一種針對t細胞受體可變區特異性單抗的製備方法
2023-06-09 13:01:26 1
專利名稱：一種針對t細胞受體可變區特異性單抗的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種單克隆抗體的製備方法，尤其是一種通過正反篩選法獲得特異性單克隆抗體的方法。
背景技術：
T細胞通過其表面T細胞受體(T cell receptor, TCR)識別主要組織相容性複合物分子(Major histocompatibility complex, MHC)呈遞的多肽來行使其細胞功能，所以 TCR的識別能力是T細胞行使功能的先決條件。與抗體分子一樣，TCR組成鏈的形成也存在基因重排現象，即每條多肽鏈的編碼基因都是由3個或4個基因片段組合而成。其中，短鏈 α和Y是由可變區基因片段(V gene segment)、連接子基因片段(J gene segment)和恆定區基因片段(C gene segment)三種片段連接而成，而長鏈β和δ是由4個基因片段組合而成，包括與短鏈一樣的3個基因片段和額外的多樣性基因片段(D gene segment)。每個基因片段的相互連接處都存在核苷酸的隨機缺失或增加，從而造成連接處的高度多樣性。舉例而言，人染色體上共含有42個Va基因片段和46個νβ基因片段，以及數目龐大的連接子基因片段J α或J0，加上基因重排時基因片段連接處的高度多樣性，就使得α β TCR庫的數目高達IOw個。我們知道，對於其他類型的細胞受體而言，沒有一種細胞受體能和TCR 一樣具有如此多的多樣性。所以我們可以想像，TCR與其配體之間的識別將比其他任何一種細胞受體都要複雜和奇妙。TCR主要通過其可變區的6個互補決定區域(Complementarity determining region,⑶R)來與配體發生相互作用，所以可變區決定TCR的識別能力。而在病原抗原特異性或腫瘤抗原特異性的T細胞受體庫研究中，我們往往會發現某些可變區基因片段會佔優勢，存在偏好性，而監測這些帶有優勢可變區基因片段的T細胞受體的變化情況對於我們設計和開發基於T細胞的相關疫苗和免疫治療手段具有重要的意義。目前成熟應用的監測方法就是流式細胞儀技術，而要想應用流式細胞儀技術必然需要用到特異性的單克隆抗體。但是到目前為止，依然沒有一種通用的方法來生產針對T細胞受體可變區特異性單克隆抗體的製備方法，本專利旨在提供一種能夠有效生產該類單克隆抗體的方法，並申請保護。本發明通過體外復性技術獲得可溶性T細胞受體蛋白，接著應用單克隆抗體雜交瘤技術生產單抗，並採用正反篩選法來獲得某可變區特異性的單抗。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種針對T細胞受體可變區特異性單抗的製備方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案為首先製備可溶性T細胞受體蛋白，然後採用正反篩選獲得可產特異性可變區單抗的雜交瘤株。所述可溶性T細胞受體蛋白製備過程中通過引入人工二硫鍵穩定T細胞受體蛋白，所述人工二硫鍵由α鏈恆定區的Τ48 - C和β鏈恆定區的S57 _ C組成。為了更好的穩定T細胞受體蛋白，可同時將β鏈中的自由半胱氨酸突變成丙氨
所述正反篩選的原理如下T細胞受體胞外段由4個免疫球蛋白結構域組成，包括兩個可變區和兩個恆定區。所以當我們採用T細胞受體蛋白去免疫小鼠生產單抗時，我們得到的單抗有可能結合目標可變區外的其它三個結構域。為了高效獲得目標可變區特異性的單抗，我們還要採用反篩法剔除那些不結合目標可變區的單抗。其具體步驟如下首先利用T細胞受體蛋白1免疫小鼠生產單抗，將能夠結合T細胞受體1的單抗雜交瘤株留下；然後使用τ細胞受體2篩選將第1)步獲得的單抗雜交瘤株，將不能結合T細胞受體2的單抗雜交瘤株留下，得到可產特異性可變區1單抗的雜交瘤株；所述T細胞受體1與T細胞受體2的區別就在於目標可變區的不同，而其它三個結構域都相同。應用本方法可以高效、快速的獲得T細胞受體可變區特異性單抗，對設計和開發基於T細胞的相關疫苗和免疫治療手段具有重要的意義。
圖1單克隆抗體檢測。
具體實施例方式
實施例1可溶性T細胞受體蛋白改造
以篩選V δ 1可變區(也叫TRDV1，TCR可變區信息請參考網站http://www. imgt. org) 的特異性單抗為例，我們來說明具體的實施方式。其中，我們用於正篩的T細胞受體1為 S19-2，來源於HIV病人，識別的配體是HLA-AM402限制性的nef 138-10表位(來源於HIV 病毒nef蛋白)。所有蛋白材料可由基因合成公司合成相應基因來表達。HLA-A*2402的序列信息如SEQ ID NO. 1所示，具體如下 GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQ
TDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEA AHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCffALGFYPAEITLTffQRDGEDQTQ DTELVETRPA⑶GTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
Nefl38-10表位多肽可由公司合成，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具體如下 為 RYPLTFGWCF。S19-2 TCR 兩條鏈的基因組成信息為α 鏈，TRDVl+TRAC ； β 鏈，TRBV30+TRBC。α鏈蛋白序列如SEQ ID NO. 3所示，具體如下 MLFSSLLCVFVAFSySGSSVAQMTQAQSSYSMPYRMYTWCLYETSmSYYIFmmiPSKEMIFLmQG
SDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGELARSGGYQKVTFGTGTKLQVIPAyaV/ K7^ RDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAVSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFP ^^CDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLffSS
其中，帶有下劃線的部分為可變區序列，帶有下劃線且斜體字體部分為恆定區序列，位於可變區和恆定區之間的為高度可變的連接區序列。恆定區序列中的T48突變成C，用於後期的復性過程中可引入一對人工二硫鍵來穩定TCR蛋白的構象。β鏈蛋白序列如SEQ ID NO. 4所示，具體如下MLRSLLALLLGTFFGVRSQTIHQffPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYffYRQAAGRGLQLLFYSVGIG QISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSVSVGAGVPTIYFGEGSWLTVWi^MT/y/^^K/^ PSEAEISHTOKA TL VCLA TGFFPDHVELSVVVNGKEVHSGVSTDPOPLKEOPALNDSRYCLSSRLRVSA TFVONPR mFffCOVOFyGLSBMIBWWDMKPVWIVSABAWGMDCGFTSYSYQQGYLSATILYEILLGMTLYAYUSAU LMAMVKRKDF
其中，帶有下劃線的部分為可變區序列，帶有下劃線且斜體字體部分為恆定區序列， 位於可變區和恆定區之間的為高度可變的連接區序列，恆定區之後的為跨膜區和胞內區序列。恆定區序列中的S57需要突變成C，用於後期的復性過程中可引入一對人工二硫鍵來穩定TCR蛋白的構象，同時將自由半胱氨酸C96突變成A，減少復性過程中多聚體的形成。用於反篩法的T細胞受體2是在S19-2的基礎上，將α鏈的可變區TRDVl替換成 TRAV2-1，而β鏈保持不變，這個T細胞受體我們命名為S19-2-TRAV2-1。新組合而成的α 鏈蛋白序列如SEQ ID NO. 5所示，具體如下(僅包括可變區，連接區和恆定區序列)
KEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSN⑶KEDGRFTAQLNKASQYVS LLIRDSQPSDSATYLCAVTLARSGGYQKVTFGTGTKLQVIPAyaV/^/^KFa^taSSy^ZMyKa/TiFiASWWSg SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAVSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
將這三條多肽鏈構建到表達載體pET21a上，具體實驗操作請見《分子克隆技術手冊》。 應用大腸桿菌E. coli表達系統表達包涵體蛋白並純化，具體步驟如下
1)將1-2 yL表達質粒轉化到BL21 (DE3)感受態細胞中，過夜，將單克隆菌落接種到 40 mL LB培養基中，培養6-8小時。2)每20 mL分別按照1%的接種量轉接到含有2 L LB培養基的大搖瓶中，37°C培養至0D600=0. 4-0. 6，加入IPTG至終濃度為1 mM，37°C繼續培養5-6小時。3)收菌(以下步驟都在低溫或冰水浴下進行)，用60 mL左右IXPBS懸浮，Φ6探頭超聲裂解(超聲6 s，間隔12 s，99次，250 W，2個循環)。4) 17500 rpm，離心15 min。離心管下部呈白色緻密塊即為包涵體。5)用移液器或玻璃棒小心的將包涵體上面一層細胞脆片吹打掉，棄上清。用 Washing buffer 懸浮。6)超聲，4 S, 10 S, 40 次，250 W。7)重複步驟4-6，用Washing buffer洗滌三次。8) Resuspension buffer17500 rpm, 15 min。9)除細胞碎片、棄上清，稱重。按30mg/mL的比例用包涵體溶解液(Disolution buffer)溶解，4°C攪拌過夜。10) 17500 rpm, 20 min，取出上清或分裝成ImL/管保存於_20°C或_80°C備用。包涵體清洗液(Washing buffer):0. 5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8. 0,300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT (現用現加)；
包涵體重懸液(Rsuspension buffer) :50 mM Tris pH 8. 0,100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT (現用現加)；
包涵體溶解液(Dissolution buffer) 6 M Gua-HCl (或 8 M Urea)，10%甘油，50mM Tris pH8. 0,100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT (現用現加)； 實施例2可溶性T細胞受體蛋白的復性具體步驟如下
1)配製TCR復性液。一般為2 L，於冰上或4°C冷庫預冷，復性過程在4°C冷庫中進行。2)將盛有復性液的燒杯置於磁力攪拌器中，加入轉子，設置合適的攪拌速度。這裡以Isec轉子轉一圈為佳。找一個5 mL注射器換上1 mL的針頭，將其固定在燒杯上。3) α鏈和β鏈的包涵體按照2:1的質量比加入注射器(質量比例根據實際復性情況可進行調整)，即一次加入2 mL α鏈和1 mL β鏈，並混勻。使之一滴一滴的緩慢滴入復性液內，慢慢攪拌8小時。4)每隔8小時，重複一次步驟4，一共加三次包涵體，即一共加入6 mL的α鏈和 3 mL β 鏈。5)第三次加完包涵體後8小時，使用切向流儀器(TFF)進行濃縮，最後溶液體系為約300-400 mL，將濃縮後的蛋白復性溶液放入透析袋。6)復性液濃縮過程中，準備4 L去離子水和4L 10 mM Tris緩衝液，4°C冷庫預冷。7)先將裝入透析袋的蛋白在水中透析M小時，再用10 mM Tris透析對小時，透析過程中需用轉子攪拌。8)將透析後的蛋白液放入濃縮杯濃縮至100 mL。9)取出蛋白液，4°C，16，000 rpm離心10分鐘。取上清。10)用離子交換柱Source 15Q純化，先分多次上樣將蛋白結合到離子交換柱上， 每次5ml，一般上滿50 mL蛋白就洗脫一次，用鹽濃度梯度洗脫，梯度一般為90分鐘內從0% 拉到50%ο11)跑非還原和還原蛋白膠確定目的TCR蛋白峰，此後將所收集的蛋白用 Superdex 200柱子再次純化。復性液配方如下 5M Urea
IOOmM Tris pH8. 0
400mM L-Arg HCl (母液可配成 2M)
2mM EDTA
5mM GSH (復性液預冷後再加入)
0. 5mM GSSG (同上)
0. 5mM PMSF (母液 IOOmM,可不加)。實施例3正反篩選製備特異性單克隆抗體
T細胞受體胞外段由4個免疫球蛋白結構域組成，包括兩個可變區和兩個恆定區。所以當我們採用T細胞受體蛋白去免疫小鼠生產單抗時，我們得到的單抗有可能結合目標可變區外的其它三個結構域。為了高效獲得目標可變區特異性的單抗，我們還要採用反篩法剔除那些不結合目標可變區的單抗。所謂反篩法，首先需要我們應用體外復性技術構建一種用於反篩的T細胞受體蛋白2，同時為了方便陳述，我們將之前免疫小鼠的T細胞受體蛋白命名為T細胞受體1。T細胞受體1與T細胞受體2的區別就在於目標可變區的不同，而其它三個結構域都相同。製備流程如下首先我們利用T細胞受體1免疫小鼠生產單抗，之後採用ELISA (酶聯免疫吸附實驗) 技術來正反篩選所要的某可變區特異性單抗。第一步，正向篩選，將能夠結合T細胞受體1 的單抗雜交瘤株留下；第二步，在第一步獲得的單抗雜交瘤株中，進一步用T細胞受體2反向篩選，即將不能結合T細胞受體2的單抗雜交瘤株留下，剔除那些能夠與T細胞受體2結合的單抗雜交瘤株。經過這兩步正反篩選獲得的單抗雜交瘤株就是我們最後所要的某可變區特異性單抗。還是以篩選V δ 1特異性單抗為例，我們通過實施例2裡的方法獲得可溶性T細胞受體1和τ細胞受體2以後，進行上述的製備流程。結果我們共獲得11株單抗雜交瘤株， 採用ELISA實驗進行驗證。操作步驟 1)包被
用包被緩衝液將蛋白稀釋至lOug/mL，每孔中加入0. lmL，先置37°C孵育2小時再轉入 4°C過夜。也可以將ELISA板直接置4°C過夜。2)洗滌
包被結束後棄掉包被液，用PBST進行洗滌，方法為PBST加滿每孔，靜置5-lOmin，棄掉洗液，重新加滿，重複洗滌3-5次，最後拍幹ELISA板等待下一步封閉。3)封閉
取第2步的ELISA板加10%小牛血清至每孔封閉，體積至少為所加包被液的兩倍。封閉條件也有兩種選擇直接置於4°C過夜，或者置於37°C溫育2-4h。4)洗滌
封閉結束的ELISA板進行洗滌，方法同步驟2。最後拍乾等待加入一抗(單抗雜交瘤株培養細胞上清或小鼠腹水純化單抗)。5)加入一抗
一抗樣品先用包被液稀釋至所需濃度後加入到相應孔中。反應條件為37°C孵育池。6)洗滌具體同步驟4。7)加相應HRP-標記的商品化二抗
加相應的商品化HRP-標記的二抗，參考二抗說明書將二抗用封閉液稀釋至適當倍數。 將稀釋好的二抗加入各孔，37°C反應1-1.證。8)洗滌具體同步驟4。9)顯色
待步驟8完成後取lOOulTMB底物顯色液分加至ELISA各孔中。然後將ELISA板置於 37°C 反應約 IOmin。10)終止
將ELISA板取出，每孔加終止液(2mol/L硫酸溶液)終止反應，立即到酶標儀上讀數， TMB為底物時波長為450nm。試劑配製
1)包被液(PH6. 3的碳酸鹽緩衝液)無水 Na2C03 0. 1696g NaHC030.2856g
無菌水100ml
完全溶解至4°C，一周內使用
2)PBST配方
NaCl8.Og
Na2HP04. 12H20 2. 9g KCl0. 2g
KH2P040. 24g
Tff-200. 5ml
無菌水1000ml
3)終止液
濃硫酸無菌水=1:8
濃硫酸緩慢加入到無菌水中，並攪拌散熱。最後我們獲得ELISA數據如圖1所示。結果顯示其中10株都能特異性地結合V 6 1 可變區，而有一株不能特異性地結合。所以應用我們的方法能夠高效率的獲得某可變區特 異性單抗，並保證識別蛋白的活性構象表位，可用於流式細胞儀檢測。雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範 圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種針對T細胞受體可變區特異性單抗的製備方法，其特徵在於首先製備可溶性T 細胞受體蛋白，然後採用正反篩選獲得可產特異性可變區單抗的雜交瘤株。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於所述可溶性T細胞受體蛋白中通過引入人工二硫鍵穩定T細胞受體蛋白。
3.權利要求2所述的方法，其特徵在於所述人工二硫鍵由α鏈恆定區的T48-C和β 鏈恆定區的S57-C組成。
4.權利要求2或3所述的方法，其特徵在於還包括同時將β鏈中的自由半胱氨酸突變成丙氨酸。
5.權利要求1所述的方法，其特徵在於所述正反篩選包括如下步驟1)利用T細胞受體蛋白1免疫小鼠生產單抗，將能夠結合T細胞受體1的單抗雜交瘤株留下；2)使用T細胞受體2篩選將第1)步獲得的單抗雜交瘤株，將不能結合T細胞受體2的單抗雜交瘤株留下，得到特異性產T細胞受體可變區1單抗的雜交瘤株；所述T細胞受體1 與T細胞受體2的區別就在於目標可變區的不同，而其它三個結構域相同。
全文摘要
本發明公開了一種針對T細胞受體可變區特異性單抗的製備方法，首先製備可溶性T細胞受體蛋白，然後採用正反篩選獲得可產特異性可變區單抗的雜交瘤株。應用本方法可以高效、快速的獲得T細胞受體可變區特異性單抗，對設計和開發基於T細胞的相關疫苗和免疫治療手段具有重要的意義。
文檔編號C07K16/28GK102295702SQ201110247320
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者施一, 高福 申請人:中國科學院微生物研究所