccctggccttcctcgagcaaccccgagctcggctccggtctccagc240
C83gCCC犯Ccccg卿ggccgcggccctactggctccgcctcccgcgttgctcccggaa300
gccccgcccgaccgcggctcctgacagacgggccgctcagccaaccggggtggggcgggg360
cccgatggcgcgcagccaatggtaggccgcgcctggc柳cggacgggcgcggggcgggg420
cgtgcgcaggcccgcccgagtctccgccgcccgtgccctgcgcccgc肌cccgagccgca480
cccgccgcggacggagcccatgcgcggggcgaaccgcgcgcccccgcccccgccccgccc540
cggcctcggccccggccctggccccgggggcagtcgcgcctgtg犯cggtgagtgcgggc600
agggatcggccgggccgcgcgccctcctcgcccccaggcggcagcaatacgcgcggcgcg660
ggccgggggcgcggggccggcgggcgtaagcggcggcggcggcggcggcggcgggtgggt720
ggggccgggcggggcccgcgggcacaggtgagcgggcgtcgggggctgcggcgggcgggg780
gccccttcctccctggggcctgcggg犯tccgggccccacccgtggcctcgcgctgggca840
cggtccccacgccggcgtacccgggagcctcgggcccggcgccctcacacccgggggcgt900
ctgggaggaggcggccgcggccacggcacgcccgggcacccccgattcagcatcacaggt960
cgcggaccaggccgggggcctcagccccagtgccttttccctctccgggtctcccgcgcc1020
gcttctcggccccttcctgtcgctcagtccctgcttcccaggagctcctctgtcttctcc1080
agctttctgtggctga卿atgcccccggttccccgccgggggtgcggggcgctgcccgg1140
gtctgccctcccctcggcggcgcctagtacgcagtaggcgctcagc犯atacttgtcgga1200
ggcaccagcgccgcggggcctgcaggctggcactagcctgcccgggcacgccgtggcgcg1260
ctccgccgtggccagacctgUctggaggacggtaacctcagccctcgggcgcctccctt1320
tagcctttctgccgacccagcagcttctaatttgggtgcgtggttgagagcgctceigctg1380
tcagccctgcctttgagggctgggtcccUttcccatcactgggtcatta1440〗500
gU,tgccc"cagat.ggc:cc1560
ggcctggggccctggct.1620
aecct:gtagggccgc兆gc:ccct.gaggagc1680
cgccggcggtgt,gcgctgtic1740
catccagctgatccagaaccatmgtggacgaateicgacaggtgagcct1,
ggcgccgccgt.ccaggtgccagcagctgctgcgggcgdgcccaggi:icaca1860
ggctggctgcagcccctggtCCCCtgCfltggtgctgtggccctgtctcctgcttcctcta1920
gtccctcgtctCtlgCiflCCCCgggcatgaga980
ggtaccagggagaggctggctgtgtgaactCCCCCC3Cggaaggtcctgeigggggtccct2040
gagccctgtcctcctgcaggattcctaccggaagceiggtggtcattgatggggagacgtg2100
cctgttggacatcctggataccgccggccaagcgccatgc2160
calgcgcaccggggagggcttcctgtgtgtgtttgcceitcagtcttttga2220
ggacatccacct1gtac3ggLgaaccccgtgaggctggcccgggagcccacgccgc;acagg2280
tg鵬ccaggccggctgcgtccaggcaggggcctcctgtcctctctgcgcatgtcctgga2340
tgccgctgcgcctgcagcccccgtagccevgctctcgctttccacctctcagggagc卿t2400
caaacgggtgaaggactcggatgacgtgccctitggtgctggtgggg犯caagtgtgacct2460
ggctgcsicgcactgtggaatct.cggc鄉ctcaggacctcgcccgaagctacggcatccc2520
ctacatcgagacctcggccaElg6lCCCggC3ggtgeiggcagCtCtCC3CCCcacagctagc2580
c鄉gacccgccccgccccgccccagccagggagcagcactcactgaccctctcccttga2640
cacagggcagccgctctggctctagctccagctccgggaccctctgggaccccccgggac2700
ccatgtgacccagcggcccctcgcgctgtaagtctcccgggacggc鄉gcagtg鄉ga2760
ggcgagggccggggtctgggctcacgccctgcagtcctgggccgacacagctccggggaa2820
ggcgg鄉tccttgggg卿gctgccctgagccaggccggagcggtgaccctggggcccg2880
gcccctcttgtccccagagtgtcccetcgggcacctgttggttctgagtcttagtggggct2940
act鵬gacacgggccgtagctgagtcgagagctgggtgc鄉gtggtcaaaccctggcc3000
ttcagg鄉gccccgggccaccctgacctttgaggggctgctgtagcatg3060
atgcgggtggccctgggcacUcg卿tggCC￡LgagtCC￡Lgcttcccgtgtgtgtggtgg3120
gcctggggaagtggctggtggagtcgggagcttcgggccaggcaaggcttgatcccacag3180
c鄉gagcccctcacccaggc鄉cggccacaggccggtccctcctgatcccatccctcc3240
tttcccagggagtggaggatgccttctacacgttggtgcgtg卿txcggcagcacaagc3300
tgcgg犯gctgaaccctcctgatgagagtggccccggctgcatgagctgcaagtgtgtgc3360
tctcctgaicgc鄉tgagggggactcccagggcggccgccacgcccaccggatgaccccg3420cggt cctccc:ttgLgccccgccca3480
3540
cg agagggctg"gg叩cccagtc3G00
gaccctcccagggaggctgtt.cUgaacat3660
cccaaatgccaccggaaccccagcccttagcU:ccctccceiggcctctgtgggccctt.Kt3720
gtanaUat tggatggtcttgatcU.ggtt3780
ggtg卿C3Cggtgcgcgtgtggcctggcatg鄉ttUgtcggaacctcaggcctgtcca3840
gccctgggctctccatagcctttggg鄉gggagg"ggg柳ggccggtcaggggtctg3900
ggctgtggtgctctctcctcccgcctgccccagtgt.ccacggcttctggc3960
gcagatcatagCtt3Ctgtgcttctacceiactaggagggc4020
gtcctggtcctccagagggaggtggtUcaggggttggggatctgtgccggtggctctgg4080
tct.ctgctgggagccttcttggcggtg卿ggcatcacctttcctgactt.gctcccagcg4140
tgaaatgcacctgccaagaatggcageicatagggficcccgcctcctgggccttcacatgc4200
ccagtttlxttcggctctgtggcctgaagcggtctgtggaccttgg犯gtagggctccag4260
caccgactggcctcaggcctctgcctceittggtggtcgggtagcggccagt鄉gcgtgg 20
gagcctggccatccctgcctcctgg豐ggacg柳t.tggC3gC.tggtCCgtctgctcct4380
gccccactctcccccgcccctgccctceiccctacccttgccccacgcctgcctcatggct4440
ggttgctcttggagcctggtagtgtcactggctcagccttgctgggtateicacaggctct4500
gccacccactct.gctcc犯ggggcttgccctgccttgggccaagttctaggtctggccac4560
agcceiceig^icagctcagtcccctgtgtggtcatcct.ggcttctgctgggggcccacagcg4620
cccctggtgcccctcccctccceigggcccgggttgaggctgggccaggcccctctgggac4680
gggg￡lCttgtgccctgtcagggttCCCt3tccctg鄉tttagcagggca4740
tgccgctggctggccagggctgceigggeicactcccccttttgtccagggaataccacact4800
cgcccttctctccagcgaacaccacactcgcccttctctccaggggacgccscactcccc4860
cttctgtccaggggacgccacactcccccttctctccaggggacgccacactcgcccttc4920
tctccaggggacgccacactcgcccttctctccaggggacgccacactcccccttctgtc4980
caggggacgccacactcgcccttctctccaggggacgccacactggcccttctctccagg5040
ggacgccacactcccccttctgtcc鄉ggeicgccacHictcccccttctctccaggggac5100
gccacactcccccttctctccaggggacgccacactggcccttctctccaggggacgcca5160
cactcccccttctgtcceigggg￡lCgCC3C￡lctcgcccttctctccaggggacgccacact5220
cgcccttctctccaggggacgccacactcccccttctctccaggggacgcC3C￡LCtCCCC5280
cttctctccaggggacgccsicactcccccttctctccaggggacgccacactcccccttc5340
17image see original document page 18
權利要求
1. 人原癌基因c-Ha-ras，其序列如SEQ ID NO1所示。
2. 如權利要求l所述的人原癌基因c-Ha-ras，其含有4個編碼外顯子、 啟動子區域及多聚腺苷酸加尾信號序列polyA。
3. 如權利要求2所述的人原癌基因c-Ha-ras，其中所述的啟動子是齧 齒類絨毛蛋白啟動子或巨細胞病毒CMV的啟動子；所述的加尾序列是 SV40或BGH的polyA信號序列。
4. 含有如權利要求1所述的人原癌基因c-Ha-ras的宿主細胞。
5. 由如權利要求4所述的宿主細胞形成的組織，器官。
6. 如權利要求4或5所述的宿主細胞、組織或器官在致癌物篩選或評 價、抑癌物的篩選、藥物的安全性評價中的用途。
7. 如權利要求4或5所述的宿主細胞、組織或器官在毒理學中的用途。
8. 如權利要求4或5所述的宿主細胞、組織或器官在免疫毒理學中的 用途。
9. 製備基因組中含有如權利要求1所述的人原癌基因c-Ha-ras的齧齒 類受精卵的方法，步驟為(1) 分離獲得人原癌基因c-Ha-ras基因；(2) 通過超排卵、交配、受精卵篩選分離步驟獲得嚙齒類受精卵；(3) 通過顯微注射方法將c-Ha-ras基因注入受精卵中，獲得含有人 原癌基因c-Ha-ras的嚙齒類受精卵。
10. 製備基因組中含有如權利要求1所述的人原癌基因c-Ha-ras的齧 齒類轉基因動物的方法，步驟為(1) 製作輸精管結紮雄鼠，然後讓其與正常的發情期雌鼠交配，獲 得假孕鼠；(2) 將如權利要求9所述的受精卵直接移植或者在C02培養箱中過夜培養至2細胞時移植入假孕鼠的輸卵管內；(3) 讓假孕鼠生仔，待離乳後通過分子生物學方法檢測獲得轉基因 陽性子代，即首建鼠；(4) 在首建鼠性成熟後進行交配建系，獲得該轉基因動物系。
全文摘要
本發明提供了一種在基因組中整合有人原癌基因c-Ha-ras DNA的轉基因小鼠的製作方法。轉入DNA含有人c-Ha-ras基因的4個編碼外顯子、內含子及調控序列。調節序列優先選自c-Ha-ras基因本身的啟動子區域和polyA加尾信號序列。利用該方法製作的轉基因小鼠、子代、胚胎、器官和/或衍生的細胞可用於多種癌症的癌變機理研究、致癌物或抑癌物的篩選研究、藥物的臨床前安全性評價。
文檔編號C12N15/12GK101532018SQ20081010166
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月11日 優先權日2008年3月11日
發明者嶽秉飛, 琴 左, 波 李, 王軍志, 胡培麗, 範昌發 申請人:中國藥品生物製品檢定所