包含殼聚糖和植酸的緩釋殼聚糖膠囊的製作方法

2023-05-27 02:16:01 1

專利名稱：包含殼聚糖和植酸的緩釋殼聚糖膠囊的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種殼聚糖膠囊、製備該膠囊的方法以及包含該膠囊的藥物、食品和
化妝品組合物，在殼聚糖膠囊中，可溶活性成分被包封在包含殼聚糖和植酸的基質中。由 於本發明的殼聚糖膠囊通過作為生物可降解聚合物的殼聚糖與能夠快速並有效地與殼聚
糖聚合物形成交聯反應的植酸的離子凝膠化(ionic gelation)反應形成，所以能夠包封 90%或更多的可溶活性成分，並且通過防止活性成分在胃的酸性環境中受損並表現出長時 間適當地緩慢釋放活性成分的緩釋機制來提高活性成分的體內遞送效率。
背景技術：
為了可溶活性成分在體內有效的遞送、消化和吸收，需要能夠在具有低pH的高酸 性條件下的胃中保護被包封的可溶活性成分，並且能夠在腸道中緩慢釋放需要相對長保留 時間的內含物的控制系統。活性成分的包封對於獲得該控制系統十分關鍵。包封技術是這 樣的工藝，即，通過包封技術使固態、液態或氣態的可溶活性成分被另一材料或系統塗覆， 或者落入另一材料或系統中，使得可溶活性成分在特定環境下釋放。通常來講，將合成聚合 物或天然聚合物用作膠囊材料。 殼聚糖是一種由甲殼素脫乙醯產生的天然陽離子多糖，具有優異的可生物降解 性和生物相容性以及低毒性的特點[J. Microencapsulation 2000， 17，625 638]。由於 其多價陽離子，殼聚糖具有優良的成膠性和膜形成特性，並且能夠易於與陰離子材料結合 [J. Chem. Technol. Biotechnol. 1990， 49， 395 404]，並且殼聚糖表現出對黏膜組織(例 如腸道)的優異的黏膜粘附性(mucoadhesiveness) [J. Pharm. Sci. 2003,92,567 576]。 因此，已經進行了許多關於藥物或功能材料通過使用殼聚糖的包封的體內遞送有效性的研 允。 乳化交聯法[Int. J. Pharm. 1994， 11,217 222]、乳滴聚結法[Pharm. Res. 1999， 16， 1830 1835]、反向膠束方法[J. ControlledRelease 2001， 17， 317 323]、噴霧乾燥法 {Int. J. Pharm. ， 1994,217 222] 、0/W/0多重乳化方法[第10-2005-0014831號韓國專利 申請]等已被廣泛用於使用殼聚糖來製備膠囊。 由於殼聚糖本身不能被製成膠囊，所以已經開發出離子凝膠化方法以通過多價陽 離子殼聚糖和作為交聯劑的陰性反離子之間的快速交聯反應來在短時間內形成膠囊。離子 凝膠化可以通過交聯反應而在聚合物的表面上形成可溶的膜，並且通過相分離來完成包封 工藝。如上製備的膠囊由包含合成或天然的聚合物組成，並且提供釋放可控的內含物。內含 物的釋放速率由膠囊膜的化學結構、厚度和尺寸、組成膠囊的成分的濃度、內含物的濃度、 交聯劑的濃度、介質pH等控制[Int. J. Pharm. 2004,274， 1 33 ;J. Controlled Release, 2004， 150， 5 28]。 已使用戊二醛和硫酸作為為殼聚糖的離子凝膠化而加入的交聯劑 [J. Microencapsulation 1998，15，373 382 ;J. Microencapsulation 2002，19，173 180 ;第10-1998-0056584號和第10-2003-0085599號韓國專利申請]。然而，由於戊二醛
4和硫酸的毒性，所以不能將它們直接應用到食品，它們僅有限地使用在藥物領域中。
最近，已經開發出通過使用用於體內藥物遞送的低毒性交聯劑來製備殼聚糖膠 囊的技術。Moliaro等[Biomaterials 2002,23,2717 2722]和EveRuel-Gari印y等 [European J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2004， 57， 53 63]已經開發出通 過加入能夠向殼聚糖溶液提供反離子的磷酸甘油而能夠通過熱處理形成殼聚糖凝膠的藥 物遞送系統。另外，有多種用於殼聚糖的交聯劑，例如海藻酸[第6，365，1S7 B2號美國 專利；第6，534，091 Bl號美國專利]以及例如羧甲基纖維素鈉和黃原膠的聚合物[第 2006-0016164號韓國專利公開，第2001-0025930號韓國專利公開]。具體來講，存在通過使 用三聚磷酸鹽(TPP)作為交聯劑來製備殼聚糖膠囊的總體趨勢[Int. J. Pharm. 2002,249， 165 174 ;J. Pharm. Sci. 2002,91， 1396 1404 ;Int. J. Pharm. 2003,250,215 226 ;Int. J. Pharm. 2006,311， 187 195]。然而，這些方法存在包封產量低、製造工藝複雜、藥物在胃 中過度釋放和降解、藥物釋放的過度抑制等問題。因而，儘管將殼聚糖用於可溶活性成分的 包封具有許多上述優點，但是其商業化和應用受到限制。因此，需要使用新型交聯劑來製備 殼聚糖膠囊，以獲得高包封產量，並且使之在胃中的高酸性環境下受到保護，同時在腸中逐 漸釋放活性成分。

發明內容
技術問題 本發明旨在解決現有技術中的上述問題。本發明的目的在於通過使用殼聚糖和作 為交聯劑的毒性低的多價陰離子植酸來構建快速且有效的交聯繫統來提供一種緩釋殼聚 糖膠囊，從而殼聚糖膠囊包封率高、防止可溶活性成分受損、在胃中呈現出高穩定性，並且 在腸中緩慢釋放被包封的可溶活性成分。 本發明的另一目的在於提供一種通過使用植酸來使生物相容性陽離子聚合物交 聯的方法，以及通過使用上述方法製備緩釋殼聚糖膠囊的方法。 本發明的又一目的在於提供包含緩釋殼聚糖膠囊的藥物組合物、食品組合物和化
妝品組合物。 技術方案 本發明提供一種殼聚糖膠囊，其中，可溶活性成分被包封在包含殼聚糖和植酸的 基質中。 本發明還提供一種通過使用植酸而將生物相容性聚合物交聯的方法。 此外，本發明提供一種製備殼聚糖膠囊的方法，所述方法包括以下步驟第一步，
製備包含殼聚糖和可溶活性成分的水溶液；第二步，製備包含植酸的水溶液；第三步，使在
第一步中製備的水溶液與在第二步中製備的水溶液接觸，以執行離子凝膠化。 另外，本發明提供包含殼聚糖膠囊的藥物組合物、食品組合物和化妝品組合物。 有益效果 根據本發明製備的殼聚糖膠囊顯示出可溶活性成分的高包封率，並保護可溶活性 成分免於被損壞，由此提高生理活性物質的體內遞送效率。此外，殼聚糖膠囊在胃中的酸性 條件下保持被包封的可溶活性成分的高穩定性，並在腸內的中性條件下展現出緩釋作用。 因此，能夠在消化器官處通過緩釋來顯著提高被包封的可溶活性成分的體內生物利用率，並能夠有效地將殼聚糖膠囊應用於包括醫藥製劑、食品或化妝品的各個工業領域。


圖1是示出根據本發明實施例製備殼聚糖膠囊的工藝的示圖。 圖2是示出牛血清白蛋白包封率與根據示例1製備的殼聚糖-植酸膠囊中的植酸
的濃度和PH的關係圖。 圖3是示出當用人工胃液處理根據示例1製備的殼聚糖-植酸膠囊時牛血清白蛋 白的釋放量與植酸的濃度和PH的關係圖。 圖4是示出牛血清白蛋白包封率與根據對比例1製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊 中的三聚磷酸鹽的濃度和pH的關係圖。 圖5是示出當用人工胃液處理根據對比例1製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊時牛 血清白蛋白的釋放量與三聚磷酸鹽的濃度和PH的關係圖。 圖6是示出當用人工胃液和腸液處理根據示例2製備的殼聚糖-植酸膠囊和根據 對比例1製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊時牛血清白蛋白的累積釋放量與時間的關係圖。
圖7是根據製備示例2製備的膠囊的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。
圖8是根據對比例1製備的膠囊的SEM照片。
圖9是將圖7的照片放大十倍時的SEM照片。
圖10是將圖8的照片放大十倍時的SEM照片。 圖11是示出胰島素的包封率與根據示例3製備的殼聚糖-植酸膠囊中的胰島素 溶液的濃度的關係圖表。 圖12是示出殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的胰島素包封率與根據對比例2製備的殼 聚糖-三聚磷酸鹽膠囊中的三聚磷酸鹽的濃度和PH的關係圖表。 圖13是示出當用人工胃液處理根據示例4製備的殼聚糖-植酸膠囊時胰島素的 釋放量與植酸的濃度和pH的關係圖。 圖14是示出當用人工胃液處理根據對比例2製備的殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊時 胰島素的釋放量與三聚磷酸鹽的濃度和PH的關係圖。 圖15是示出當用人工胃液和腸液處理根據示例4通過使用分別具有pHl、 pH 2、 pH 4和pH 6的6%的植酸溶液製備的四種殼聚糖-植酸膠囊時胰島素的釋放量與24小時 的時間的關係圖。 圖16是示出當用人工胃液和腸液處理根據對比例2通過使用分別具有pH 3、 pH 5和pH 7的6%的三聚磷酸鹽溶液製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊時胰島素的釋放量與時 間的關係圖。 圖17是示出當用人工胃液和腸液處理根據本發明通過使用分別具有pHl和pH 6
的6X的植酸溶液製備的兩種殼聚糖-植酸膠囊和通過使用具有pH 7的6%的三聚磷酸鹽
溶液製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊時胰島素的釋放量與時間的關係圖。 圖18是示出當將根據本發明通過使用分別具有pH 1和pH 6的6%的植酸溶液
製備的兩種殼聚糖-植酸膠囊和通過使用具有pH 7的6%的三聚磷酸鹽溶液製備的殼聚
糖-三聚磷酸鹽膠囊分別口服給糖尿病小鼠時測量的血糖水平的曲線圖。 圖19是用數字示出圖18的結果的圖表。
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圖20是示出在將通過使用具有pH 1的6%的植酸溶液製備的殼聚糖_胰島素膠囊口服給糖尿病小鼠之後的4個小時內殼聚糖-胰島素膠囊的降糖作用與其劑量的關係曲線圖。 圖21是示出當將通過使用具有pH 1的6%的植酸溶液製備的殼聚糖_胰島素膠囊口服給糖尿病小鼠之後的3小時內殼聚糖-胰島素膠囊的降糖作用與其劑量的關係圖。
圖22是示出當將通過使用具有pH 1的6%的植酸溶液製備的殼聚糖_胰島素膠囊口服給糖尿病小鼠之後的24小時內殼聚糖-胰島素膠囊的降糖作用與其劑量的關係曲線圖。 圖23是示出當植酸溶液的濃度為6%時殼聚糖_植酸膠囊的生長激素包封率與植酸溶液的酸度的關係圖。 圖24是示出在植酸的濃度為6%的情況下在用人工胃液處理殼聚糖_植酸膠囊之後的2個小時內殼聚糖-植酸膠囊中的生長激素的殘留量與植酸溶液的酸度的關係圖。
圖25是示出當用人工胃液和腸液處理在植酸溶液的可變pH條件下通過使用6%的植酸溶液製備的殼聚糖_植酸膠囊之後的24個小時內生長激素的釋放量與植酸溶液的酸度的關係圖。 圖26是示出當用人工胃液和腸液處理在植酸溶液的可變pH條件下通過使用6%的植酸溶液製備的殼聚糖_植酸膠囊時生長激素的釋放量與植酸溶液的酸度隨時間的關係圖。
具體實施例方式
本發明涉及一種包含可溶活性成分的殼聚糖膠囊，所述可溶活性成分被包封在含有殼聚糖和植酸的基質中。本發明的殼聚糖膠囊的特徵在於，它顯示出對可溶活性成分的高包封率，通過防止活性成分免於被損壞並展現出其依賴pH的緩釋作用來提高活性成分的體內遞送效率。 在下文中，將詳細描述根據本發明的殼聚糖膠囊。 對於將要包封在包封基質中的可溶活性成分的種類沒有限制。本發明的可溶活性成分可以包括能夠溶於水的所有種類的物質，而不考慮其功能和分子結構，優選地，可以將藥物活性成分、食品活性成分和化妝品活性成分中的一種或多種作為例子對本發明的可溶活性成分進行說明。因為包含在基質中的殼聚糖和植酸顯示出高生物穩定性，所以殼聚糖膠囊通過防止活性成分免於被損壞來提高活性成分的體內遞送效率。另外，殼聚糖膠囊顯示出依賴pH的緩釋作用，由此將包封的活性成分遞送並釋放到腸，同時穩定地將其保持在胃中。因此，殼聚糖膠囊能夠使活性成分的體內吸收最大化。本發明的殼聚糖膠囊能夠有效地應用於食品、醫藥製劑、化妝品等，從而展現出顯著改善的功效。此外，對於所使用的活性成分的種類沒有限制，可以不受限制地使用在食品、醫藥和化妝品領域中傳統上使用的所有種類的活性成分。這些活性成分的示例可以包括核酸、胺基酸、肽、蛋白質、糖、碳水化合物、類脂、糖脂、植物源化合物、動物源化合物或微生物源化合物、植物提取物、合成化合物、維生素、微生物、病毒、它們的混合物等等，但不限於此。肽或蛋白質的示例可以包括血清蛋白、人類生長激素、幹擾素、集落剌激因子、白細胞介素、巨噬細胞活化因子、B細胞因子、T細胞因子、蛋白質A、過敏抑制因子、細胞壞死糖蛋白、抗毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉化生長因子、a-l抗胰蛋白酶、白蛋白、阿樸脂蛋白-E、紅細胞生成 素、因子VII、因子VIII、因子IX、血纖維蛋白溶酶原活化因子、尿激酶、鏈激酶、蛋白質C、 c-反應蛋白、超氧化物歧化酶、血小板源生長因子、上表皮生長因子、骨生成促進蛋白質、胰 島素、心鈉素、軟骨誘導劑、結締組織活化因子、促卵泡激素、促黃體激素、神經生長因子、松 弛素、生長調節素、胰島素樣生長因子、縮膽囊素、單克隆或多克隆病毒抗體、單克隆或多克 隆細菌抗體、單克隆或多克隆毒素抗體和病毒源疫苗抗原。上面列出的肽或蛋白質可以包 括天然存在的產品、人工合成的產品和重組工程化的產品。此外，除了上面列出的肽或蛋白 質之外，通過各種方法(例如，胺基酸或結構域的加成、取代或消去或者糖基化)改性的其 類似物或突變異種也包括在本發明內。作為可溶活性成分，維生素的示例可以包括水溶性 維生素，例如維生素B及其衍生物和維生素C及其衍生物；那些植物提取物可以包括野生人 參、人參或紅參的皂角苷、異黃酮、類黃酮、白藜蘆醇等等；那些微生物源化合物可以包括曲 酸及其衍生物、多聚穀氨酸、果聚糖等等；那些微生物可以包括乳酸菌等等。
對於在本發明中使用的殼聚糖的種類沒有限制，但是優選使用包含D-氨基葡萄 糖的線性多糖作為脫乙醯單元，並使用N-乙醯基-D-氨基葡萄糖作為乙醯化單元。這樣的 殼聚糖的示例可以包括聚[e-(l-4)-2-氨基-2-氧-D-妣喃葡萄糖]及其衍生物。殼聚糖 衍生物的示例可以包括硫代殼聚糖、三甲基化殼聚糖、羧甲基殼聚糖、N_(2-羥丙基-3-三 甲基銨)殼聚糖氯化物等。優選地，適合於本發明的殼聚糖的平均分子量範圍可以為從 30， 000到1， 000， 000道爾頓，更優選地為80， 000至300， 000道爾頓。在使用平均分子量小 於30， 000道爾頓的殼聚糖的情況下，由於殼聚糖溶液的粘性太低，所以理解到包封產率降 低。另一方面，當殼聚糖的平均分子量超過1， 000， 000道爾頓時，殼聚糖溶液展現出過高的 粘性，這會給繼續進行包封帶來困難。 根據本發明的殼聚糖膠囊的基質包括除了殼聚糖以外的植酸，其作用是作為殼聚 糖交聯的交聯劑。植酸包含在所有種類的植物(具體為種子和穀類)中，植酸具有通過與鹼 結合形成中性鹽的性質。還稱作肌醇六磷酸的植酸由通過酯鍵結合到肌醇環的六分子磷酸 鹽的組成，其中，磷酸鹽對稱地結合到肌醇環上，如式1所示。將植酸的結構與式2表示的 已經廣泛地用作生物相容性聚合物(例如殼聚糖)的交聯劑的三聚磷酸鹽的結構相比，已
經發現，植酸中的能夠與殼聚糖的陽離子反應的陰離子是三聚磷酸鹽中的兩倍或更多倍。
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formula see original document page 9 因為本發明的殼聚糖膠囊使用植酸(植酸作為生物活性成分是安全的)，並包含 能夠與殼聚糖反應的許多陰離子，所以能夠顯示出與殼聚糖的改善的反應性，並提供體內 穩定性。根據殼聚糖與植酸的剛性結合，本發明的殼聚糖膠囊具有孔較少的穩固結構。殼聚 糖膠囊的這種結構不僅能夠提高活性成分的包封率，而且能夠防止消化酶(其能夠降解消 化道黏膜和/或分布於其上部的粘液層中的生理活性物質)接近活性成分，由此能夠防止 活性成分被消化液損壞。具體地說，當要遞送的活性成分是蛋白質時，本發明的殼聚糖膠囊 防止蛋白質與存在於消化道中的蛋白酶接觸，由此保護活性成分。如上所述，本發明的膠囊 提高了活性成分的包封率，並防止活性成分被損壞，進而提高了活性成分的體內遞送效率。 此外，本發明的殼聚糖膠囊具有依賴pH的緩釋特性。具體地說，因為本發明的殼 聚糖膠囊在酸性條件下非常穩定，所以當口服時，它在低PH條件下(例如在胃中)不釋放
被包封的可溶活性成分，但是在中性條件下(例如在小腸內)逐漸釋放被包封的可溶活性 成分。 另外，本發明提供了一種通過使用植酸來使生物相容性聚合物交聯的方法。生物 相容性聚合物優選是陽離子聚合物，在本發明中將用作生物相容性聚合物的殼聚糖作為例 子進行說明。 如上所述，植酸的陰離子是通常用作傳統的生物相容性陽離子聚合物的交聯劑的 三聚磷酸鹽的兩倍或更多倍。因此，植酸能夠有效地用在與陽性反離子的交聯反應(例如， 離子凝膠反應等)中。當通過使用生物相容性聚合物(例如，殼聚糖)來製備膠囊時，通常 採用這種離子凝膠反應，這種離子凝膠反應是一種通過陽離子生物相容性聚合物與具有與 其相反的離子的交聯劑的快速反應在短時間內形成膠囊的方法。過去，植酸被認為是與各
formula see original document page 9種有用礦物螯合的抗營養成分，進而抑制有用礦物的吸收和使用。近來，植酸的這種螯合效 應已經用於中和、解毒或釋放有害物質、輻射汙染物或致癌物質。然而，沒有在諸如離子凝 膠反應的交聯反應中使用植酸的嘗試。本發明使用植酸作為用於陽離子生物相容性聚合物 (例如，殼聚糖)的交聯劑，當將這種用途應用於根據本發明的製備殼聚糖膠囊的以下方法 時，能夠比現有技術更快速地且穩定地形成膠囊。 此外，本發明提供了一種製備殼聚糖膠囊的方法，所述方法包括第一步驟，製備 包含殼聚糖和可溶活性成分的水溶液；第二步驟，製備包含植酸的水溶液；第三步驟，將在 第一步驟中製備的水溶液與在第二步驟中製備的水溶液相接觸，以執行殼聚糖與植酸的離 子凝膠反應。 在下文中，將更詳細地描述根據本發明的製備殼聚糖膠囊的方法的每個步驟。 在根據本發明的製備殼聚糖膠囊的方法中，第一步驟優選包括 (a)通過將殼聚糖添加到水溶液中來製備殼聚糖水溶液； (b)製備可溶活性成分水溶液； (c)將殼聚糖水溶液與可溶活性成分水溶液混合。 在步驟(a)中，殼聚糖水溶液優選包含弱酸。這時，優選的是，包含濃度範圍為 0.01% (w/v)至20% (w/v)、更優選為1% (w/v)至3% (w/v)的弱酸，但不限於此。如果殼 聚糖水溶液中的弱酸的濃度低於0.01% (w/v)，則難以溶解足夠量的殼聚糖。另一方面，如 果其超過20% (w/v)，則殼聚糖水溶液的酸性變得太高，這對將要包封的活性成分產生壞 影響。對於弱酸的種類沒有限制，可以使用諸如醋酸、乳酸、檸檬酸、蟻酸、乳酸、抗壞血酸、 草酸等的有機酸和諸如稀鹽酸、稀硫酸等的無機酸。在本發明中，更優選的是使用醋酸。在 這種情況下，優選的是製備具有pH 6或以下的醋酸溶液。 此外，步驟(a)的殼聚糖水溶液優選包含濃度範圍為0. 01% -50% (w/v)、更優選 為1%-5% (w/v)的殼聚糖。如果殼聚糖水溶液中的殼聚糖的濃度低於0.01% (w/v)，則 殼聚糖水溶液的粘性太低，並且殼聚糖的量太小以至於不能形成膠囊，因此難以製成膠囊。 相反，如果其超過50% (w/v)，則由於殼聚糖水溶液的粘性太高，所以難以執行包封工藝。
步驟(b)的可溶活性成分水溶液可以如下製備將活性成分溶於諸如蒸餾水之類 的水相中；如果需要，通過將所得的溶液靜置來去除氣泡。在可溶活性成分水溶液中，可溶 活性成分的含量優選為0.01% (w/v)或更多，更優選為1% (w/v)或更多。如果可溶活性 成分水溶液中的可溶活性成分的濃度在0. 01% (w/v)以下，則將要體內遞送的活性成分的 量太低，因而即便包封的活性成分被吸收，被包封的活性成分仍可能不能發揮其期望的功 能。然而，以上描述僅僅是本發明的示例，並根據在本發明中使用的活性成分的種類和膠囊 的用途，可以修改活性成分的含量。因此，對於活性成分的含量的上限沒有限制，但是優選 的是使用溶液飽含活性成分的飽和溶液。例如，活性成分水溶液可以包含3% -40% (w/v) 的可溶活性成分。 通過傳統的混合方法執行步驟(c)中的殼聚糖水溶液與可溶活性成分水溶液的 混合。即，將可溶活性成分水溶液添加到殼聚糖水溶液中，然後通過攪拌器來分散可溶活性 成分。然後，如果需要，將所得的溶液靜置片刻，以去除氣泡。 在根據本發明製備殼聚糖膠囊的方法中，第二步驟是製備含植酸的水溶液。
第二步驟的植酸水溶液優選具有pH 0. 5至pH 7，更優選具有pH 1至pH6，最優選具有pH 1至pH 2。如果植酸水溶液的pH在0. 5以下，則其酸性太強，從而對包封的活性成 分產生壞影響。另一方面，如果其pH超過7，則存在降低包封產率的問題。
此外，對於第二步驟的植酸水溶液中的植酸的含量沒有限制，但優選的是O. 1% (w/v)或更高，更有選的是2% (w/v)或更高。這時，對於植酸的含量的上限沒有限制，但優 選的是使用水溶液飽含植酸的飽和溶液。更優選地，植酸水溶液中的植酸的含量為8% (w/ v)或以下。如果植酸水溶液中的植酸的含量低於0_1% (w/v)，則交聯劑太少，膠囊的包封 率和在胃液中的穩定性出現降低。如果與植酸的飽和狀態相比過量地添加植酸，則植酸溶 液的酸性太高，從而對將要包封的活性成分產生壞影響。 對於控制植酸水溶液的濃度和pH的方法沒有限制，其可以通過在本領域中公知 的傳統方法來實現。例如，將植酸溶液添加到蒸餾水，並攪拌，以調節植酸對水的濃度，然後 通過使用諸如5N氫氧化鈉溶液之類的鹼來調整其pH。 在根據本發明製備殼聚糖膠囊的方法中，第三步驟是通過將在第一步驟中製備的 水溶液與在第二步驟中製備的水溶液相接觸來執行殼聚糖和植酸之間的離子凝膠反應的 步驟。這時，對於水溶液之間的接觸方法沒有限制，其可以通過在本領域中公知的傳統方法 來實現。接觸方法的示例可以包括在攪拌下將在第一步驟中製備的水溶液與在第二步驟 中製備的水溶液混合的方法；將在第二步驟中製備的水溶液滴到在第一步驟中製備的水溶 液的方法；將在第一步驟中製備的水溶液滴到在第二步驟中製備的水溶液的方法。就諸如 反應時間之類的效率而言，優選的是將在第一步驟中製備的水溶液滴到在第二步驟中製備 的水溶液。上述的滴水溶液的方法如下執行通過諸如壓力輸送泵、離心泵、級聯泵、水力隔 膜泵、螺旋泵等的計量泵來遞送特定量的待滴水溶液；通過諸如注射器、空氣噴嘴、壓力噴 嘴、超聲波噴嘴、旋轉噴霧器等的裝置以滴的方式添加遞送的水溶液。對於凝膠反應沒有限 制，但優選的是，以0°C -S(TC的溫度範圍執行凝膠反應達10秒至60分鐘，更優選的是，以 2°C _401:的溫度範圍執行凝膠反應達1分鐘至30分鐘。 根據本發明的製備殼聚糖膠囊的方法還可以選自於由以下步驟組成的組中的至 少一個步驟將第三步中製備的殼聚糖膠囊分離，洗滌殼聚糖膠囊和乾燥殼聚糖膠囊。
可以使用現有技術中的傳統方法(例如過濾等)來執行殼聚糖膠囊的分離，可以 使用蒸餾水等來執行殼聚糖膠囊的洗滌，並且同樣可以使用傳統的乾燥方法(優選為冷凍 乾燥)來執行殼聚糖膠囊的乾燥。 在實施例中，本發明的殼聚糖膠囊可以按照如下製備。將用作膠囊的主要成分的 殼聚糖溶解在1%的醋酸水溶液中，以製備殼聚糖溶液。將可溶活性成分溶解在水溶液(例 如蒸餾水)中，以製備可溶活性成分水溶液。將製備的兩種水溶液混合併攪拌，以製備殼聚 糖_可溶活性成分溶液，之後將該殼聚糖_可溶活性成分溶液逐滴加入植酸水溶液中，以制 備膠囊。此時，通過在落入交聯劑溶液中的殼聚糖-可溶活性成分溶液液滴的表面上形成 膜，同時使殼聚糖的多價陽離子結合到植酸的多價陰離子來使膠囊成型。此外，植酸顆粒具 有滲入膠囊的高擴散性，並結合膠囊內部和膠囊表面的殼聚糖分子，致使形成非常堅硬、穩 定和不溶解的膠囊。使製備的膠囊從水溶液中分離，並且通過冷凍乾燥等方法將其洗滌並 乾燥，從而獲得球形膠囊。上述方法的每個步驟將在圖1中示出。 在本發明的方法中，優選使用這樣的方法，即，將殼聚糖和可溶活性成分的混合溶 液以滴加的方式加入植酸水溶液中，但是同樣可以使用這樣的方法，即，將可溶活性成分與作為交聯劑的植酸水溶液混合，然後將所得的溶液以滴加的方式加入到殼聚糖水溶液中。 然而，在後一種情形中，由於殼聚糖的分子量通常大於植酸的分子量，並且殼聚糖擴散進入 植酸和可溶活性成分的混合物中，所以需要長時間來執行殼聚糖與植酸的交聯反應。因而， 問題在於，與將第一步製備的水溶液以滴加的方式加入到在第二步製備的水溶液中的方法 相比包封產量低。 此外，本發明涉及包含本發明的殼聚糖膠囊和藥物可接受載體的藥物組合物。
此時，對於使用的載體的種類沒有限制，並且能夠非限制地使用在藥物領域傳統 使用的載體和媒介。載體的示例可以包括離子交換樹脂、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋 白(例如，人血清白蛋白)、緩衝材料(例如多種磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和蔬 菜脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、鹽或電解質(例如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸 氫鉀、氯化鈉和鋅鹽)、膠原矽石、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基板、聚乙二醇、羧甲 基纖維素鈉，多芳基化合物(polyarylate)、蠟、聚乙二醇、羊毛脂等，但不局限於此。本發明 的藥物組合物還可以包括潤滑劑、保溼劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑，以及上述成分以外的成 分。可以使用本發明的殼聚糖膠囊和藥物可接受的載體通過現有技術中已知的傳統方法來 製備本發明的藥物組合物，並且對方法沒有限制。 此外，本發明提供一種包含本發明的殼聚糖膠囊和食品添加劑的食品組合物。
本發明的食品組合物可以包括功能食品(例如健康補充食品和健康食品)，並且 還包括食品添加劑(例如可發揮效力(sitologically)的載體、賦形劑和/或稀釋劑)。 上述載體、賦形劑和/或稀釋劑的示例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖 醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖 維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸 鎂、礦物油等，但並不局限於此。可以使用本發明的殼聚糖膠囊和食品添加劑通過現有技術 中已知的傳統方法來製備本發明的食品組合物。 本發明提供了一種包含本發明的殼聚糖膠囊和化妝品添加劑的化妝品組合物。
化妝品添加劑的示例可以包括乳化劑、增稠劑(例如金屬矽酸鹽、黃原膠、纖維素 和卡波姆)、水相物(例如蒸餾水、丙二醇、l，3-丁二醇、甘油、甜菜鹼或山梨醇)、防腐劑、香 料和染料，但並不局限於此。可以使用本發明的殼聚糖膠囊和化妝品添加劑通過現有技術 中已知的傳統方法來製備本發明的化妝品組合物。
實施例 在下文中，現在將參照下面的示例來詳細描述本發明。示例僅出於舉例說明的目
的，並且本發明並不局限於此。 製備例1 :殼聚糖溶液的製備 將殼聚糖加入到具有1 % (v/v)酸度的醋酸溶液中，使其終濃度變為3% (w/v)， 並且使用磁力攪拌器以300rpm攪拌該混合物10分鐘，從而獲得殼聚糖溶液。此時，用作生 物可降解聚合物的殼聚糖的平均分子量為85， 000道爾頓，並且當所述殼聚糖溶解在0. 5% (w/v)的醋酸溶液中而使其濃度變為0.5% (w/v)時，表現出大約5.6cps的粘度和大約 98%的脫乙醯率。 製備例2 :牛血清白蛋白_殼聚糖水溶液的製備 將用作可溶活性成分的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)溶解在去離子水中，以獲得15% (w/v)的濃度。將該水溶液加入到製備例1中製備的殼聚糖水溶液中，使用磁力攪 拌器以500rpm攪拌10分鐘以使牛血清白蛋白分散，然後將牛血清白蛋白靜置一會兒以去 除殼聚糖溶液中的氣泡，從而獲得牛血清白蛋白_殼聚糖水溶液。
示例1 :包含牛血清白蛋白的殼聚糖_植酸膠囊的製備 將植酸水溶液的溶度分別調整至3%、4%和5%，並且有差別地調整每種水溶液 的pH為1、2、4和6，從而製備膠囊。具體來講，向蒸餾水中加入植酸溶液，並進行攪拌以調 節植酸在水中的濃度，然後使用5. ON的氫氧化鈉溶液調節其pH。利用計量泵將在製備例 2中製備的牛血清白蛋白-殼聚糖水溶液逐滴加入到所得的溶液中，並且使所得的混合物 反應30分鐘以引發殼聚糖和植酸之間的鍵合，從而製備膠囊。將所製備的膠囊與混合物分 離，用蒸餾水洗滌兩次或三次，然後通過凍幹法乾燥。此時，在_401:執行4小時初始的冷凍 工藝，然後使膠囊在-3(TC乾燥3小時，在-l(TC乾燥2小時，在Ot:乾燥1小時，在2(TC幹 燥2小時，並在3(TC乾燥5小時。 實驗例1 :殼聚糖-植酸膠囊的牛血清白蛋白包封率 為了測定植酸的濃度和pH對包封程度的影響，對示例1中製備的每種膠囊的牛血 清白蛋白包封率進行計算。通過Bradford法對膠囊形成之後留在植酸溶液中的未包封白 蛋白的量進行測定，並且使用該數據對膠囊的牛血清白蛋白包封率進行計算。該結果在圖2 中示出。如圖2所示，當植酸溶液具有pH 1和pH 2時，無論植酸的濃度如何，膠囊表現出 100X的包封率，在pH 4和pH 6的情況，取決於植酸的濃度，膠囊表現出60%至80%的包 封率。 實驗例2 :包含牛血清白蛋白的殼聚糖-植酸膠囊在人工胃液中的穩定性
將示例1中製備的每種膠囊放到pH 1. 2的人工胃液(HC1濃度為0. 7% (v/v)且 NaCl濃度為0. 2% (w/v)的水溶液)中，並且在37°C的培養振蕩器中以100rpm振蕩2小 時。此後，通過Bradford法對釋放到人工胃液中的牛血清白蛋白的量進行測定。使用用人 工胃液處理2小時之後的數據對釋放到人工胃液的牛血清白蛋白的量進行計算，結果在圖 3中示出。如圖3所示，當植酸溶液具有pH l或pH 2時，在2小時之後牛血清白蛋白的量 (0-30%)最低，並且植酸的濃度越高，牛血清白蛋白的釋放量越低。通過這些結果證實，使 用具有高酸度(PH 1-2)且濃度高(5% )的植酸的植酸溶液製備的殼聚糖-植酸膠囊在酸 性環境下(例如胃液)更穩定。 示例2 :包含牛血清白蛋白的殼聚糖_植酸膠囊的製備 將通過與製備例1中描述的方法相同的方法製備的殼聚糖溶液和通過與製備例2 中描述的方法相同的方法製備的牛血清白蛋白溶液按照重量比9 : l混合，並且使用攪拌 器將所得的混合物以100rpm攪拌10分鐘，從而製備包含牛血清白蛋白的殼聚糖溶液。將 58% (w/w)植酸溶液加入到蒸餾水中，使得植酸的終濃度為5% (w/V)，並且使用5N NaOH 溶液將其pH調整為pHl，從而製備植酸溶液。將製備的牛血清白蛋白_殼聚糖溶液通過壓 力輸送泵裝置遞送到注射器，並且將該溶液以滴加的方式加入到製備的植酸溶液，從而通 過殼聚糖和植酸之間的結合形成球形的膠囊。通過過濾將膠囊與剩餘的植酸溶液分離。用 蒸餾水洗滌分離的膠囊，以去除殘留在其表面的植酸，並且將膠囊進行冷凍乾燥，從而形成 根據本發明的膠囊。 對比例1 :包含牛血清白蛋白的殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊的製備
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在通過使用三聚磷酸鹽(被廣泛地用作製備殼聚糖膠囊的交聯劑)製備殼聚糖膠 囊之後，對可溶活性成分的包封率及其在胃液中的穩定性進行測定，並且與根據本發明制 備的殼聚糖_植酸膠囊的包封率和穩定性進行比較。首先，使用與示例2描述的方法相同 的方法來製備牛血清白蛋白-殼聚糖溶液。為了選擇適合製備膠囊的三聚磷酸鹽的濃度和 pH，將三聚磷酸鹽水溶液的濃度調整為2X (w/v)、4% (w/v)和6% (w/v)，並且將每種水溶 液調整為pH 3、pH 5和pH 7。使用與示例2描述的方法相同的方法來製備殼聚糖-三聚 磷酸鹽膠囊。
比較實驗例1 :殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊的牛血清白蛋白包封率 用與在實驗例1中描述的方法相同的方法測定在對比例中製備的殼聚糖-三聚磷
酸鹽膠囊的牛血清白蛋白包封率，結果在圖4中示出。如圖4所示，當殼聚糖-三聚磷酸鹽
膠囊的pH為7且三聚磷酸鹽濃度為4% (w/v)和6% (w/v)時，對比例1中的殼聚糖_三
聚磷酸鹽膠囊表現出最高的包封率，但是僅為85%，低於根據本發明的示例的包封率。 比較實驗例2 :包含牛血清白蛋白的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊在人工胃液中的穩
定性 通過與在實驗例2中描述的方法相同的方法測定在對比例1中製備的殼聚糖-三 聚磷酸鹽膠囊在人工胃液中的穩定性，結果在圖5中示出。如圖5所示，在對比例中製備的 殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊中，其在人工胃液中最穩定的pH為pH7。此外，即使三聚磷酸鹽的 濃度是6 % (w/v)，也會有55 %或更多的牛血清白蛋白釋放到人工胃液中，僅有45 %或更少 的牛血清白蛋白留在膠囊中。因此證實，殼聚糖和三聚磷酸鹽之間的結合親和力比殼聚糖 和植酸之間的結合親和力弱，並且這樣的結合容易在胃液的強酸性條件下破壞，從而使膠 囊對包封的可溶活性成分的保護效果劣化。 實驗例3 :對殼聚糖-植酸膠囊和殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的牛血清白蛋白在腸 中的緩釋的測定 在包封的可溶活性成分通過腸壁吸收的情況下，如果膠囊的外壁在腸中沒有破 裂，則包封在膠囊內部的可溶活性成分的生物利用率就會被劣化。因而，為了檢測製備的膠 囊的生物利用率，製備人工胃液(pH 1. 2)和人工腸液(0. 2M含25X (v/v) KH2P04和0. 2N含 11.8% (v/v)NaOH的水溶液，pH 6. 8)。然後，測定在根據本發明示例2中製備的殼聚糖-植 酸膠囊的牛血清白蛋白的釋放量，以及在對比例1中通過使用pH 7且三聚磷酸鹽濃度為 6% (w/v)的溶液而製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的牛血清白蛋白的釋放量。結果，根據 本發明製備的殼聚糖-植酸膠囊表現出對可溶活性成分100%的包封率。當將膠囊放在與 實驗例2的人工胃液相同的人工胃液中且在37t:的培養振蕩器中以100rpm振蕩2小時時， 其顯示20%或低於20%的量的被包封的可溶活性成分被釋放。另一方面，在相同的條件 下，殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊顯示50%或更高的量的牛血清白蛋白被釋放。當將在人工胃 液中振蕩的膠囊放入人工腸液中並在37t:以100rpm振蕩時，如圖6所示，從殼聚糖-植酸 膠囊釋放的可溶活性成分的累積的量在4小時後為10%，在10小時後為40%，這意味著可 溶活性成分被逐漸釋放。然而，在殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的情況下，顯示在4小時內牛血 清白蛋白的累積釋放量為100%。從這些結果可以看出，根據本發明製備的膠囊表現出依賴 於PH的緩釋特性。從這些結果可以預計，80 %或更多的包封的可溶活性成分從殼聚糖_植 酸膠囊釋放，並在腸內被吸收；而50%或低於50%的包封的可溶活性成分從殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊釋放，並在腸內被吸收。 實驗例4 :殼聚糖_植酸膠囊和殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊的照片分析
使用電子顯微鏡對示例2中製備的殼聚糖-植酸膠囊的表面和對比例1中使用pH 為7且三聚磷酸鹽濃度為6% (w/v)製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的表面進行照相，這些 表面示出在圖7和圖8中。如圖7和圖8所示，使用電子顯微鏡觀察到兩種膠囊具有相對 意義上的球形形狀。然而，示例2的膠囊表現出更穩定的形狀(其表面平滑且堅實)，如圖 7中所示，而對比例1的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊具有非常粗糙且有裂縫的表面，如圖8中 所示。當在更高的放大倍率下觀察時，這樣的差異更加顯著(見圖9和圖10)。這些結果表 明植酸更加有力地鍵合到殼聚糖，從而形成具有少許裂縫的平滑的膜表面，這提高了膠囊 在酸性條件下對可溶活性成分的保護作用。
製備例3 :胰島素-殼聚糖水溶液的製備 將作為可溶活性成分的胰島素(Sigma-Aldrich)溶解在0. IN的HC1溶液中，終濃 度為3% (w/v)、5% (w/v)、10% (w/v)和15% (w/v)。將每種胰島素溶液加入到製備例1 中製備的殼聚糖水溶液中，利用磁力攪拌器以500rpm攪拌10分鐘以分散胰島素，然後靜置 一會兒以去除殼聚糖溶液中的氣泡，從而獲得胰島素_殼聚糖水溶液。
示例3 :包含胰島素的殼聚糖_植酸膠囊的製備 製備濃度為5%的植酸水溶液，將它的pH調整到l，從而製得膠囊。具體地講，將 植酸溶液加入到蒸餾水中，並攪拌以調節植酸在水中的濃度，然後用2. ON的氫氧化鈉溶液 調節它的PH。使用計量泵將製備例3中製備的胰島素_殼聚糖溶液逐滴加入到所得的溶 液中，使所得的混合物反應，以引發殼聚糖和植酸之間的鍵合，從而製得膠囊。將製備的膠 囊與混合物分離，用蒸餾水洗滌兩次或三次，然後用凍幹法乾燥。此時，在-4(TC執行4小 時的初始冷凍工藝，然後將膠囊在_301:乾燥3小時，在-l(TC乾燥2小時，在Ot:乾燥1小 時，在2(TC乾燥2小時，在3(TC乾燥5小時。
實驗例5 :殼聚糖-植酸膠囊的胰島素包封率 為了測量根據胰島素濃度的包封程度，計算示例3中製備的每種膠囊的胰島素包 封率。利用HPLC測量膠囊形成之後植酸溶液中剩餘的未包封胰島素的量，並利用數據計算 膠囊的胰島素包封率。結果示出在圖ll中。如圖ll中所示，當植酸溶液的pH為l時，胰 島素的濃度越低，包封率越高。具體地講，在胰島素的濃度為3%的情況下，表現出100%的 包封率。 對比例2 :包含胰島素的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的製備 在使用三聚磷酸鹽製備殼聚糖膠囊之後(其中，三聚磷酸鹽已廣泛地用作製備殼 聚糖膠囊的交聯劑)，測量它對可溶活性成分的包封率和其在胃液中的穩定性，並將其與根 據本發明製備的殼聚糖-植酸膠囊做比較。首先，在製備例3中製備胰島素濃度為3% (w/ v)的胰島素溶液，並且通過製備例3中所述的相同的方法製備胰島素-殼聚糖溶液。為了 選擇適於製備膠囊的三聚磷酸鹽的濃度和pH，將三聚磷酸鹽水溶液的濃度分別調整至4% (w/v)、5% (w/v)、6% (w/v)和7% (w/v)，並將每種水溶液的pH調整至3、5和7。通過示 例3中描述的相同的方法來製備膠囊。 對比實驗例3 :殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的胰島素包封率 通過實驗例5中所述的相同的方法來測量對比例2中製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊的胰島素包封率，結果示出在圖12中。如圖12所示，在對比例的殼聚糖膠囊的情況 下，當三聚磷酸鹽的濃度為4%或者更高時，胰島素包封率受三聚磷酸鹽的濃度的影響不明 顯，三聚磷酸鹽水溶液的pH變化對胰島素包封率有顯著影響。當pH為7且三聚磷酸鹽的 濃度為4% (w/v)、5% (w/v)和6% (w/v)時，殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊表現出最高的包封 率，但它是大約90%，這低於本發明的示例的包封率。
示例4 :包含胰島素的殼聚糖_植酸膠囊的製備 為了測量根據用作交聯劑的植酸的濃度和pH的胰島素包封程度，根據製備例3的 胰島素_殼聚糖水溶液中表現出最高胰島素包封率的方法來製備包含胰島素的殼聚糖溶 液。也就是說，將胰島素濃度為3% (w/v)的胰島素水溶液和通過製備例1中所述的相同 的方法製備的殼聚糖溶液混合，使得殼聚糖溶液與胰島素溶液的重量比為9 : l，並用攪拌 器以100rpm攪拌IO分鐘，從而製得包含胰島素的殼聚糖溶液。用蒸餾水稀釋58% (w/w) 的植酸溶液，使植酸溶液的植酸濃度為4% (w/w)、5% (w/w)、6% (w/w)和7% (w/w)，利用 5N的NaOH溶液將每種溶液的pH調整至1、2、4和6，從而製得植酸溶液。通過壓力輸送泵 將製備的胰島素_殼聚糖溶液輸送到注射器，並以滴加的方式將製備的胰島素_殼聚糖溶 液加入到製備的植酸溶液中，從而通過殼聚糖和植酸之間的鍵合來形成球狀膠囊。通過過 濾將膠囊與剩餘的植酸溶液分離。用蒸餾水洗滌分離的膠囊，以去除膠囊表面上殘餘的植 酸，並對製備的膠囊進行凍幹，從而形成根據本發明的膠囊。
實驗例6 :包含胰島素的殼聚糖-植酸膠囊在人工胃液中的穩定性
將示例4中製備的每種膠囊放到pH為1. 2的人工胃液(HCl濃度為O. 7% (v/v)且 NaCl濃度為0.2X (w/v)的水溶液)中，並在37°C的振蕩培養器中以100rpm振蕩2小時。 然後，通過HPLC測量釋放到人工胃液中的胰島素的量。使用用人工胃液處理2小時之後獲 得的數據來計算釋放到人工胃液中的胰島素的量，結果示出在圖13中。如圖13中所示，可 以看出當植酸溶液的pH為l或6時，2小時之後胰島素的釋放量(40% 70%)最低，並 且當植酸的濃度為6%時，胰島素的釋放量最低。從這些結果確定了 使用植酸濃度高(為 6% )的植酸溶液在酸性(pH為1)條件或弱酸性(pH為6)條件下製備的殼聚糖_植酸膠 囊在諸如胃液的酸性條件下更為穩定。 對比實驗例4 :包含胰島素的殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊在人工胃液中的穩定性
通過實驗例6中所述的相同的方法來測量對比例2中製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽 膠囊在人工胃液中的穩定性，結果示出在圖14中。如圖14所示，在對比例中製備的殼聚 糖-三聚磷酸鹽膠囊中，80%或更多的胰島素釋放到人工胃液中，而與三聚磷酸鹽的濃度 和pH無關。因此，確定了殼聚糖和三聚磷酸鹽之間的鍵合親合力比殼聚糖和植酸之間的鍵 合親合力弱，這樣的鍵合在胃液的強酸條件下容易被破壞，從而降低了膠囊對包封的可溶 活性成分的保護作用。 實驗例7 :胰島素從殼聚糖_植酸膠囊向腸的緩釋的測量 在包封的可溶活性成分通過腸壁被吸收的情況下，如果膠囊的外壁在腸內沒有破 裂，則降低了包封在膠囊內部的可溶活性成分的生物利用率。因此，為了檢查所製備的膠 囊的生物利用率，製備人工胃液和人工腸液，人工胃液的pH為1. 2，人工腸液是用0. 2M的 KH2P04、0. 2N的NaOH、水配製的溶液，0. 2M的KH2P04為25% (v/v) ，0. 2N的NaOH為11. 8% (v/v) ，pH為6. 8。然後，用人工胃液和人工腸液相繼處理在示例4中用濃度為6%且pH為
161、2、4和6的植酸溶液分別製備的四種殼聚糖-植酸膠囊，並測量每種膠囊的胰島素的釋放 量。通過HPLC測量從膠囊釋放的胰島素的量，將從膠囊釋放的胰島素的量表示為相對於膠 囊內部包封的胰島素的量的百分數(％)。這些結果示出在圖15中。當將膠囊放在與實驗 例6中的人工胃液相同的人工胃液中，並在37t:的振蕩培養器中以100rpm振蕩2小時時， 示出了包封胰島素的釋放量的範圍為40%至85%。當將用人工胃液處理的膠囊放在人工 腸液中並在37t:以100rpm振蕩時，如圖15中所示，發現胰島素逐漸地從殼聚糖-植酸膠囊 釋放。在實驗例6中在酸性條件下最穩定的殼聚糖_植酸膠囊，即利用pH為1和6的植酸 溶液製備的殼聚糖-植酸膠囊，在以上實驗中表現出最合意的結果。然而，還確定了 在使 用pH為2或4的植酸溶液製備殼聚糖_植酸膠囊的情況下，胰島素從膠囊逐漸地釋放到人 工腸液中。從這些結果可以看出，根據本發明製備的膠囊表現出依賴於PH的緩釋效果。從 這些結果可以預計，55%或更多的包封的可溶活性成分從殼聚糖-植酸膠囊釋放，並在腸 內被吸收。 對比實驗例5 :胰島素在腸內從殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊的受控釋放的測量
為了將根據本發明製備的膠囊的生物利用率與使用傳統交聯劑製備的膠囊的生 物利用率做比較，對在對比例2中在三聚磷酸鹽濃度為6%且pH為3、5和7的酸度的條件 下製備的膠囊進行了實驗例7中所述的相同的實驗。根據實驗例7測量從膠囊釋放的胰島 素的量。當將膠囊放在與實驗例6中的人工胃液相同的人工胃液中，並在37t:的振蕩培養 器中以100rpm振蕩2小時時，在根據對比例2製備的所有種類的膠囊中，釋放了 75%或更 多的包封的可溶活性成分。當將放在人工胃液中並振蕩的膠囊放在人工腸液中並在37°C 以100rpm振蕩時，如圖16中所示，可溶活性成分在12小時內從殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊 完全釋放。在對比實驗例4中在中性條件下最穩定的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊(即，使用 pH為7的三聚磷酸鹽溶液製備的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊)中，70%或更多的胰島素釋放 到人工胃液中，然後100%的胰島素在IO小時內完全釋放。因此，可以看出，它的生物利用 率明顯低於根據本發明製備的殼聚糖_植酸膠囊的生物利用率。 實驗例8 :殼聚糖-植酸膠囊與殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊之間的生物利用率的比 較 分別從實驗例7和對比實驗例5選擇表現出最合意的結果的膠囊，並對它們進 行比較。結果示出在圖17中。在實驗例7中選擇用濃度為6X且pH為l(PA-l)和pH為 6(PA-2)的植酸溶液分別製備的殼聚糖-植酸膠囊，它們的結果示出在圖17中。在對比實 驗例5中選擇用濃度為6%且pH為7的三聚磷酸鹽溶液製備的殼聚糖_三聚磷酸鹽膠囊， 它的結果示出在圖17中。已經確定殼聚糖-植酸膠囊與殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊相比向 人工胃液中釋放了更少量的胰島素，並且殼聚糖-植酸膠囊向人工腸液中逐漸地釋放胰島 素。 製備例4 :糖尿病小鼠的建立 使用六周大的Balb-c系雄性小鼠。以30mg/mL的濃度將鏈脲黴素溶解在0. lmM的 氯化鈉緩衝液中，然後以65mg/kg的劑量將其皮下注射到雄鼠中，以引發糖尿病。選擇在連 續的兩天表現出470 Omg/dL的血糖水平的雄性小鼠，對其進行實驗。在開始實驗之前， 使糖尿病小鼠飢餓12小時。 實驗例9 :包含胰島素的殼聚糖膠囊的體內生物利用率的比較
在從實驗例7和對比實驗例5分別選擇表現出最合意的結果的膠囊之後，將每種 膠囊口服給製備例4中建立的糖尿病小鼠，並測量血糖水平。結果示出在圖18中。組(l) 是口服鹽水的正常對照鼠；組(2)是以40IU/kg的劑量口服用濃度為6X且pH為1的植酸 溶液製備的包含胰島素的殼聚糖-植酸膠囊(實驗例7)的小鼠；組(3)是以40IU/kg的劑 量口服用濃度為6%且pH為6的植酸溶液製備的包含胰島素的殼聚糖_植酸膠囊(實驗 例7)的小鼠；組(4)是以40IU/kg的劑量口服用濃度為6X且pH為7的三聚磷酸鹽溶液 製備的包含胰島素的殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊(對比實驗例5)的小鼠；組(5)是以1IU/ kg的劑量皮下注射胰島素的小鼠，用來將根據本發明的胰島素的給服方法與其傳統方法做 比較。從圖18可以看出，在經皮下注射給服胰島素的情況下，血糖水平快速下降。類似地， 當將殼聚糖-植酸膠囊口服給小鼠時，血糖水平快速下降。此外，在使用殼聚糖-植酸膠 囊口服胰島素的情況下，血糖水平在恆定的低水平保持25小時，不存在突然的和過度的降 低。在使用殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊口服胰島素的情況下，血糖水平也稍微有些降低，但並 不顯著。因此，從實驗結果可以確定殼聚糖_植酸膠囊作為口服胰島素製劑的遞送介導物 (delivery intermediator)的可用性禾口可會g性。 圖19用數值示出了上述實驗的結果。AAC(血糖水平-時間曲線上面積)是用線 性梯形法則在數值上表示的血糖水平-時間曲線上面積。AAC值越大，藥物就越有效。Cmax 以百分數表示血糖水平的降低的最大值，Cmax越高，未引發低血糖性休克的血糖水平的範 圍越好。Tmax是達到Cmax所需的時間，Tmax值越低，藥物就越有效。F是藥物的相對生物 利用率，通過以下步驟來計算F : 口服胰島素情況下的AAC值乘以皮下注射的胰島素的量， 所得值除以皮下注射胰島素情況下的AAC值，然後所得值除以口服的胰島素的量。因此，當 F值越接近於100X時，藥物的作用越強。如圖19所示，在利用殼聚糖-植酸膠囊口服胰島 素的情況下測量的AAC值是在皮下注射胰島素的情況下測量的AAC值的大約2. 6倍高，它 的生物利用率是在使用殼聚糖-三聚磷酸鹽膠囊口服胰島素的情況下的生物利用率的大 約6倍高。因此，可以再次確定使用殼聚糖-植酸膠囊來口服胰島素的可能性。
製備例5 :胰島素-殼聚糖水溶液的製備 將作為可溶活性成分的胰島素(Sigma-Aldrich)溶解在0. 1N的HC1溶液中，終濃 度分別為4. 4% (w/v)和8. 5% (w/v)。將每種胰島素溶液加入到製備例1中製備的殼聚糖 水溶液中，利用磁力攪拌器以500rpm攪拌10分鐘以分散胰島素，然後靜置一會兒以去除殼 聚糖溶液中的氣泡，從而獲得胰島素-殼聚糖水溶液。
示例5 :包含胰島素的殼聚糖_植酸膠囊的製備 製備濃度為6%的植酸水溶液，將它的pH調整到l，從而製得膠囊。具體地講，將 植酸溶液加入到蒸餾水中，並攪拌以調節植酸在水中的濃度，然後用5. ON的氫氧化鈉溶液 調節它的pH。使用計量泵將製備例5中製備的胰島素-殼聚糖水溶液逐滴加入到所得的溶 液中，使所得的混合物反應，以引發殼聚糖和植酸之間的鍵合，從而製得膠囊。將製備的膠 囊與混合物分離，用蒸餾水洗滌兩次或三次，然後用凍幹法乾燥。此時，在-4(TC執行4小 時的初始冷凍工藝，然後將膠囊在_301:乾燥3小時，在-l(TC乾燥2小時，在Ot:乾燥1小 時，在2(TC乾燥2小時，在3(TC乾燥5小時。
製備例6 :糖尿病大鼠的建立 使用250g至280g的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠。以50mg/mL的濃度將鏈脲
18黴素溶解在pH為4. 5的檸檬酸中，並以50mg/kg重量的劑量對大鼠進行2天的給服。五天 之後，選擇表現出250mg/dL或更高的血糖水平的大鼠作為糖尿病大鼠。
實驗例10 :根據殼聚糖_胰島素膠囊的劑量的降低血糖水平的體內作用的比較
因為在實驗例9中在以40IU/kg的劑量給服胰島素的情況下獲得了最合意的結 果，所以根據殼聚糖_胰島素膠囊的劑量在4小時內檢查殼聚糖膠囊對降低血糖水平的作 用，其中，使用pH為1的植酸溶液製備殼聚糖-胰島素膠囊。分別以10IU/kg(L)、20IU/ kg(M)和40IU/kg(H)的劑量將示例5中製備的膠囊口服給製備例6中建立的糖尿病大鼠。 分別以10IU/kg(L)和20IU/kg(M)的劑量對大鼠給服在示例5中用4. 4% (w/w)的胰島素 溶液製備的膠囊，以40IU/kg(H)的劑量對大鼠給服用8.5% (w/w)的胰島素溶液製備的膠 囊。 如圖20和圖21中所示，在皮下注射胰島素(PC，陽性對照)的情況下，血糖水平 快速下降得最多。然而，可以確定在使用殼聚糖-植酸膠囊口服40IU/kg的胰島素(H)的 情況下，在口服殼聚糖膠囊3小時之後，血糖水平低於皮下注射胰島素的血糖水平。另一方 面，在口服不含胰島素的殼聚糖-植酸膠囊(NC，陰性對照)的情況下，確定了血糖水平不降 低。此外，確定了使用殼聚糖-植酸膠囊口服胰島素不引起血糖水平的突然的和過度的降 低。此外，這樣的結果在統計學上是有意義的，這表明使用植酸作為交聯劑的膠囊可以被有 效地使用。 製備例7 :胰島素-殼聚糖水溶液的製備 將作為可溶活性成分的胰島素(Sigma-Aldrich)溶解在0. IN的HC1溶液中，終濃 度分別為3. 7% (w/v)和2. 1% (w/v)。將每種胰島素溶液加入到製備例1中製備的殼聚糖 水溶液中，利用磁力攪拌器以500rpm攪拌10分鐘以分散胰島素，然後靜置一會兒以去除殼 聚糖溶液中的氣泡，從而獲得胰島素_殼聚糖水溶液。
示例6 :包含胰島素的殼聚糖膠囊的製備 製備濃度為6%的植酸水溶液，將它的pH調整到l，從而製得膠囊。具體地講，將 植酸溶液加入到蒸餾水中，並攪拌以調節植酸在水中的濃度，然後用5. ON的氫氧化鈉溶液 調節它的pH。使用計量泵將製備例7中製備的胰島素-殼聚糖水溶液逐滴加入到所得的溶 液中，使所得的混合物反應，以引發殼聚糖和植酸之間的鍵合，從而製得膠囊。將製備的膠 囊與混合物分離，用蒸餾水洗滌兩次或三次，然後用凍幹法乾燥。此時，在-4(TC執行4小 時的初始冷凍工藝，然後將膠囊在_301:乾燥3小時，在-l(TC乾燥2小時，在Ot:乾燥1小 時，在2(TC乾燥2小時，在3(TC乾燥5小時。
製備例8 :糖尿病大鼠的建立 使用200g至250g的雄性Wistar大鼠。以50mg/mL的濃度將鏈脲黴素溶解在pH 為4. 5的檸檬酸中，並以50mg/kg重量的劑量對大鼠進行2天的給服。 一周之後，選擇表現 出250mg/dL或更高的血糖水平的大鼠作為糖尿病大鼠。 實驗例11 :根據殼聚糖-胰島素膠囊的劑量的降低血糖水平的體內作用的比較
因為在實驗例10中在以40IU/kg的劑量給服胰島素的情況下獲得了最合意的結 果，所以根據殼聚糖-胰島素膠囊的劑量在24小時內檢查殼聚糖膠囊對降低血糖水平的作 用，其中，使用pH為1的植酸溶液製備殼聚糖-胰島素膠囊。分別以10IU/kg、20IU/kg和 40IU/kg的劑量將示例6中製備的膠囊口服給製備例8中建立的糖尿病大鼠，結果示出在圖22中。分別以10IU/kg(L)和20IU/kg(M)的劑量對大鼠口服在示例6中用2. 1% (w/w)的 胰島素溶液製備的膠囊，以40IU/kg(H)的劑量對大鼠口服用3.7% (w/w)的胰島素溶液制 備的膠囊。 如圖22中所示，可以確定在分別用10IU/kg、20IU/kg和40IU/kg的劑量給服殼 聚糖-胰島素膠囊的情況下，血糖水平根據濃度的降低是快速的且有效的。還確定了，血糖 水平的這種降低的效果保持至少8小時，並且在統計學上是有意義的。
製備例9 :生長激素_殼聚糖水溶液的製備 將作為可溶活性成分的人生長激素(Vexxon)溶解在去離子水中，濃度為2% (w/ v)。將該溶液加入到製備例1中製備的殼聚糖水溶液中，利用磁力攪拌器以500rpm攪拌 IO分鐘以分散生長激素，然後靜置一會兒以去除殼聚糖溶液中的氣泡，從而獲得生長激 素-殼聚糖水溶液。 示例7 :包含生長激素的殼聚糖_植酸膠囊的製備 製備濃度為6 %的植酸水溶液，將它的pH分別調整到1 、2、3、4、5、6和7，從而製得 七種膠囊。具體地講，將植酸溶液加入到蒸餾水中，並攪拌以調節植酸在水中的濃度，然後 用5. ON的氫氧化鈉溶液調節它的pH。使用計量泵將製備例9中製備的生長激素-殼聚糖 水溶液逐滴加入到所得的溶液中，使所得的混合物反應，以引發殼聚糖和植酸之間的鍵合， 從而製得膠囊。將製備的膠囊與混合物分離，用蒸餾水洗滌兩次或三次，然後用凍幹法幹 燥。此時，在_401:執行4小時的初始冷凍工藝，然後將膠囊在_301:乾燥3小時，在-10°C 乾燥2小時，在Ot:乾燥1小時，在2(TC乾燥2小時，在3(TC乾燥5小時。
實驗例12 :殼聚糖-植酸膠囊的生長激素包封率 為了測量植酸水溶液的pH對包封程度的影響，計算示例7中製備的每種膠囊的生 長激素包封率。通過HPLC測量膠囊形成之後植酸溶液中剩餘的未包封生長激素的量，並利 用數據計算膠囊的生長激素包封率。結果示出在圖23中。如圖23中所示，可以確定生長 激素完全包封在膠囊內部，而與植酸水溶液的PH無關。 實驗例13 :包含生長激素的殼聚糖_植酸膠囊在人工胃液中的穩定性 將示例7中製備的每種膠囊放到pH為1. 2的人工胃液(HC1濃度為0. 7% (v/v)
且NaCl濃度為0. 2% (w/v)的水溶液)中，並在37°C的振蕩培養器中以100rpm振蕩2小
時。然後，通過HPLC測量釋放到人工胃液中的生長激素的量。使用用人工胃液處理2小時
之後獲得的數據來計算釋放到人工胃液中的生長激素的量，結果示出在圖24中。如圖24
中所示，觀察到當植酸溶液的pH為1時，生長激素幾乎不釋放到人工胃液中，並且酸度越
高，生長激素釋放得就越多。然而，確定了 即使在使用pH為7的植酸水溶液製備的膠囊
中，也僅有低於30%的生長激素釋放到人工胃液中。從這些結果確定了 ，在較低pH條件下
製備的殼聚糖_植酸膠囊在酸性條件下的胃液中更為穩定。 實驗例14 :殼聚糖-植酸膠囊向腸內緩釋的生長激素的測定 在包封的可溶活性成分通過腸壁被吸收的情況下，如果膠囊的外壁不能在腸中破 裂，包封在膠囊內的可溶活性成分的生物利用率就會被劣化。因而，為了檢測製備的膠囊 的生物利用率，製備人工胃液(pH 1. 2)和人工腸液，人工腸液是用0. 2M的KH2P04、0. 2N的 NaOH、水配製的溶液，0. 2M的KH2P04為25% (v/v) ， 0. 2N的NaOH為11. 8% (v/v) ，pH為6. 8。 然後，測定在根據本發明示例7中製備的殼聚糖-植酸膠囊的生長激素的釋放量。當將膠
20囊放在與實驗例2的人工胃液相同的胃液中且在37t:的培養振蕩器中以100rpm振蕩2小 時時，30%或低於30%的被包封的可溶活性成分被釋放。將放在人工胃液中並振蕩的膠囊 放入人工腸液中並在37°C以100rpm振蕩。如圖25所示，在殼聚糖-植酸膠囊的情況下，24 小時後測定的可溶活性成分的累積釋放量為5% -35%。可以證實的是，使用pH越高的植 酸，從製備的膠囊釋放的生長激素就越多。 為了測定生長激素根據時間的釋放量，在使膠囊在人工胃液中經受振蕩孵育2小 時後，對人工腸液中的生長激素釋放量進行總計24小時的測定。如圖26所示，在使用具有 pH l至pH 4的植酸製備的殼聚糖-植酸膠囊中，低於10%的生長激素被釋放到人工胃液 中。此外，當膠囊被運送到人工腸液並進一步孵育時，最多20%的生長激素被釋放到人工腸 液中。
權利要求
一種殼聚糖膠囊，包含可溶活性成分，其中，所述可溶活性成分包封在含有殼聚糖和植酸的基質中。
2. 如權利要求1所述的殼聚糖膠囊，其中，所述可溶活性成分是一種或多種選自由藥物活性成分、食品活性成分和化妝品活性成分組成的組中的成分。
3. 如權利要求2所述的殼聚糖膠囊，其中，所述可溶活性成分是一種或多種選自於由核酸、胺基酸、肽、蛋白質、糖、碳水化合物、類脂、糖脂、植物源化合物、動物源化合物或微生物源化合物、植物提取物、合成化合物、維生素、微生物和病毒組成的組中的成分。
4. 如權利要求l所述的殼聚糖膠囊，其中，所述殼聚糖是一種或多種選於自由聚[13 -(1-4)-2-氨基-2- 二氧-D-吡喃葡萄糖]、硫代殼聚糖、三甲基化殼聚糖、羧甲基殼聚糖、N-(2-羥丙基-3-三甲基銨)殼聚糖氯化物組成的組中的組分。
5. 如權利要求1所述的殼聚糖膠囊，其中，殼聚糖的平均分子量在30， 000道爾頓至1， 000， 000道爾頓的範圍內。
6. —種使用植酸的使生物相容性聚合物交聯的方法。
7. 如權利要求6所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物是陽離子。
8. 如權利要求7所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物是殼聚糖。
9. 一種製備殼聚糖膠囊的方法，所述方法包括以下步驟第一步，製備包含殼聚糖和可溶活性成分的水溶液；第二步，製備包含植酸的水溶液；第三步，使第一步中製備的水溶液與第二步中製備的水溶液接觸，以執行離子凝膠化。
10. 如權利要求9所述的方法，其中，所述第一步包括(a) 通過向水溶液中加入殼聚糖來製備殼聚糖水溶液；(b) 製備可溶活性成分水溶液；(c) 將殼聚糖水溶液與可溶活性成分水溶液混合。
11. 如權利要求10所述的方法，其中，所述步驟(a)中的殼聚糖水溶液包含濃度在0.01% (w/v)至20% (w/v)的範圍的弱酸。
12. 如權利要求11所述的方法，其中，所述弱酸是一種或多種選自於由乙酸、乳酸、檸檬酸、甲酸、抗壞血酸、草酸、稀鹽酸和稀硫酸組成的組中的酸。
13. 如權利要求10所述的方法，其中，所述步驟(a)中的殼聚糖水溶液包含濃度在0.01% (w/v)至50% (w/v)的範圍的殼聚糖。
14. 如權利要求10所述的方法，其中，所述步驟(b)中的可溶活性成分水溶液包含濃度在0.01% (w/v)或高於0.01% (w/v)的範圍的可溶活性成分。
15. 如權利要求9所述的方法，其中，所述第二步中的植酸水溶液的pH在0. 5至7的範圍。
16. 如權利要求15所述的方法，其中，所述第二步中的植酸水溶液的pH在1至6的範圍。
17. 如權利要求9所述的方法，其中，所述第二步的植酸水溶液包含濃度為0. 1% (w/v)或高於O. 1% (w/v)的植酸。
18. 如權利要求17所述的方法，其中，所述第二步的植酸水溶液包含濃度為2% (w/v)或高於2% (w/v)的植酸。
19. 如權利要求9所述的方法，其中，通過將所述第一步的水溶液以滴加的方式加入到 所述第二步的水溶液中來執行第三步中的接觸步驟。
20. 如權利要求9所述的方法，其中，所述方法還包括選自於由以下步驟組成的組中的 至少一個步驟將第三步中製備的殼聚糖膠囊分離，洗滌所述殼聚糖膠囊和乾燥所述殼聚糖膠囊。
21. 如權利要求20所述的方法，其中，所述乾燥步驟通過凍幹法執行。
22. —種包含如權利要求1至7中任一項所述的殼聚糖膠囊和藥物可接受載體的藥物 組合物。
23. 如權利要求22所述的藥物組合物，其中，所述殼聚糖膠囊包含用作可溶活性成分 的白蛋白、胰島素或生長激素。
24. —種包含如權利要求1至7中任一項所述的殼聚糖膠囊和食品添加劑的食品組合物。
25. —種包含如權利要求1至7中任一項所述的殼聚糖膠囊和化妝品添加劑的化妝品 組合物。
全文摘要
本發明涉及一種可溶活性成分包封在含有殼聚糖和植酸的基質中的殼聚糖膠囊；一種交聯方法和能夠用在製備膠囊中的物質以及包含該膠囊的藥物組合物、食品組合物和化妝品組合物。根據本發明的殼聚糖膠囊通過作為生物可降解聚合物的殼聚糖與能夠快速並有效地與殼聚糖聚合物形成交聯反應的植酸的離子凝膠化反應來製備。本發明的膠囊顯示出對可溶活性成分的高包封率，並且保護可溶活性成分免於在消化道中受損，從而提高生理活性材料的體內遞送效率。此外，由於本發明的膠囊具有pH依賴緩釋機制，其可以使可溶活性成分在胃中的釋放最小化，而逐漸在腸中釋放，所以能夠調節可溶活性成分的緩釋。
文檔編號A61K9/48GK101784267SQ200880103896
公開日2010年7月21日 申請日期2008年5月29日 優先權日2007年6月18日
發明者崔成遠, 樸之鏞, 李敏暻, 趙英熙, 鄭勳玉, 鄭贊民 申請人:延世大學校產學協力團