TGF-β1受體阻斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用的製作方法

2023-06-10 07:33:11 2

TGF-β1受體阻斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了TGF-β1受體阻斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用。 申請人:的研究顯示，細粒棘球蚴早期感染小鼠在應用TGF-β1受體阻斷劑後下遊分子Smad2/3磷酸化蛋白表達下降，NK細胞活性受體NKG2D表達增加，NK細胞對靶細胞的裂解率恢復，NK細胞的活性與其活性受體NKG2D的相關性分析的表達呈正相關，CD4+/CD8+T細胞比值升高，CD4+CD25+T細胞數量減少，因此利用TGF-β1受體阻斷劑在臨床上可有效用於預防包蟲病的復發。
【專利說明】TGF-β 1受體阻斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用於用於預防包蟲病復發的方法，具體的是涉及TGF-β 1受體阻 斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用，屬於生物醫藥領域。

【背景技術】
[0002] 包蟲病，學名棘球蝴病（Ehcniocococsis)，是細粒棘球蝴絛蟲幼蟲寄生於人體 及某些動物體內所致的一種嚴重的人畜共患性寄生蟲病，引起人體包蟲病的棘球蝴絛蟲 主要有細粒棘球緣蟲（Echinococcus granulosus，E.g)和多房棘球緣蟲（Echinococcus multilocularis，E. m)兩種。囊性包蟲病是由細粒棘球絛蟲的幼蟲寄生在人體肝、肺等髒 器引起的一種嚴重危害人類健康的寄生蟲病，廣泛分布於世界各地，因此包蟲病己成為全 球性的影響公共健康的問題。
[0003] 針對包蟲病的治療，本領域已發展出了多種治療方案，主要是以外科手術為主，內 科藥物化療為輔的方法。但此方法有許多弊端，如手術治療對人體損傷較大，且易復發；內 科藥物如甲苯咪唑或阿苯噠唑等藥物進行化療，可產生很多的毒副作用，有的患者不能耐 受，或產生耐藥性。然而，包蟲病與其他寄生蟲病一樣，是一個慢性感染過程，其對宿主的作 用也是慢性而持久的過程，兩者之間的相互作用及其致病的免疫機制十分複雜，加之此病 發病隱匿，多數患者都是因包蟲病的併發症而來醫院就診。
[0004] 綜合目前的診斷和治療現狀來看，如何解決包蟲病的復發問題已經是本領域亟待 解決的課題之一。


【發明內容】

[0005] 申請人:深入研宄了包蟲病發病的生物學機理以及發病過程中人體免疫系統的免 疫機制，發現人或動物體在感染細粒棘球蝴後，包蟲本身和其代謝產物可引起宿主體內一 系列的細胞免疫和體液免疫的改變，從而通過改變宿主的細胞因子產生數量和/或種類來 逃避宿主的免疫殺傷作用，因此如果能夠有效阻止包蟲蟲體的免疫逃逸，將能夠有效防止 包蟲病的復發。
[0006] 具體地說，本發明是通過如下技術方案實現的：
[0007] TGF-β 1受體阻斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用。
[0008] 具體地說，上述的TGF-M受體阻斷劑用來阻斷TGF-β的信號傳導途徑，包括 SB-431542、SB-505124 和 SB-525334 等，優選為 SB-525334。
[0009] 申請人:進行的實驗顯示，細粒棘球蝴早期感染小鼠在應用TGF-β 1受體阻斷劑後 下遊分子Smad2/3磷酸化蛋白表達下降，NK細胞活性受體NKG2D表達增加，NK細胞對靶細 胞的裂解率恢復，NK細胞的活性與其活性受體NKG2D的相關性分析的表達呈正相關，CD4+/ ⑶8+T細胞比值升高，⑶4+CD25+T細胞數量減少，因此利用TGF-β 1受體阻斷劑在臨床上可 有效用於預防包蟲病的復發。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1為蛋白質印跡法檢測SB-525334對E. g早期期感染小鼠 Smad2, P Smad2和 β-actin蛋白水平的表達的影響，A為電泳結果，B、C為吸光度數據；其中，PSC :原頭節； SB :TGF-0 1 受體阻斷劑（SB_525334)。
[0011] 圖2為蛋白質印跡法檢測SB-525334對E. g早期期感染小鼠 Smad3, p Smad3和 β-actin蛋白水平的表達的影響，A為電泳結果，B、C為吸光度數據；其中，PSC :原頭節； SB :TGF-0 1 受體阻斷劑（SB-525334)
[0012] 圖3為流式細胞術檢測SB-525334對E. g早期感染BALB/c小鼠 NK細胞的影響， 其中，A為流式細胞術檢測NK細胞活性受體NKG2D的結果；B為流式檢測各組NKG2D結果 統計分析，PSC+SB組的表達顯著高於其它組；C為LDH法檢測各組小鼠 NK細胞殺傷活性的 統計分析，PSC+SB組小鼠 NK細胞殺傷活性明顯高於其它組；D為小鼠 NK細胞殺傷活性與 其活性受體NKG2D的相關性分析，R2 = 0. 751 ;其中，PSC :原頭節；SB :TGF-f3 1受體阻斷劑 (SB-525334) ;PSC+SB 組分別與 PSC、PBS+SB、PBS 組比較 * :P <0· 05, ** :P <0· 001。
[0013] 圖4為FCM檢測SB-525334對E. g早期感染BALB/c小鼠 T細胞亞群的影響，A :流 式細胞儀檢測E. g早期感染BALB/c小鼠 CD4+/CD8+T細胞的1次流式結果；B :流式檢測各 組⑶4+T細胞比率結果統計分析圖，PSC+SB組均低于于其它組；C :流式檢測各組⑶8+T細胞 比率結果統計分析圖，PSC+SB組均高於其它組；D :各組⑶47⑶8+T細胞比值結果統計分析 圖，PSC+SB組顯著低於其它組；其中，PSC :原頭節；SB !TGF-β 1受體阻斷劑（SB-525334); PSC+SB 組分別與 PSC、PBS+SB、PBS 組比較 * :P < 0· 05, ** :P < 0· 001。
[0014] 圖5為FCM檢測SB-525334對E. g早期感染BALB/c小鼠 CD4+CD25+T細胞數量 的影響，A :流式細胞儀檢測E. g早期感染BALB/c小鼠 CD4+CD25+T細胞的流式結果；B : ⑶4+CD25+T細胞流式結果統計分析，PSC+SB組⑶47⑶8+T細胞數量顯著低於PSC組；PSC : 原頭節；SB !TGF-β 1受體阻斷劑（SB-525334) ; PSC+SB組分別與PSC、PBS+SB、PBS組比較 木：P < 0. 05, ** :P < 0. 001。

【具體實施方式】
[0015] 為了說明本發明受體阻斷抑制劑的效果，進行了如下實驗。
[0016] I. 1細粒棘球蝴原頭節的製備
[0017] 從感染細粒棘球蝴病的羊肝上，無菌抽取無鈣化、無感染、全整的單囊型細粒棘球 蝴包囊內容物置於無菌離心管內，原頭節（Pr 〇t〇SC〇le，PSC)自然沉澱，再用含有100IU/ml 青黴素和鏈黴素雙抗的無菌PBS (pH = 7. 3)中漂洗2-3次，除去育囊碎片使其自然沉澱， 0. 5%伊紅染色5min，在顯微鏡下鑑定具有活性的蟲體數（> 90% )，用含雙抗的無菌PBS 稀釋製成含有原頭節10000個/ml的原頭節懸液，備用。
[0018] 1. 2建立細粒棘球蝴感染小鼠動物模型，將16隻健康BALB/c小鼠，隨機分4組：
[0019] SB+PSC :腹腔接種濃度為10000個/ml原頭節，加入100IU/ml青黴素和100IU/ ml鏈黴素0. 2ml/只；從接種前一天開始，到接種的第9天，每天灌胃TGF-β 1受體阻斷劑 (SB-525334)，濃度為 200mg/L、灌胃量 10mg/Kg。
[0020] SB+PBS :腹腔接種PBS加入100IU/ml青黴素和100IU/ml鏈黴素0. 2ml/只；從接 種前一天開始，到接種的第9天，每天灌胃SB-525334,濃度為200mg/L、灌胃量10mg/Kg。
[0021] PBS :腹腔接種PBS加入lOOIU/ml青黴素和lOOIU/ml鏈黴素0· 2ml/只；
[0022] PSC :腹腔接種濃度10000個/ml原頭節，加入100IU/ml青黴素和100IU/ml鏈黴 素 0· 2ml/ 只；
[0023] 上述各實驗組均在9天的時候頸椎脫白法處死小鼠，無菌摘取脾臟，製備脾細胞 懸液。
[0024] 1. 3流式細胞染色及檢測
[0025] 首先按照試劑說明書，將螢光稀釋10倍，DX-5、NKG2D原液濃度為0. 5mg/ml，吸取 5ul到EP管中，加入95ul PBS，配製成濃度為25ug/ml的抗體工作液。然後利用流式細胞 檢測 NKG2D、DX-5 (或 CD4+CD25+T):
[0026] (1)將細胞用PBS調至IX IO7個/ml。
[0027] (2)取4個流式管，分別標上空白管、NKG2D、DX-5和NKG2D&DX-5(或空白，CD4、 CD25 和 CD4&CD25)等標記。
[0028] (3)分別向各管中加入50 μ 1濃度為IXioVml的脾細胞，再向個管中加入相應的 螢光抗體，其中空白管不加任何螢光抗體。
[0029] (4)室溫避光孵育30min，加入約Iml PBS洗絛，1000轉/分鐘離心5分鐘。以上 各組共培養後的細胞懸液收集起來，IOOOrpm離心5min。
[0030] (5)棄上清液，加入300 μ I PBS，混勻。
[0031] (6)上機檢測。讀取結果。
[0032] 1. 4流式細胞檢測細粒棘球蝴早期感染小鼠 T亞群步驟如下所示：
[0033] (1)將細胞用PBS調至IX IO7個/ml。
[0034] (2)取5個流式管，分別標上空白管、⑶3、⑶4、⑶8和⑶3&CD4&CD8等標記。
[0035] (3)分別向各管中加入50 μ 1濃度為IXioVml的脾細胞，再向個管中加入相應的 螢光抗體，其中空白管不加任何螢光抗體。
[0036] (4)室溫避光孵育30min，加入約1毫升PBS洗滌，1000轉/分鐘離心5min。以上 各組共培養後的細胞懸液收集起來，IOOOrpm離心5min，然後棄上清液，加入300 μ I PBS， 混勻。進行上機檢測並讀取結果。
[0037] I. 5ELISA法檢測細粒棘球蝴早期感染小鼠外周血中TGF-β 1含量外周血中 TGF-β 1含量用ELSIA試劑盒檢測，按照試劑盒說明書進行操作並設立復孔，建立標準曲線 法並進行計算。具體操作步驟如下：
[0038] (1)標本激活
[0039] 將320 μ 1樣本稀釋液加入到1隻I. 5ml的PE管中，再加入40 μ 1樣本血清。加 入20 μ I IN HCl，蓋緊，上下顛倒混勻。4°C放置60分鐘。加入20 μ I IN NaOH，蓋緊蓋子， 上下顛倒混勻。計算結果時乘以稀釋的倍數10。
[0040] (2)稀釋標準品：取7個乾淨的I. 5ml EP管並編號：1-7,都加入0. 5ml試劑緩衝 液，取0. 5ml標準品加入1號EP管中，蓋好蓋子，顛倒幾次混勻；從1號管中吸取0. 5ml標 準品，並加入到2號EP管中，混勻後再吸取0. 5ml標準品至3號管中，後面依次向下一 EP管 中轉移0· 5ml標準液直至7號EP管，停止。濃度依次為2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、 250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml ;
[0041] (3)留空白對照孔；
[0042] (4)取100 μ 1待測樣和100 μ 1各濃度的標準品加入到待測樣孔中（各待測樣均 設有復孔）；貼上封板朔紙，室溫孵育90min ;
[0043] (5)提前30min製備生物素化抗體工作液；
[0044] (7)洗板 5 次，每次 5min ;
[0045] (8)除空白孔外，每孔均加入生物素抗體工作液100 μ 1 ;貼好封板朔紙，並室溫孵 育 60min ;
[0046] (9)提前半小時準備酶標結合物工作液；避光室溫保存；
[0047] (10)洗板 5 次，每次 5min ;
[0048] (11)除空白孔外，每孔均加入酶標結合物工作液100 μ 1 ;貼好板朔紙封住，並室 溫孵育半小時；洗板5次，每次5min ;
[0049] (12)加入底物顯色液：向所有反應孔中加入100 μ 1的TMB底物顯色溶液，37°C， 10 ?20min ;
[0050] (13)向各反應孔中加入IOOul終止液，終止反應。
[0051] (14)讀取結果：用ELISA檢測儀檢測（在半小時之內），於450nm處，測各孔OD值； 繪製標準曲線並建立方程式。並通過標準曲線方程式計算出出待測樣本的濃度。
[0052] 1. 6實時螢光定量PCR檢測細粒棘球蝴早期感染小鼠脾細胞Foxp3基因和TGF-β 基因的表達
[0053] 利用SYBR Green法檢測Foxp3基因和TGF-β基因的表達，操作步驟按照說明 書：實時螢光定量反應體系：cDNA 4 μ 1，SYBR GreenI 10 μ 1，上遊引物0.5 μ 1，下遊引物 0. 5μ 1，雙蒸水5μ 1 ;具體反應條件：預變性95°C 5min ;變性95°C、15s ;Foxp3、TGF-β退 火60°C、30s，β-Actin退火56°C、30s，延伸72°C、30s ;共40個循環。相對定量計算擬採用 24 Aet，ACt = Ct待測基因-Ct內參基因。
[0054] 1. 7用LDH酶法檢測細粒棘球蝴早期感染小鼠 NK細胞活性的影響
[0055] (1)試劑：1 % NP-40、LDH底物溶液、lmol/L檸檬酸終止液。
[0056] (2)靶細胞的預處理（Yac-Ι細胞）：Yac_l細胞（小鼠 NK細胞的靶細胞，其細胞表 面無 MHC-I類分子表達），實驗前24h將靶細胞進行換液。用前計數並離心1000rmp、5min， 用1640培養液調整細胞濃度為I X IO5個/ml。
[0057] (3)效應細胞的製備：將細粒棘球蝴早期感染小鼠脾細胞用PBS洗滌3次，再用完 全RPMI-1640培養液重懸，調整細胞濃度：I X IO7個/ml。
[0058] (4)效-靶細胞作用（共培養）：(E/T = 100 : 1):分別取靶細胞和效應細胞各 0. Iml (E : T = IOO : 1)加入96孔細胞培養板中，設3復孔，並設靶細胞最大釋放組（0.1ml 靶細胞+0. Iml 1 % NP40液），和自然釋放組（0. Iml靶細胞+0. Iml 10 % FCSRPMI-1640培養 液）1000r/min，低速離心2分鐘。置37°C、5% CO2孵育2h。1000r/min，離心5分鐘。
[0059] (5)酶促反應：：取出96孔培養板，分別取0. Iml各孔上清夜，移入空白孔中，置 37°C預溫10min，分別每孔加入底物溶液0. lml，室溫避光反應10-15min。每孔加入檸檬酸 Imol/L 30 μ 1終止液，終止酶促反應。
[0060] (6)讀取OD值：用酶聯檢測儀在570nm波長處讀取各OD值。
[0061] (7)結果計算：根據下列公式計算NK細胞活性
[0062]

【權利要求】
1. TGF-M受體阻斷劑在製備預防包蟲病復發的藥物中應用。
2. 根據權利要求1的應用，其特徵在於所述TGF-M受體阻斷劑為SB-525334。
【文檔編號】A61K31/517GK104490886SQ201410571911
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年10月23日 優先權日:2014年10月23日
【發明者】陳雪玲, 吳向未, 印雙紅 申請人:陳雪玲