聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子及其製備方法

2023-06-09 12:45:51 1

專利名稱：：聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及生物領域，具體的說，涉及聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子及其製備方法。
背景技術：
：睫狀神經營養因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)最初在雞胚眼球脈絡膜、睫狀體和虹膜中被發現，因能促進體外培養的雞胚副交感睫狀節神經元存活而命名。CNTF是約200個胺基酸組成的多肽激素，由成熟個體外周神經中的施旺細胞、星形細胞中的一些亞細胞群體和中樞神經系統分泌的胞液分子而非由靶組織分泌。CNTF最初被認為是睫狀神經節副交感神經元培養時的營養因子，並由此命名。它可以促進多種祌經細胞和祌經膠質細胞的生長與分化，包括運動祌經元、感覺祌經元、交感神經元、海馬神經元和少突細胞。90年代初期，人們將CNTF用於治療肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的實驗研究。Regeneron的研究者們對一組ALS患者進行臨床研究，研究開始不久便發現病人們的體重大大降低。ALS病人反饋資料表明，使用藥物組體重比安慰劑組明顯降低，且這一結果持續整個研究過程。Regeneron公司根據這一結果決定在肥胖症領域對其進行實驗。結果表明，CNTF在體內可與下丘腦的特異性受體結合，激活抑制食慾的關鍵信號通道，抑制進食慾望且使機體不會產生飢餓感，從而降低體重。動物實驗結果顯示，CNTF不僅能使肥胖基因有缺陷的肥胖小鼠迅速減肥，而且對因高脂肪飲食造成的肥胖小鼠也有減肥作用(參見BluherS，MoschosS,BulenJJr等人，Ciliaryneurotrophicfac2torAx15altersenergyhomeostasis,decreasesbodyweight,andimprovesmetaboliccontrolindiet2inducedobeseandUCP12DTAmice，丄D勵由，2004，53(1l):第2787-2796頁)。已完成的臨床研究表明，CNTF不僅具有與化學藥物同水平的療效，而且解決了化學藥物毒副作用大的問題。但是，CNTF也存在著半衰期短，具有一定的免疫原性等特點。因此存在著進一步改善CNTF臨床治療效果的要求。為了使CNTF的使用更加方便、作用更加持久，更適於長期使用。本發明人考慮用可溶性高分子聚合物對其進行化學修飾，可以有效改變其體內分布和藥動學性質。用高分子化學修飾劑對蛋白質和肽類分子進行化學修飾已經成為生物技術與生物醫學領域的研究熱點。在眾多的高分子化學修飾劑中，以線性的、無毒的、無免疫原性的和具有雙歧聚合物性質的聚乙二醇對蛋白質的化學修飾最引人注目。用作修飾蛋白的PEG實際上是單甲氧基聚乙二醇，該化合物在水和有機溶劑中具有高溶解性，不揮發，無味，體內應用無免疫原性和抗原性，長期肌肉或皮下注射無不良反應。體內代謝穩定，低的腎臟排除率，具有很高的柔韌性；生物相容性己經得到FDA的認證。蛋白質被PEG修飾後，偶聯的PEG鏈在蛋白分子表面產生空間位阻效應，減弱了血液中各種水解酶對蛋白的水解作用，從而有效地延長了蛋白在循環系統內的保留時間。由於PEG空間位阻的存在，可阻止藥物與蛋白表面的抗原決定簇接觸，從而減少被免疫系統清除的機率，降低蛋白質的抗原性和免疫原性。親水性PEG與蛋白質共價結合後，可使蛋白質顆粒表面形成較厚的水化層，阻止其凝集、沉澱，增加蛋白的穩定性。國內外對PEG修飾蛋白質類藥物的研究主要集中於腺苷脫氨酶、天冬醯胺酶、白介素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、超氧化物歧化酶、水蛭素、尿激酶、血紅蛋白、幹擾素、重組人生長激素、促紅細胞生成素等。目前，國內外未見高分子化學修飾劑修飾CNTF的報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子。本發明的目的還在於提供該聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子的製備方法。為了實現本發明的目的，本發明提供了一種修飾的睫狀神經營養因子，其中每一分子睫狀神經營養因子與至少一分子聚乙二醇類聚合物通過化學鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺琥珀酸酯(mPEGSuccinimidylsuccinate,mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺碳酸酯(mPEGSuccinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(mPEGtresylate)、甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-propionaldehyde)、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺a甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀醯亞胺(mPEG2-NHS)、甲氧基聚乙二醇-馬來醯亞胺(mPEG2-MAL)或甲氧基聚乙二醇-乙醛(mPEG2-ALD);所述聚乙二醇類聚合物的分子量為lkD100kD。優選的是，每一分子所述睫狀神經營養因子與12個分子的所述聚乙二醇類聚合物通過化學鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯或甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺a甲基丁酸酯；所述聚乙二醇類聚合物的分子量為5kD50kD。更優選的是，每一分子所述睫狀神經營養因子與一分子甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯通過化學鍵相連接；甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯的分子量為20kD。這些聚乙二醇類聚合物都是本領域技術人員所熟知的，並且是市售的。例如，可購自北京凱正生物工程發展有限公司、NEKTAR公司等。所述睫狀神經營養因子是天然的睫狀神經營養因子。優選的是，所述睫狀神經營養因子是天然的睫狀神經營養因子的突變體或變異體。更優選的是，所述睫狀神經營養因子的突變體為睫狀神經營養因子第17位的半胱氨酸突變為丙氨酸或絲氨酸而形成的突變體；睫狀神經營養因子第63位的穀氨醯胺突變為精氨酸而形成的突變體；睫狀神經營養因子中去除C末端的15個胺基酸而形成的變異體；或同時將睫狀神經營養因子第17位的半胱氨酸突變為丙氨酸、將63位的穀氨醯胺突變為精氨酸、去除C末端的15個胺基酸後而形成的變異體。CNTF是本領域技術人員所熟知的，重組人睫狀神經營養因子(rhCNTF)是市售的，例如可購自武漢中美科技有限公司(中國湖北省武漢市)。CNTF突變體或變異體的製備方法在現有技術中也是已知的，例如CN1687413A、CN1760205A、CN1844392A、CN1760205A中就公開了睫狀神經營養因子的各種突變體及其突變方法。本發明還提供了一種修飾的睫狀神經營養因子的製備方法，包括將聚乙二醇類聚合物與濃度為0.5mg/mL5.5mg/mL的睫狀神經營養因子溶液混合，聚乙二醇類聚合物與睫狀神經營養因子的摩爾比為1:120:1，調節反應體系的pH為79.5，在437。C反應0.54小時。其中，所述聚乙二醇類聚合物與所述睫狀神經營養因子優選按照摩爾比5:1混合，反應溫度優選為室溫，反應時間優選為2小時，所述睫狀神經營養因子溶液的濃度優選為2.0mg/mL，所述反應體系的pH優選為8。本發明的所述的修飾的睫狀神經營養因子能夠保持修飾前睫狀神經營養因子的生物學活性，同時又比修飾前睫狀神經營養因子具有更好的穩定性、血漿清除率更低、體內循環半衰期更長、毒副作用顯著降低。因此，作為治療藥物，它比修飾前睫狀祌經營養因子更合適。同時，免疫原性實驗表明，修飾的睫狀神經營養因子能夠顯著降低睫狀神經營養因子的免疫原性。圖1為示出構建用於表達rhCNTF的表達載體的圖。圖2為示出rhCNTF的SDS-PAGE圖，其中M為分子量標準，1為rhCNTF。圖3為示出反應時間對修飾反應的影響的圖，其中1為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SMB-mPEG修飾的rhCNTF;3為SC-mPEG修飾的rhCNTF。圖4為示出反應溫度對修飾反應的影響的圖，其中1為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SC-mPEG修飾的rhCNIT;3為SMB-mPEG修飾的rhCNTF。圖5為示出反應體系pH值對修飾反應的影響的圖，其中1為SC-mPEG修飾的rhCNTF;2為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;3為SMB-mPEG修飾的rhCNTF。圖6為示出rhCNTF溶液濃度對修飾反應的影響的圖，其中1為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SC-mPEG修飾的rhCNTF;3為SMB-mPEG修飾的rhCNTF。圖7為示出聚乙二醇類聚合物與rhCNTF的摩爾比對修飾反應的影響的圖，其中l為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SMB-mPEG修飾的rhCNTF;3為SC-mPEG修飾的rhCNTF。圖8為QS-HighPerformance離子交換層析圖。圖9為QS-HighPerformance離子交換層析後的SDS-PAGE電泳圖，其中h純化前樣品；2-3:峰l;4-7:峰2;M:分子量標準；8-11:峰3;12-13:峰4。圖IO為示出飛行質譜法測精確分子量的圖。圖11為等電聚焦電泳圖，其中1為ACNTF，M為IEF標準，2、3、4為rhCNTF-SPA-mPEGl。圖12為rhCNTF在200-700nm的紫外-可見光譜掃描圖。圖13為rhCNTF-SPA-mPEGl在200-700nm的紫外-可見光譜掃描圖。圖14為示出使用rhCNTF期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HPCXt組，2為陰性對照組，3為rhCNTF組(0.3mg/kg)。圖15為示出使用rhCNTF期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HP04組，2為陰性對照組，3為rhCNTF組(l.Omg/kg)。圖16為示出使用rhCNTF-SPA-mPEG1期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HP04組，2為陰性對照組，3為rhCNTF-SPA-mPEGl組(0.3mg/kg)。圖17為示出使用rhCNTF-SPA-mPEG1期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HP04組，2為陰性對照組，3為rhCNTF-SPA-mPEGl組(1.0mg/kg)。圖18為示出使用rhCNTF對小鼠攝食的影響的圖，其中1為陰性對照組，2為rhCNTF組(0.3mg/kg)。圖19為示出使用rhCNTF對小鼠攝食的影響的圖，其中1為陰性對照組，2為rhCNTF組(1.0mg/kg)。圖20為示出使用rhCNTF-SPA-mPEGl對小鼠攝食的影響的圖，其中1為陰性對照組，2為rhCNTF-SPA-mPEGl組(0.3mg/kg)。圖21為示出使用rhCNTF-SPA-mPEGl對小鼠攝食的影響的圖，其中l為陰性對照組，2為rhCNTF-SPA-mPEGl組(1.0mg/kg)。圖22為rhCNTF及rhCNTF-SPA-mPEGl在4T條件下第0天的SDS-PAGE電泳圖，其中1、2、4、7為rhCNTF，3、5、6為rhCNTF-SPA-mPEGl，M為分子量標準。圖23為rhCNTF及rhCNTF-SPA-mPEGl在4"C條件下第12天的SDS-PAGE電泳圖，其中1、2、4、7為rhCNTF,3、5、6為rhCNTF-SPA-mPEGl。圖24為示出rhCNTF促進TF-1CN5al細胞增殖曲線的圖。圖25為示出rhCNTF-SPA-mPEGl促進TF-1CN5al細胞增殖曲線的圖。圖26為rhCNTF禾BrhCNTF-SPA-mPEGl的免疫印跡分析圖，其中l為蛋白標準，2為rhCNTF-SPA-mPEGl,3為rhCNTF。圖27為示出不同時間點rhCNTF的血清濃度的圖。圖28為示出不同時間點rhCNTF-SPA-mPEGl的血清濃度的圖。具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。實施例1rhCNTF的製備根據天然的人CNTF基因序列(來自GENEBANK)，設計兩條引物PI:GACCATATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG;P2:GGTCAGCTCGGATCCTTAATCAGTGCTTGCCAC。以人cDNA為模板(方法參見金冬雁等譯，《分子克隆實驗指南提取》U996版)，第463-469頁)，力口入P1禾口P2引物，在50(^1的反應體系(10x緩衝液，含Mg2+5.0ji1，dNTP(2.5mmol/L)l.O(il'PI(30(imol/L)1.0|li1，P2(30pmol/L)1.0|il，PfuDNA聚合酶1U，加超純水至總體積至50.0|il}中，95'C變性30秒後，於93匸變性30秒、55'C退火60秒、68'C延伸2分鐘，重複上述循環30次，最後68。C延伸8分鐘；反應結束後，快速降溫至4。C。將上述PCR產物用Ndel和BamHI(均購自北京中原公司)雙酶切後，與經同樣酶切(Ndel和BamHI)的表達載體pET32a十(購自Novagen公司)相連接，構建出了原核表達載體pET32a+/CNTF。參見圖1。用表達載體pET32a+ZCNTF轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Novagen公司，貨號69387-3)後，製備出CNTF工程菌(命名為pCNTF/BL21)。將CNTF工程菌(pCNTF/BL21)劃線接種於LB瓊脂平板(胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaC15g，瓊脂10g，加水定容至1L，高壓滅菌，當溫度降到5(TC左右時加入Amp至終濃度為200|ig/ml，取20ml倒培養皿，凝固後即成LB瓊脂平板)，37t:培養過夜。從培養過夜的LB平板上挑選單菌落接種於含LB的試管中，37"C培養10h，然後轉種至含200mlLB培養液(胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl5g，加水定容至1L，高壓滅菌，分裝三角瓶，每瓶200ml)的三角瓶中，37'C培養過夜製得種子液。次日，將種子液按1%比例接種於含30升2YT培養液的50L發酵罐中，發酵培養基為2YT[胰蛋白腖(bacto-tryptone，購自OXOID公司)480g，酵母提取物(bacto-yeastextract,購自OXOID公司)300g，NaCl150g，加入蒸餾水溶解，5NNaOH體調節pH至7.0，定容到30升，高壓滅菌(0.12Mpa，121°C，30min餘下同)]，培養體積30L。控制發酵溫度37'C、轉速250450r/min、通氣量3050L/min、pH7.3，培養至A600-1.2左右後，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4mM進行誘導。繼續培養5h，終止發酵，收集菌體，儲存於-3(TC冰箱中待用。從-30'C冰箱中取出發酵菌體，按1%比例用0.02mol、pH7.2的磷酸鹽溶液重新懸浮菌體，通過高壓勻漿破碎細菌，5000r/min離心15min，收集包涵體沉澱，再經變性[每克包涵體使用400ml變性液(8M鹽酸胍、50MmTris-Hcl、pH8.3)處理4小時]、復性(通過透析法復性，透析液為50mMTris-Hcl、pH8.3，透析時間為24小時)、Q-SepharoseHP層析步驟進行純化而獲得rhCNTF。做SDS-PAGE並用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行分析，對rhCNTF進行純度鑑定，由圖2可見，rhCNTF純度可達100%。實施例2修飾物的製備以及修飾條件的選擇所使用的聚乙二醇類聚合物如下所示SPA-mPEG，購自北京凱正生物工程發展有限責任公司，批號20060101，分子量20KD;SC-mPEG，購自北京凱正生物工程發展有限責任公司，批號20051019，分子量20KD;SMB-mPEG，購自NEKTAR公司，批號PT-02E-13，分子量20KD。在以下實施例中，除非另有說明，所使用的rhCNTF溶液與PEG溶液均是使用0.02M磷酸鹽緩衝液(pH為7.2)作為溶劑配製而成的。在本實施例中，結合單個分子聚乙二醇類聚合物的rhCNTF用rhCNTF-PEGl表示。1、反應時間對修飾反應的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)lml，按摩爾比20:1的比例加入SPA-mPEG，室溫反應。分別於0.5、1、2、3、4h取出0.2ml。做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產物中所佔比例的高低作為指標，採用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進行測定。實驗結果表明，反應時間從0.5、1、2、3、4h，rhCNTF-PEGl所佔的比例分別為24.7%、30%、39.6%、28.5%、27.4%(圖3)。反應時間為2h時，rhCNTF-PEGl所佔的比例最高。當反應時間大於2h時，rhCNTF-PEGl在整個修飾物中所佔的比例下降。因此，綜合考慮，選擇2h作為修飾反應的時間。同等條件下，SPA-mPEG修飾後CNTF-PEG1所佔的比例高於其他兩種修飾劑修飾後所佔的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。2、反應溫度對修飾反應的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)0.6ml，按摩爾比10:1的比例加入SPA-mPEG，混勻，分裝於3支試管中，每管0.2ml，分別於4'C、25°C、37。C反應2h，做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產物中所佔比例的高低作為指標，採用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進行測定。實驗結果表明，在溫和的實驗條件下(4T:或25'C)修飾反應即可發生(圖4)。隨著溫度的升高，rhCNTF-PEGl所佔的比例有所增加，分別為50.6%、51.8%、54.2%，但增加的幅度不明顯。為了儘可能的保證rhCNTF的活性，選擇25"C作為反應溫度。同等條件下，SPA-mPEG修飾後CNTF-PEG1所佔的比例高於其他兩種修飾劑修飾後所佔的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。3、溶液pH值對修飾反應的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)0.6ml，分別取1ml置於6支試管中，調節pH值分別為7.0、7.4、8.0、8.4、9.0、9.2。每支試管中以摩爾比10:1的比例分別加入SPA-mPEG，常溫反應2h。做分離膠12%,濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產物中所佔比例的高低作為指標，採用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進行測定。實驗結果表明，pH值在7.0、7.36、8.03、8.42、9.0、9.23的條件下，rhCNTF-PEGl所佔的比例分別為20%、29.8%、35.9%、32%、30.3%、27.1%(圖5)。其中以pH值在8.03時rhCNTF-PEGl所佔的比例最高。為了方便，選擇pH值8作為反應體系的pH值。同等條件下，SPA-mPEG修飾後CNTF-PEG1所佔的比例高於其他兩種修飾劑修飾後所佔的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。4、CNTF濃度對修飾反應的影響取rhCNTF(5.33mg/ml)0.4ml，取出0.15ml加入0.05ml透析液將其濃度稀釋到4.0mg/ml，立刻稀釋3次，使5支試管中的蛋白濃度分別為5.33mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml，體積為0.2ml。按摩爾比10:1的比例分別加入SPA-mPEG，混勻，常溫反應2h。做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產物中所佔比例的高低作為指標，採用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進行測定。實驗結果表明，蛋白濃度在5.43mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml時，rhCNTF-PEGl所佔的比例分別為24.6%、29.4%、39.9%、36.5%、32.9%(圖6)。當蛋白濃度為2.0mg/ml時，rhCNTF-PEG1所佔的比例最高。因此選擇蛋白濃度為2.0mg/ml作為修飾反應中rhCNTF的最適濃度。同等條件下，SPA-mPEG修飾後CNTF-PEG1所佔的比例高於其他兩種修飾劑修飾後所佔的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。5、反應物摩爾比對修飾反應的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)5ml，置於5支試管中，每管1ml。分別按摩爾比1:1、1:2、1:5、1:10、1:20的比例加入SPA-mPEG,混勻，常溫反應2h。做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產物中所佔比例的高低作為指標，採用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進行測定。聚乙二醇類聚合物與rhCNTF的摩爾比對修飾反應影響較為顯著。在SPA-mPEG與rhCNTF的摩爾比為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1時，rhCNTF-PEGl所佔的比例分別為27.3%、37%、37.3%、38.4%、28.4%(圖7)。由圖6可知，摩爾比為5:1為修飾反應的最佳摩爾比。同等條件下，SPA-mPEG修飾後CNTF-PEG1所佔的比例高於其他兩種修飾劑修飾後所佔的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。綜上所述，選擇SPA-mPEG作為修飾劑，修飾條件為反應時間2小時，反應溫度25。C，反應體系的pH為8，rhCNTF溶液的濃度為2.0mg/mL，SPA-mPEG與rhCNTF的摩爾比為5:1。實施例3SPA-mPEG修飾的rhCNTF的製備及純化取實施例1製備的rhCNTF進行透析，透析液為0.1mol/L的四硼酸鈉水溶液，pH值為9.2。在4。C下透析48h,中間換液4次，透析後取樣，Lowry法測定rhCNTF蛋白濃度。然後取透析後的rhCNTF(2mg/ml)200ml，按摩爾比1:5的比例加入SPA-mPEG，在25°C條件下，反應體系的pH值控制在8,反應時間為2h，加入6NHC1終止反應。為了更好的將未修飾的rhCNTF、結合單分子SPA-mPEG的rhCNTF和結合多分子SPA-mPEG的rhCNTF分開，採用QS-HighPerformance離子交換層析進行研究。取上述終止反應後的溶液40ml，上柱分離。色譜條件如下層析介質為QS-HighPerformance,柱長為2.6x40cm，柱體積159ml，流動相為分別含有50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM的NaCl的O.OIM磷酸鹽緩衝液(pH7.2)，流速1.0ml/min、檢測波長280nm。收集各洗脫峰。從色譜圖(圖8)中可以看出有四個洗脫峰(其中第四個峰為鹽峰)。經SDS-PAGE鑑定(圖9)，峰1主要為結合多分子SPA-mPEG的rhCNTF，峰2為結合單分子SPA-mPEG的rhCNTF蛋白(下文中稱為rhCNTF-SPA-mPEGl)，峰3為未反應的rhCNTF。選擇性的收集目的蛋白，合併，濃縮後透析於5mMNa2HP04溶液中，-20°。保存，用於下一步修飾物的評價。實施例4rhCNTF-SPA-mPEGl的理化特性鑑定1、純度以及分子量測定用飛行質譜法測定精確分子量，結果見圖10。由飛行質譜檢測結果可知(圖10)，在分子量為21084.65處出現一個峰，該峰為rhCNTF;在41441.38處出現另一個峰，該峰為rhCNTF-SPA-mPEGl，與理論分子量一致。2、修飾率的測定如HabeebA.F.S.A，《AnalyticalBiochemistry〉〉(1966)14，第328-336頁禾口JohnB,etal.《AnalyticalBiochemistry》(1997)，254，第254-262頁中所述，經TNBS法測定rhCNTF-SPA-mPEGl的修飾率為14.76%。rhCNTF分子中含有7個賴氨酸(Lys)，由於SPA-mPEG是針對賴氨酸(Lys)殘基進行非定點修飾，因此從其修飾率可以推斷出SPA-mPEG修飾的rhCNTF為結合單個SPA-mPEG分子的rhCNTF。3、等電點的測量由等電聚焦電泳結果可知，rhCNTF的等電點為5.8，與文獻報導的相一致。採用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀計算rhCNTF-SPA-mPEGl的等電點為5.98。電泳圖見圖11。4、紫外-可見光譜掃描結果對rhCNTF以及rhCNTF-SPA-mPEGl在200-700nm之間進行紫外一可見光譜掃描，結果顯示，rhCNTF(圖12)與rhCNTF-SPA-mPEGl(圖13)的最大吸收光譜均為279.5nm。說明單個SPA-mPEG分子對rhCNTF的修飾沒有改變rhCNTF的空間構象。圖12和圖13的檢測結果分別見表1、2。表1tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16此外，從小鼠的攝食變化圖可知(圖1821)，給藥期間小鼠的攝食量明顯減少，停藥後攝食量稍有增加。因此可見，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEG1均能抑制小鼠的食慾而使小鼠體重降低。實施例6穩定性的研究分別取蛋白濃度為0.8mg/ml的rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl放置於4"C，每隔6天做一次SDS-PAGE電泳(分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，上樣量為15^1，恆壓110V,電泳1.5小時)，通過電泳圖譜比較rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的穩定性。從SDS-PAGE電泳圖譜(圖22、23)中發現，在不加任何保護劑的情況下，rhCNTF在4。C條件下僅12天即可完全降解，而rhCNTF-SPA-mPEGl在4°C下12天也不見任何的降解帶。說明SPA-mPEG修飾rhCNTF後能夠增加rhCNTF的穩定性。實施例7rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl體外活性的研究將TF-1CN5al細胞(購自美國ATCC，貨號為CRL-2512)常規培養於GM-CSF條件(100mlRPMI1640中含500ng的GM-CSF)的培養液中，實驗時收集對數生長期的細胞，用無血清的RPMI1640(購自invitrogen公司，貨號為11875-101)洗液洗滌1遍，然後用10%小牛血清的RPMI1640培養液調整細胞數為1.0xlO、每孔加50^1細胞懸液，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl按2倍系列稀釋後，每孔加入50|ul，以無血清RPMI1640培養基作對照，培養板在37°C、5%C02條件下培養48h後，每孔加入5mg/ml的四甲基偶氮唑鹽(MTT，購自北京中原公司)溶液20pl，繼續培養4-6h後，加入酸性異丙醇(異丙醇-HCl，pH4.0)溶液，混勻後在酶標儀上比色，測定波長為570nm，參比波長為630nm。每個實驗取3次實驗的平均結果。TF-1CN5al是一個依賴於GM-CSF的細胞系，其細胞表面具有rhCNTF高親和力受體，所以CNTF能促進TF-1CN5al細胞的增殖。將不同濃度的rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl加入TF-1CN5al細胞培養物中，觀察細胞的生長情況，發現1.967xl0'7ng/ml-1.22xl(r5ng/ml的rhCNTF即明顯促進其增殖；9.766xl(T5ng/ml-0.00625ng/ml的rhCNTF-SPA-mPEGl能促進其增殖，見圖24、25。實驗結果說明，rhCNTF-SPA-mPEG1的體外活性基本沒有受到影響。實施例8修飾物的免疫反應性以rhCNTF的單克隆抗體作為特異性抗體進行蛋白質免疫印跡實驗，研究免疫反應性。用rhCNTF的單克隆抗體(購自SIGMA公司)作為結合抗體，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為酶標二抗，以二氨基聯苯胺作為反應體系(實驗方法參見金冬雁等譯，《分子克隆實驗指南提取》(1996版)，第888-897頁)。首先將rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl做SDS-PAGE電泳，分離膠濃度12%,濃縮膠濃度4%，上樣量為15^1，恆壓110V，電泳1.5小時，終止電泳，將凝膠轉入NC膜上，加二氨基聯苯胺反應，用水終止反應。結果表明(圖26)，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均能夠與rhCNTF的單克隆抗體特異性結合，說明它們具有相似的免疫反應性。修飾後沒有改變rhCNTF與抗體結合的特性。從實驗結果還可以看出，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均僅出現單一條帶，也說明了rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均為單一組分，也間接說明了rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl具有高的純度。實施例9rhCNTF禾PrhCNTF-SPA-mPEGl的藥物代謝動力學研究使用pH7.2的0.02M磷酸鹽緩衝液將rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的蛋白濃度分別稀釋到0.2-0.3mg/ml，過濾除菌。家兔(2.02.5kg/只)隨機分為兩組，每組三隻，每隻每天皮下給藥一針，兩種樣品的給藥劑量均為200ug/kg。注射rhCNTF組分別於給藥後的0.5、1、3、5、6、7、24小時於耳緣靜脈採血0.5ml。分別收集於小管中，4匸過夜，第二天離心收集血清，置-2(TC冰箱中保存。採用雙抗體夾心法(方法為取CNTF單克隆抗體(購自SIGMA公司)(l|ig/ml)包被酶標板，4。C過夜，洗滌l次；5%卵清白蛋白封閉，37t:孵育60分鐘，洗滌3次。加入2倍系列稀釋的兔血清，每孔10(^1，37'C孵育60分鐘，洗滌3次；加入酶標記的CNTF多克隆抗體(1:100)每孔lO(Hil，37t:孵育60分鐘，洗滌6次。加入底物液ioow，室溫放置15分鐘，終止液每孔50pl，492nm波長下檢測OD值)，測定收集到的血清中rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的濃度。結果見圖27、.28，血清中rhCNTF的濃度在lh達到最高值，隨後開始下降，7小時血清中濃度己經很低。24h的血清濃度已經基本降至基線。說明rhCNTF在體內很快被降解。rhCNTF-SPA-mPEGl在4h達到最高值，隨後開始下降；從血清濃度趨勢圖上看，rhCNTF-SPA-mPEGl在48h血清中仍有分布。說明聚乙二醇類聚合物修飾後延長了rhCNTF在血循環中存在的時間。藥物代謝動力學分析結果表明(表4),rhCNTF-SPA-mPEGl的半衰期有一定的提高，為原來的16倍；清除率下降，為原來的36.26%;血槳峰濃度提高到原來的2.57倍；時量曲線下面積提高到原來的2.76倍。rhCNTF的達峰時間為lh，rhCNTF-SPA-mPEGl的達峰時間為4h。結果說明，應用聚乙二醇類聚合物對rhCNTF進行修飾，能夠明顯改善rhCNTF的藥物代謝動力學性質。表4tableseeoriginaldocumentpage19實施例10rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免疫家兔後抗體水平(ELISA法測定)rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免疫家兔後，均產生了不同程度的結合抗體。二種免疫原均在免後第二周誘導產生結合抗體，抗體滴度在免後四周達到最高水平，隨後開始逐漸下降。對rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免後四周的結合抗體滴度進行統計學分析表明，rhCNTF-SPA-mPEGl誘導產生的結合抗體的能力明顯低於rhCNTF，差異具有顯著性(P<0.05)，見表5。本實驗證明，用聚乙二醇類聚合物對rhCNTF進行修飾可以顯著降低rhCNTF的免疫原性。表5_抗體滴度rhCNTFrhCNTF-SPA-mPEGl免後1周--免後2周5079.68±2.23251.98±4.96免後3周40637.46±1.49634.96±2.23免後4周51200±2.00a765.17±3.08b免後5周25600±2.00660.38±5.63免後6周20318.73±2.88634.96±4.231.avs.bP<0.05;2."-"檢測不到。權利要求1.一種修飾的睫狀神經營養因子，其特徵在於每一分子睫狀神經營養因子與至少一分子聚乙二醇類聚合物通過化學鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺α甲基丁酸酯、甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀醯亞胺、甲氧基聚乙二醇-馬來醯亞胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛；所述聚乙二醇類聚合物的分子量為1kD～100kD。2.如權利要求1所述的修飾的睫狀神經營養因子，其特徵在於每一分子所述睫狀神經營養因子與12個分子的所述聚乙二醇類聚合物通過化學鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯或甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺a甲基丁酸酯；所述聚乙二醇類聚合物的分子量為5kD50kD。3.如權利要求2所述的修飾的睫狀神經營養因子，其特徵在於每一分子所述睫狀神經營養因子與一分子甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯通過化學鍵相連接；甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺丙酸酯的分子量為20kD。4.如權利要求13任意一項所述的修飾的睫狀神經營養因子，其特徵在於，所述睫狀神經營養因子是天然的睫狀神經營養因子。5.如權利要求13任意一項所述的修飾的睫狀神經營養因子，其特徵在於，所述睫狀神經營養因子是天然的睫狀神經營養因子的突變體或變異體。6.如權利要求5所述的修飾的睫狀祌經營養因子，其特徵在於，所述睫狀神經營養因子為睫狀神經營養因子第17位的半胱氨酸突變為丙氨酸或絲氨酸而形成的突變體；睫狀神經營養因子第63位的穀氨醯胺突變為精氨酸而形成的突變體；睫狀神經營養因子中去除C末端的15個胺基酸而形成的變異體；或同時將睫狀神經營養因子第17位的半胱氨酸突變為丙氨酸、將63位的穀氨醯胺突變為精氨酸、去除C末端的15個胺基酸後而形成的變異體。7.—種修飾的睫狀神經營養因子的製備方法，包括將聚乙二醇類聚合物與濃度為0.5mg/mL5.5mg/mL的睫狀神經營養因子溶液混合，其中所述聚乙二醇類聚合物與所述睫狀神經營養因子的摩爾比為1:120:1，反應體系的pH為79.5，在437"C下反應0.54小時。8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述聚乙二醇類聚合物與所述睫狀神經營養因子按照摩爾比為5:1混合，反應溫度為室溫，反應時間為2小時。9.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述睫狀神經營養因子溶液的濃度為2.0mg/mL。10.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述反應體系的pH為8。全文摘要本發明涉及一種聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子及其製備方法。該方法包括將聚乙二醇類聚合物與睫狀神經營養因子混合反應即可。本發明所述的聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經營養因子保持了睫狀神經營養因子在體內的活性，並且毒副作用顯著降低，同時實驗結果表明，修飾後的睫狀神經營養因子能夠明顯改善睫狀神經營養因子的藥物代謝動力學性質，並且顯著降低睫狀神經營養因子的免疫原性。文檔編號A61K47/48GK101185762SQ20071019854公開日2008年5月28日申請日期2007年12月11日優先權日2007年12月11日發明者倪道明,江姜,張振龍申請人:北京生物製品研究所