類固醇多步氧化方法和所用的遺傳工程細胞的製作方法

2023-06-10 02:33:06

專利名稱：類固醇多步氧化方法和所用的遺傳工程細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備藥學上有用的類固醇的多步氧化方法。
11β、17α、21-三羥基-4-孕甾-3，20-二酮(氫化可的松)是一種重要的藥用類固醇，由於它的藥理性質，可將其作為皮質甾類使用和作為製備許多有用類固醇(特別是其他皮質甾類)的起始化合物。氫化可的松由脊椎動物的腎上腺皮質產生，最初只能通過繁雜的提取方法從腎上腺皮質組織中得到很少的量。只有在闡明其結構後，才發展出一些新的生產途徑，這些途徑的特點是化學合成步驟與微生物轉化相結合。只是因為所選用的初始化合物如甾醇、膽酸和皂草配基豐富而且便宜，因此目前的這些方法提供了不太昂貴的產品，但這些方法仍然相當複雜。設想了幾種改進現行方法的可能性，生物化學的方法也已進行過嘗試。
有一種嘗試是使用分離的腎上腺皮質蛋白(這些蛋白已知與類固醇在體內的酶學轉化有關)的一個體外生化系統，將合適的初始類固醇轉化為氫化可的松。然而，分離這些重要蛋白的困難性和必需的輔助因子的昂貴价格看來使有經濟吸引力的大規模生產不能實現。另一種方法是使催化酶保留在其天然環境中，並使腎上腺皮質細胞在細胞培養中產生所需的氫化可的松。但是，由於在實踐中這些細胞的生產力很低，因此，要使這樣一種生化方法在經濟上具有吸引力看來也是不可能的。
哺乳動物和其他脊椎動物腎上腺皮質中的體內過程構成了一種生化途徑，它是以膽甾醇開始的，經由各種中間產物最終得到氫化可的松(

圖1)。這種途徑中直接涉及8種蛋白質，其中有5種是酶，這些酶中有4種是細胞色素P450酶，其他3種是電子傳遞蛋白。
第一步是膽甾醇向3β-羥基-5-孕甾-20-酮(孕烯醇酮)的轉化。在這種轉化中(即一種單氧化酶反應)涉及3種蛋白質側鏈裂解酶(P450SCC，一種含血紅素-鐵的蛋白)，腎上腺皮質鐵氧還蛋白(ADX，一種含Fe2S2的蛋白)和腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(ADR，一種含FAD的蛋白)。此外，以膽甾醇作為底物的反應進一步需要分子氧和NADPH。
接著是通過脫氫作用/異構作用將孕烯醇酮轉化為4-孕甾-3，20-二酮(孕酮)。該反應由蛋白質3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶(3β-HSD)催化，它需要孕烯醇酮和NAD+。
為了得到氫化可的松，再在孕酮的3個位置進行羥化，這種轉化由單氧化酶催化。在孕酮轉化為17α-羥基孕甾酮時涉及兩種蛋白質類固醇17α-羥化酶(P45017α，一種含血紅素-鐵的蛋白)和NADPH細胞色素P450還原酶(RED，一種含FAD-和FMN的蛋白質)。該反應消耗孕酮，分子氧和NADPH。
17α-羥基孕酮轉化為17α-21-二羥基-4-孕甾-3，20-二酮(去氧可的松)時也需要兩種蛋白質類固醇-21-羥化酶(P450C21，一種含血紅素-Fe的蛋白質)和前面提及的蛋白質RED。該反應消耗17α-羥基孕酮，分子氧和NADPH。去氧可的松轉化為氫化可的松涉及3種蛋白質類固醇11β-羥化酶(P45011β，一種含血紅素-Fe的蛋白質)和上面提及的蛋白質ADX和ADR。
如上所述，細胞色素P450蛋白質是膽甾醇向氫化可的松進行生化轉化所必需的酶。這些酶隸屬於一個更大的組群即細胞色素P450蛋白(或簡稱P450蛋白)。它們已經在原核生物(各種細菌)和真核生物(酵母、黴菌、植物和動物)中發現過。發現在哺乳動物的腎上腺皮質、卵巢、精巢和肝中，P450蛋白質含量較高。許多P450蛋白已進行了純化及對其特性進行了很好的描述。它們的比活已經測定。最近，已經發表了許多有關這方面的綜述，如K.Ruckpaul和H.Rein(編)，「細胞色素P450」和P.R.Ortiz de Montellano(編)「細胞色素P450、結構、機制和生物化學。」細胞色素P450蛋白的特徵在於用一氧化碳還原後，在450nm處有特異性最大吸收。在原核生物中，P450蛋白既可和膜結合也可存在於細胞質中。就目前對細菌P450蛋白的詳細研究(如P450meg和P450cam)表明，在其羥化活性中涉及一種鐵氧還蛋白和一種鐵氧還蛋白還原酶。對真核生物的兩類P450蛋白質，即Ⅰ和Ⅱ型已進行了描述。兩者的不同點在於1.亞細胞定位Ⅰ型定位於微粒體部分，而Ⅱ型位於線粒體內膜上。
2.將電子傳遞給P450蛋白的途徑Ⅰ型通過NADPH由P450還原酶還原，而Ⅱ型則通過NADPH由鐵氧化蛋白還原酶(如腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶)和鐵氧還蛋白(如腎上腺皮質鐵氧還蛋白)還原。
根據EP-A-0281245，細胞色素P450酶可從鏈黴菌中製備並用於化合物的羥化作用。
該酶以分離形式使用，這是一個相當麻煩和昂貴的方法。
JP-A-62236485(德溫特87-331234)中指出，可以將肝細胞色素P450酶的基因導入啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中並表達這些基因，以此提供可以利用其氧化活性的酶。
然而，在上述文獻中沒有說明用細胞色素P450酶來製備類固醇化合物。
按照1989.5.6所提交的申請(荷蘭)，提供了多種生產蛋白質的表達盒，這些蛋白質是在多基因系統中將便宜的類固醇起始物氧化成稀有昂貴的終產物所必需的，其中，這種轉化是在一些天然系統中通過多酶催化和輔助因子中介的轉化完成的。該發明的表達盒可用於最終產生進行這些多步轉化的多基因系統。
因此，一方面，該發明涉及能在重組的宿主細胞中表達異源DNA編碼序列的表達盒，這裡所說的編碼序列編碼一種酶，該酶能單獨或與另外的蛋白質一起，在膽甾醇轉化成氫化可的松的生物途徑中催化一個獨立的氧化步驟。因此，本發明的表達盒包括在重組宿主中能產生下列蛋白質的基因盒，這些蛋白質是側鏈裂解酶(P450SCC);腎上腺皮質鐵氧還蛋白(ADX);腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(ADR);3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶(3β-HSD);類固醇17α-羥化酶(P45017α);NADPH細胞色素P450還原酶(RED);類固醇-21-羥化酶(P450C21);和類固醇11β-羥化酶(P45011β)。
前文所提到的申請還披露了用這些載體或該發明的表達盒轉化的重組宿主細胞，生產上述酶和用它們進行氧化的方法，在培養肉湯中使用所述宿主細胞進行特異氧化的方法和含有用該方法製備的化合物的藥物組合物。
特別是該申請還涉及製備和培養適於在大規模生化生產反應器中採用的細胞，以及使用這些細胞進行化合物的氧化作用的方法，尤其是用於如圖1所示的類固醇的生產。圖示的每個反應可分別進行。包括在多步反應中的一些步驟的相互交換。優選的宿主是微生物，但是也可利用其他細胞，如可以是在細胞培養中或活的轉移基因動植物組織中的植物或動物細胞。用載體對合適的受體細胞(最好是合適的微生物細胞)進行遺傳轉化可獲得這些細胞，這些載體含有的DNA序列編碼與膽甾醇轉化為氫化可的松有關的蛋白，包括側鏈裂解酶(P450SCC)、腎上腺皮質鐵氧還蛋白(ADX)、腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(ADR)、3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶(3β-HSD)、類固醇-17α-羥化酶(P45017α)、NADPH細胞色素P450還原酶(RED)、類固醇-21-羥化酶(P450C21)和類固醇-11β-羥化酶(P45011β)。有些宿主細胞本身已能以足夠的水平產生一種或多種必需蛋白質，因此，它們只需用補充的DNA序列轉化。這種可能的自身蛋白為鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶、P450還原酶和3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶。
已經選擇了一些合適的DNA源，以得到編碼與膽甾醇轉化為氫化可的松有關的蛋白的序列。編碼與膽甾醇轉化為氫化可的松有關的所有蛋白的一個合適的DNA來源是脊椎動物的腎上腺皮質組織，如牛腎上腺皮質組織。由各種微生物也能得到有關的DNA，如從睪丸素假單胞菌(Pseudomonastestosteroni)，灰色肉性鏈黴菌(Streptomycesgriseocarneus)或類固醇短杆細菌(Brevibacteriumsterolicum)得到編碼3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶的DNA和從Curvularia lunata或布累克氏瘦克銀漢黴菌(Cunninghamella blakesleeana)得到編碼與11β-脫氧皮甾醇的11β-羥化作用有關的蛋白的DNA。分離編碼牛P450SCC、牛P45011β蛋白或微生物的等同蛋白、牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白、牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶、3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶(牛或微生物的)、牛P45017α、牛或微生物的牛P450C21和NADPH細胞色素P450還原酶的DNA序列，分離步驟如下1，真核序列(cDNA)a.由合適的組織製備全RNA。
b.將含多聚A+的RNA轉錄成雙鏈cDNA，連接到噬菌體載體中。
c.得到的cDNA文庫用32P標記的對所需cDNA特異的寡聚物進行篩選，或用一種特異性(125I標記的)抗體對異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖(IPTG)誘導的λ-gt11cDNA文庫進行篩選。
d.將陽性噬菌斑形成單位(Pfu)的cDNA插段插入合適的載體中以確定-用核苷酸測序法得到的cDNA的完整長度。
2.原核基因a.由一個合適的微生物製備基因組DNA。
b.為了得到DNA文庫，將DNA片段克隆到合適的載體中，並對一種合適的大腸桿菌宿主進行轉化。
c.得到的DNA文庫用32P標記並對目的基因特異的寡聚物進行篩選，或用一種特異(125I標記的)抗體對IPTG誘導的λ-gt11cDNA進行篩選。
d.分離陽性集落的質粒，將DNA插段亞克隆入合適的載體內以證明-基因的整個長度。
注根據改進的方法，通過稱為聚合酶鏈反應(PCR)(Saiki等人，Science239487-491，1988)的方法，用兩種特異性寡聚物擴增特異的cDNA(真核序列)或基因(原核序列)。然後，再將擴增的cDNA或DNA插入合適的載體中。
提供了一種合適的表達盒，其中，根據前述分離的異源DNA被置於適當的轉錄和轉譯的調控序列之間，使得DNA能在合適的宿主細胞環境中表達，以提供所需的一種或多種蛋白質。在這些起始控制序列後也可以含有一個分泌信號序列。
必須通過所述的表達盒將合適的調控序列與結構DNA一起導入。通過用含有調控序列(它與相關宿主一致，並以可操縱方式與所需表達的編碼序列連接)的載體轉化合適的宿主細胞，可以使表達變為可能。
另外，採用了存在於宿主基因組中合適的控制序列。用這樣的載體轉化合適的宿主細胞也可使表達成為可能，此載體含有的所需蛋白的編碼序列與宿主的序列相連接，使它與宿主基因組以這樣的方式形成同源重組體，即使宿主控制序列適當地控制導入DNA的表達。
正象一般所理解的那樣，術語「控制序列」包括對以可操縱方式連於其上的編碼序列表達的合適調節是必要的所有DNA片段，例如操縱基因、增強子和尤其是啟動子和控制轉譯的序列。
啟動子可受或可以不受環境調節的控制。原核生物的合適啟動子有例如trp啟動子(由色氨酸的喪失來誘導)、lac啟動子(由乳糖類似物IPTG誘導)、β-內醯胺酶啟動子和噬菌體衍生的Pl啟動子(由溫度變化誘導)。此外，尤其適用於在桿菌中表達的有用啟動子有α-澱粉酶、蛋白酶、Spoz、Spac和φ105的啟動子以及合成的啟動子序列。優選的啟動子是在圖5中表示的啟動子，用「HpaⅡ」表示。適於在酵母中表達的合適啟動子有3-磷酸甘油酸激酶啟動子，以及其他糖酵解酶的啟動子和乙醇脫氫酶和酵母磷酸酶的啟動子。轉錄延長因子(TEF)和乳糖酶的啟動子也是合適的。哺乳動物表達系統通常採用來自病毒的啟動子(如腺病毒啟動子和SV40啟動子)，但是它們還包括可調節啟動子(如金屬硫因啟動子，它由重金屬或糖皮質激素的濃度控制)。近來，以病毒為基礎的昆蟲細胞表達系統和以如胭脂鹼合成酶啟動子這樣的植物細胞啟動子為基礎的表達系統也是適宜的。
轉譯控制序列在原核生物系統中有一個核糖結合位點(RBS)，而在真核生物系統中，轉譯可由含有如AUG這樣的起始密碼子的核苷酸序列來控制。
除了必需的啟動子以外，許多其他的控制序列，包括調節終止(如真核生物系統中的多聚腺苷化序列)的序列可用於表達的調控。某些系統含有增強子，這些序列對於表達來說是有利的，但多數情況下不是必需的。
另一方面，前文提到的申請中還涉及各種載體，這些載體可用於轉化宿主細胞。
一組載體用pGBSCC-n表示，其中n為1至17的任何整數，這些載體是為編碼P450SCC酶的DNA專門設計的。
根據特殊的具體方案，載體pGBSCC-7被設計成能夠攜帶編碼pGBSCC/ADX-1的進一步異源基因，所述pGBSCC/ADX-1編碼P450SCC和ADX兩種蛋白，這兩種蛋白都是以具有功能的形式產生的。
另一組載體用pGB17α-n表示，其中n為1至5的任何整數，它們是為編碼P45017α酶的DNA專門設計的。
還有一組載體用pGBC21-n表示，其中n是1至9的任一整數，它們是為編碼P450C21酶的DNA專門設計的。
還有另一組載體用pGB11β-n表示，其中n為1-4的任何整數。
根據該發明的另外一個方面，選擇了能接受該發明的載體並使得導入DNA表達的合適宿主細胞。在培養轉化的宿主細胞時，與膽甾醇轉化為氫化可的松有關的蛋白質出現在其細胞成分中。可用DNA雜交方法證明所需DNA的存在，用RNA雜交方法證明它們的轉錄，通過免疫檢測法證明它們的表達，通過在體外或體內與起始化合物一起保溫以檢測氧化產物的存在，從而證明它們的活性。
優選的宿主是轉化的微生物，尤其是細菌(更優選的是大腸桿菌和桿菌和鏈球菌)和酵母(如酵母屬和Kluyveromyces)。在植物和動物(包括昆蟲)中還有其他合適的宿主生物，用它們的分離細胞進行細胞培養，如COS細胞、C127細胞、CHO細胞和Spodoptera frugiperda(Sfg)細胞。另外還可採用轉化基因的動物或植物。
一種特殊的重組宿主細胞是導入了該發明的兩個或更多表達盒(如pGBSCC/ADX-1)，或已由一個至少編碼兩種異源蛋白的表達盒轉化的細胞，使得細胞能產生至少兩種與圖1中途徑有關的蛋白。
所製備的新細胞不僅能產生與類固醇的氧化作用有關的蛋白質，以最終得到氫化可的松，而且完全能使用這些蛋白，以就地氧化加至培養液中的相應的類固醇，以完成所期望的轉化作用。類固醇是優選的底物。用異源DNA轉化的細胞尤其適用於與圖1中提到的類固醇培養，包括其他的甾醇如β-巖甾醇。結果獲得被氧化的類固醇。
由於在宿主細胞中存在許多由異源DNA編碼的與圖1途徑有關的蛋白質，因此有可能發生多種生物化學轉化，包括甾醇的側鏈裂解和/或C11、C17、C3和C21的氧化修飾。因此，該發明的表達盒可用於構建一個多基因系統，該系統能以圖1所示的順序同時進行多步驟的細胞內連續轉化。可能必須在所需的宿主中導入一些表達盒，全部基因盒編碼了所需的蛋白質。在某些情況中，所述途徑涉及的一種或多種蛋白質可能已存在於宿主中，它(們)作為天然蛋白發揮相同的活性作用。例如，在宿主中可能已經存在鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶和P450還原酶。在這些情況下，只有剩下的酶才必須通過重組轉化作用提供。
直到前不久，還沒有人成功地製備一個多基因系統，以能夠在一個生化方法中完成至少兩步圖1所示的生化途徑。
按照本發明，在一個宿主生物中克隆了編碼如下所述蛋白質的基因，該蛋白質能夠催化類固醇分子的兩個獨立的氧化作用，特別是圖1所示的蛋白。實際上，本發明已經實現了在同一宿主生物體內克隆如下兩種蛋白質，即負責類固醇17α羥基化和類固醇C21羥基化的蛋白質，並且該宿主生物能以功能形式表達所述蛋白。另外，本發明還提供了一種方法，在該方法中。培養在發酵介質中的轉化微生物能在類固醇分子的兩個不同位置進行氧化，以氧化該介質中存在的類固醇底物。尤其是提供了引入17α和21羥基基團的一步方法。
優選的宿主生物是Kluyveromyceslactis，但也可使用其他的宿主生物，尤其是微生物(特別是在前文提到的那些)。更具體地說，CN89104208所描述的微生物很適於克隆和表達圖1所示生化途徑的基因。
一種製備能進行多步類固醇氧化的宿主的方法是用兩個或多個載體(每個載體都含有用於一個氧化步驟的基因)轉化宿主。
另一種獲得宿主的方法是用一個載體轉化宿主，該載體所含有的表達盒包括所有編碼多步氧化反應所需的蛋白的基因。
根據本發明，該表達盒含有至少兩種結構基因，每種側接有合適的控制序列。一種典型的表達盒含有編碼P45017α蛋白和P450C21蛋白(pGB17-α/C21-1)的DNA。
利用本發明的方法及本領域其他的已知方法，有可能製備類似的表達盒，及含有該表達盒的宿主細胞，利用該宿主細胞可以在一步發酵過程中進行其他的多步類固醇氧化作用，以最終將膽甾醇轉化為氫化可的松。
附圖中所用的縮寫字母R1，EcoRⅠ;H，HindⅢ;K，KpnⅠ;X，XbaⅠ;Rv，EcoRV;SⅠ，SacⅠ;B，BamHⅠ;SⅡ;SacⅡ;Sal，SalⅠ;Xh，XhoⅠ。
圖1概括說明了哺乳動物腎上腺皮質中進行的膽甾醇向氫化可的松連續轉化的各步驟中所涉及的蛋白質。
圖2是表達盒pGB17α-5的物理圖。
圖3是表達盒pGBC21-9的物理圖。
圖4表示表達盒pGB17α/C21-1的構建，它含有P45017α和P450C21的編碼序列，它們都是由乳糖酶啟動子驅動的。
通過下列實例對本發明做進一步的描述，但所舉實例不應認為是對本發明的限制。
實例1構建編碼牛細胞色素P450類固醇17α-羥化酶和牛細胞色素P450類固醇C21-羥化酶的表達盒並將其轉化至酵母菌K.lactis中。
(a)表達盒的構建用SacⅡ和HindⅢ(部分)消化CN89104208(實例14)中所述的表達盒pGB17α-5(圖2)，利用Klenow DNA聚合酶填平粘性末端。分離含有部分乳糖酶啟動子、編碼P45017α的序列和乳糖酶終止子的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳純化，然後將其插入CN89104208(實例19)所述的pGBC21-9(圖3)中，pGBC21-9首先經XbaⅠ消化使其線性化。並用Klenow DNA聚合酶填平粘性末端。所獲得的表達盒pGB17α/C21-1(圖4)具有單一的SacⅡ限制性位點，因為在側接於P45017α序列的乳糖酶啟動子中的SacⅡ限制位點被填充反應所破壞。
(b)K，lactis的轉化如CN89104208實例5(c)中所述方法，用在單一的SacⅡ限制位點被線性化的pGB17α/C21-1轉化K，lactisCBS2360。進一步對轉化株17α/C21-101的P45017α和P450C21進行體內與體外活性分析(見實例2和實例3)。
實例2K.lactis 17α/C21-101中的P45017α和P450C21的體外活性把實例1中得到的K.lactis17α/C21-101、CN89104208(實例14)中所述的K.lactis17α-101和K.lactisCBS2360置於100ml培養基D中培養。在培養基D中，每升蒸餾水含有酵母膏(Difco)10克Bacto腖(Oxoid)20克右旋糖20克pH＝6.5滅菌並冷卻至30℃後，加入溶於1毫升蒸餾水(膜過濾滅菌)中的25mg geneticin(G418 Sulphate，Gibco Ltd)。培養物在30℃培養72小時。離心收集細胞(4000xg，15分鐘)用磷酸緩衝液(50mMPH7.0)衝洗沉澱並離心收集細胞(4000xg，15分鐘)。將沉澱置於磷酸緩衝液中(50mMPH7.0)，得到每毫升溼重0.5g的懸浮液。用聲處理(Braun Labsonic 1510;12×1minute，50W)破碎懸浮液。通過離心除去未破碎的細胞(12000xg 15分鐘)。
在NADPH存在的條件下，通過測定17α、21二羥基孕甾酮的產生鑑定無細胞提取液中的P45017α和P450C21活性。檢測混合物中含有以下溶液溶液A50mM磷酸鉀緩衝液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA，2mMNADPH，5mM葡萄糖-6-磷酸和每毫升16單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(NADPH再生系統)。
溶液B(底物)在磷酸鉀緩衝液(75mM，PH7.5)中含有在10%(v/v)TergitolTMNP40/乙醇(1∶1 v/v)溶液中的80μM〔4-14C〕孕甾酮(30Ci/mole)膠囊溶液。
檢測時，首先將75μl溶液A與50μl溶液B和125μl無細胞提取液混合。在30℃輕輕攪拌混合物。保溫60分鐘後抽取50μl試樣，並加至由100μl甲醇和50μl氯仿組成的混合液中。隨後再加入100μl氯仿和100μl水。通過離心收集氯仿層(5000xg，2分鐘)，並用100μl氯仿再次提取水/甲醇層。合併兩個氯仿層並進行乾燥。將乾燥產物溶於100μl乙腈/水(9∶1，v/v)溶液中，並且採用HPLC柱(ChrompackLichr.10RP18，250×4.6mm)和乙腈/水(58∶42，v/v)混合液對50μl試樣進行洗脫。用流閃計數器和紫外探測器檢測洗脫液中的類固醇底物和產物。所收集組分的放射活性通過液閃計數器測定。
利用此檢測法，發現由K.lactis17α/C21-101獲得的無細胞提取液產生了17α、21二羥基孕甾酮，而從K.lactis17α-101和K.lactisCB2360獲得的無細胞提取液卻不能產生。由K.lactis17α-101產生的主要產物是17α羥基孕甾酮。
實例3K.lactis17α/C21-101中的P45017α和P450C21的活體活性用實例1中的K.lactis17α/C21-101和K.lactisCBS2360接種25ml培養基D。在培養基D中每升蒸餾水含有酵母膏(Difco)10克Bacto腖(Oxoid)20克右旋糖20克PH＝6.5在滅菌並冷卻至30℃後，將溶解於1ml蒸餾水(膜過濾滅菌)中的25mggeneticin加入到1升培養基D中。
然後將含有底物〔4-14C〕孕甾酮的溶液100μl加入到25ml完全培養基中。該底物溶液在10%(v/v)TergitolTMNP40/乙醇(1∶1 v/v)中每毫升含有800μg〔4-14C〕孕甾酮(8Ci/mole)。
培養物在旋轉搖床中(240rpm)於30℃下生長，在0和68小時後取2ml樣品。每份樣品和2ml甲醇混合。在4℃萃取24小時後，將混合物離心(4000xg，15分鐘)。採用HPIC柱(ChrompackLichr.10RP18，250×4.6mm)和乙腈/水(58∶42，v/v)對所得到的200μl上清液進行洗脫。
檢測洗脫液中的類固醇底物和產物。通過液閃計數法測定所收集組分的放射活性。從K.lactis17α/C21-101培養68小時的培養物中獲得的一個組分清楚表明17α、21二羥基孕甾酮的存在，而在對照菌株K.lactisCBS2360的培養物中沒有產生這種化合物。
實例4編碼蛋白質P450SCC和ADX的表達盒的構建及其在酵母菌K.lactis中的轉化和表達(a)表達盒的構建將表達盒pGBADX-1(CN89104208實例23)用SacⅡ和HindⅢ(部分地)消化，利用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。分離含有部分乳糖酶啟動子(但仍保持其功能)、ADX編碼序列和乳糖酶終止子的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳純化，然後將其插入pGBSCC-7中，pGBSCC-7首先經XbaⅠ消化使其線性化(參見CN89104208實例5(6))，並用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。按照這樣一種方式進行構建，即產生單一的SacⅡ限制性位點，這個位點是將質粒轉移至K.lactis中所必需的。這個單一的SacⅡ限制性位點位於鄰接SCC序列的乳糖酶啟動子序列中，而鄰接ADX序列的乳糖酶啟動子中的SacⅡ限制性位點被填充反應破壞。所得到的表達盒pGBSCC/ADX-1含有分別被乳糖酶啟動子驅動的SCC和ADX的編碼序列。
(b)K.lactis的轉化如CN89104208實例5(c)中所述方法，用在單一的SacⅡ限制性位點被線性化的15μgpGBSCC/ADX-1進行K.lactisCBS2360的轉化。選擇一種轉化株(SCC/ADX-101)進行SCC及ADX表達的研究。
(c)轉化株K.lactisSCC/ADX-101的分析如CN89104208實例5(d)中所述方法，從SCC/ADX-101及對照株CBS2360培養物製備細胞蛋白質成分，並對它們進行SDS/PAGE及Western印跡分析。印跡分別用SCC和ADX的特異抗體探測。與對照株相比較，轉化株SCC/ADX-101的細胞蛋白組分顯示出另外兩個期望長度(分別為53和14KDa)的譜帶，表明蛋白質SCC與ADX的表達。轉化株SCC/ADX-101中兩種蛋白質的表達水平可與只表達一種蛋白質的轉化株中觀察到的水平相比擬(對於SCC，參見CN89104208圖15A，泳道3;對於ADX參見CN89104208圖39，泳道5)。轉化株SCC/ADX-101體外的SCC活性及ADX活性在CN89104208實例28中有描述。
權利要求
1.一種重組宿主細胞及其後代，包括微生物、植物和動物的細胞，該宿主細胞及其後代除了含有合適的控制序列外，還含有編碼蛋白質的異源DNA，所述蛋白質選自由能夠單獨或協同一種或多種其他蛋白催化類固醇至氫化可的松的生化轉化中的氧化步驟的蛋白質所構成的一組，該步驟選自下列轉化過程膽固醇向孕(甾)烯醇酮的轉化孕(甾)烯醇酮向孕甾酮的轉化；孕甾酮向17α-羥基孕甾酮的轉化；17α-羥基孕甾酮向11-脫氧皮(甾)醇的轉化；11-脫氧皮(甾)醇向氫化可的松的轉化；或者，所述蛋白質是由天然蛋白構成的一組中選出，即由類固醇轉化成氫化可的松的生化轉化中的天然蛋白；側鏈裂解酶(P450SCC)；腎上腺皮質鐵氧還蛋白(ADX)；3β-羥基類固醇脫氫酶/異構酶(3β-HSD)；腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(ADR)；類固醇-17α-羥化酶(P45017α)；NADPH細胞色素P450還原酶(RED)；類固醇-21-羥化酶(P450C21)；類固醇-11β-羥化酶(P45011β)；其特徵在於，異源DNA編碼至少兩個可表達的蛋白，它們催化至少兩個獨立的氧化步驟。
2.按照權利要求1的重組宿主細胞，其特徵在於，異源DNA編碼序列來自牛。
3.按照權利要求1或2的重組宿主細胞，其特徵在於，異源DNA編碼至少P45017α和P450C21蛋白。
4.按照權利要求1-3中任一項的重組宿主細胞，其特徵在於宿主是微生物。
5.按照權利要求4的重組宿主細胞及其後代，其特徵在於，所述的宿主是酵母、Kluyveromyces或桿菌(Bacillus)或大腸桿菌之一。
6.一種由重組宿主細胞製備蛋白質混合物的方法，包括在能使蛋白質形成並在培養物中積累的條件下在營養培養基中培養重組宿主細胞，其特徵在於，所述的重組宿主是權利要求1-5之一所述定義的。
7.一種在體外對化合物進行選擇性多步氧化的方法，該方法包括使待氧化的化合物與至少兩種蛋白質與能進行所述氧化和在培養液中積累氧化化合物的條件下保溫，接著回收被氧化的化合物，其特徵在於，所述的蛋白質由權利要求6的方法生產。
8.一種對化合物進行選擇性多步氧化的方法，該方法包括在該化合物存在下培養重組宿主細胞，所用培養條件能使所需要的氧化作用發生並使氧化化合物在培養液中積累，隨後回收被氧化的化合物，其特徵在於，所述的重組宿主細胞是權利要求1-5中的任何一種。
9.按照權利要求7或8的方法，其特徵在於至少有兩個氧化步驟發生，它們選自裂解類固醇的側鏈、將3-羥基-5(6)-脫氫基團氧化和異構成3-氧代-4(5)-脫氫基團、17α-羥基21-羥基或11β-羥基基團的插入。
10.按照權利要求7或8的方法，其特徵在於，氧化作用的結果是將C21-羥基基團和C17α-羥基基團同時導入孕甾烯醇酮或孕甾酮。
11.一種表達盒，它可在權利要求1-5中任一項的重組宿主中表達，並含有至少兩種編碼權利要求1所定義的蛋白質的基因。
12.按照權利要求11的表達盒，其特徵在於異源DNA編碼P450-17α和P450C21酶，並且所述的表達盒為pGB17α/C21-1。
13.含有一種活性化合物的藥物製劑，它是按照權利要求9-12中任一項所述方法製備的。
全文摘要
本發明提供了一種基團工程構建的宿主細胞，該細胞能夠同時氧化類固醇，優選同時導入17α-羥基和C21-羥基基團。特別是氧化是用細胞進行的，在該細胞中插入有編碼至少兩種涉及膽固醇向氫化可的松生化轉化的蛋白質。合適的宿主細胞包括桿菌屬、酵母屬或Kluyreromyces菌珠。該新的宿主細胞適於膽固醇、孕甾烯醇酮、孕甾酮和17α-羥基-孕甾酮的生化氧化，它們都是所說的生化轉化的中間產物。該宿主細胞還可用於最終製備多基因系統，該系統能一步將膽固醇轉化為氫化可的松。
文檔編號C12N9/02GK1042567SQ89108378
公開日1990年5月30日 申請日期1989年9月23日 優先權日1988年9月23日
發明者哈門·斯利克會斯, 格拉杜斯·考那利斯·瑪麗·塞爾頓, 埃裡克·巴斯廷·斯邁爾 申請人:吉斯特-布羅卡迪斯公司