一種豬圓環病毒2型實時螢光定量pcr檢測方法

2023-06-09 17:26:21

專利名稱：一種豬圓環病毒2型實時螢光定量pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬分子生物學領域，具體涉及一種豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法。
背景技術：
目前，常用於檢測病毒的方法有酶聯免疫吸附反應(ELISA)、定性PCR技術和實時螢光定量PCR技術。ELISA靈敏度較高，但檢測結果可能包括假陽性。定性PCR技術成本低、易於操作，但靈敏度比較低，且由於其擴增產物需通過凝膠電泳分析，極易產生汙染。實時螢光定量PCR技術由於其高靈敏度、高特異性且操作簡便而被廣泛應用。實時螢光定量PCR技術是一種在PCR體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。其化學原理包括探針類和非探針類兩種。探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用螢光染料或者特殊設計的弓I物來指示擴增的增加。實時螢光定量PCR技術主要有以下三種螢光標記1) SYBR Green I SYBR Green I是一種結合於小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合後，其螢光大大增強。STOR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號， 而不摻入鏈中的STOR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。STOR Green I在核酸的實時檢測方面有很多優點，由於它與所有的雙鏈DNA相結合，不必因為模板不同而特別定製，利用螢光染料可以指示雙鏈DNA熔點的性質，通過熔點曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，區分非特異擴增，進一步還可以實現單色多重測定。此外，由於一個PCR產物可以與多分子的染料結合，因此STOR Green I 的靈敏度很高。但是，由於STOR Green I與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度後螢光的變化可以幫助降低非特異產物的影響，同時，由解鏈曲線來分析產物的均一性有助於分析由STOR Green I得到定量結果。2)分子信標分子信標是一種在靶DNA不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此髮夾結構中，位於分子一端的螢光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結構中，螢光基團被激發後不是產生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為螢光諧振能量傳遞(FRET)。由於「黑色」淬滅劑的存在，由螢光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個螢光基團是淬滅劑，其釋放能量的波長與螢光基團的性質有關。分子信標的莖環結構中，環一般為15-30個核苷酸長，並與目標序列互補；莖一般 5-7個核苷酸長，並相互配對形成莖的結構。螢光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接於另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致於在復性溫度下，模板不存在時形成莖環結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對後，分子信標的構象改變使得螢光基團與淬滅劑分開。當螢光基團被激發時，它發出自身波長的光子。3) TaqMan探針=TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的螢光與目的序列的擴增相關，它設計為與目標序列上遊引物和下遊引物之間的序列配對。螢光基團連接在探針的5』 末端，而淬滅劑則在3』末端。當完整的探針與目標序列配對時，螢光基團發射的螢光因在 3』端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5』外切酶活性將探針進行酶切，使得螢光基團與淬滅劑分離。iTaqMan探針適合於各種耐熱的聚合酶，如DyNAzymeTM II DNA聚合酶。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的螢光基團不斷積累。因此，螢光強度與擴增產物的數量呈正比關係。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法。即首先通過DNAstar軟體在豬圓環病毒2型基因組內尋找保守序列，在獲得的保守區域設計特異性引物和探針，然後通過擴增獲得大量的目的片段。將目的片段和PGEM-T easy 載體連接，取連接產物做模板，以設計好的特異引物做PCR檢測。基於TaqMan探針特異性地結合於目的片段上，所以整個過程中監測到的螢光量的增加代表了目的片段的生成，保證了實驗的特異性，以解決豬圓環病毒2型快速、準確檢測問題。本發明所述的豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法，包括如下步驟1)特異性引物和探針的設計和合成本發明首先設計併合成了一個探針和兩個特異性上、下遊引物分別由 invitrogen公司和上海生物工程有限公司合成，即將pGEM-T easy載體的3' -T突出端與擴增得到的目的片段的5' -A突出端配對，引物上沒有加酶切位點，目的片段和載體的連接為直接的T-A連接。所述上、下遊引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具體如下上遊引物5' -CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3『，下遊引物5' -CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3『，所述探針的序列如SEQ ID No 3所示，具體如下FAM-5『 -CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3『 -TAMRA ；2)目的片段的獲得配製PCR反應體系在0. 25ml印pendorf管中加入2XPCR Mix 12. 5 μ 1，上下遊引物各 1 μ 1，基因組 DNA 2μ 1 ；PCR 反應程序為94°C 5min，94°C lmin，52°C lmin， 72°C lmin,72°C 10min，35循環。回收並純化PCR產物，即為目的片段。3)配製連接反應體系在0. 5ml印pendorf管中加入快速連接緩衝液5 μ 1, pGEM-T easy載體1 μ 1，PCR 產物2 μ 1，T4連接酶1 μ 1，補加去離子水至總體積10 μ 1。室溫孵育Ih或者4°C孵育過夜。4)轉化並提取質粒模板將連接產物轉化至JM109受體細胞中，塗板，選出陽性質粒克隆，測序。所提取的質粒即可作為後續試驗的模板。5)定性PCR檢測將陽性質粒、去離子水和待測樣品作為模板做定性PCR檢測。6)定量PCR檢測將梯度稀釋的標準質粒作為模板進行定量PCR檢測，取得標準曲線，然後以待測樣品DNA和標準品為模板做定量PCR檢測。本發明的檢測方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強、重複性好。另外，本發明設計了不同的特異性引物和探針，使實時螢光定量PCR檢測檢測的定量極限和檢測極限極低， 大大提高了實時螢光定量PCR檢測方法的靈敏度。本發明的一種豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法可以製備成試劑盒。使用該試劑盒，就能簡單地進行豬圓環病毒2型的快速檢測和定量檢測。


圖1是本發明的豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法的標準曲線，橫坐標為質粒模板拷貝數的對數，縱坐標為循環閾值。圖2是本發明的豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法的定量檢測圖，橫坐標為模板拷貝數量，縱坐標為循環閾值。圖3是本發明的豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法的檢測極限圖，橫坐標為循環數，縱坐標為每一時刻的螢光量。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。實驗試劑和材料豬圓環病毒2型、JM109受體細胞、豬流行性腹瀉PED、豬傳染性胃腸炎TGE、豬輪狀病毒RV、豬藍耳病PRRS和豬圓環病毒1型PCVl均由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所提供，pGEM-T easy載體(Promega公司)，其餘試劑均購於TaKaRa Biotechnology Co. ,Ltd.。膠回收試劑盒(上海生物工程有限公司)，ABI PRISM 3730 GeneticAnalyzer型測序儀(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.), ABI 7500 型定量 PCR 儀(美國生物應用系統公司)。實施例11)目的片段的獲得在豬圓環病毒2型檢測研究中，以基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μ 1 :2XPCR Mix 12. 5 μ 1，上下遊引物各1 μ 1，基因組DNA2 μ 1，去離子水補加至總體積 25 μ 1。PCR 反應程序為94°C 5min，94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，72°C 10min，35 循環，通過瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，並用膠回收試劑盒純化PCR產物，即得目的片段。2)配製連接反應體系在純化的2 μ 1 PCR產物中，pGEM-T easy載體1 μ 1，加入T4連接酶1 μ 1，快速連接緩衝液5 μ 1，去離子水1 μ 1，組成10 μ 1的連接反應體系。室溫孵育Ih或者4°C孵育過夜。連接液過柱純化，以20 μ 1 ddH20洗脫。3)轉化並提取質粒模板回收純化的PCR產物與pGEM-T easy載體連接得到的產物轉化至JM109受體細胞中，塗板，選出陽性質粒克隆。陽性質粒克隆提交invitrogen公司測序，測序儀為ABI PRISM 3730Genetic Analyzer，採用載體通用引物雙向測序。序列BLASTN比對分析，149bp 對應豬圓環病毒BJ0804的1094-1242區域。
4)定性PCR檢測分別以待測樣品、陽性質粒和去離子水為模板做檢測。PCR反應體系為10XPCR 緩衝液(10Xbuffer)2. 5μ l，25mM氯化鎂(MgCl2) 2 μ 1，三磷酸脫氧核苷酸_Ρ)2μ 1，上下遊引物各1μ 1，1.25U DNA聚合酶，模板1 μ 1，去離子水補加至總體積25 μ 1。PCR反應程序為:94°C 5min，94°C 30S，60°C 20S，72°C 20S，72°C 7min，30 循環，被測樣品中 78. 3%為豬圓環病毒2型陽性。5)定量PCR檢測將提取的陽性質粒梯度稀釋(101(1-10°)作為標準品，使用ABI 7500定量PCR 儀，按以下反應體系和反應程序做定量PCR檢測，得出標準曲線(參見圖1)。PCR反應體系10Xbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl24. 5 μ 1，dNTP 2. 5 μ 1，上下遊引物各 1 μ 1，探針
0.5 μ 1,1. 25U DNA聚合酶，模板DNA 1 μ 1，去離子水補加至總體積25 μ 1。PCR反應程序 940C IOmin,94°C 15S，60°C 40S，45 循環。以IO7, IO5, IO3,100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，1 拷貝 / 微升的質粒為模板做定量PCR，PCR反應體系和PCR反應程序同上。結果表明，建立的定量PCR方法的定量極限為100拷貝/微升(參見圖2)，檢測極限為10拷貝/微升(參見圖3)。6)重複性檢測以107，105，IO3拷貝/微升的標準品為模板，每個濃度重複十次進行實驗內重複性檢測，以同樣濃度的標準品做十次實驗間重複性檢測，結果顯示，變異係數分別在0. 59%到
1.05%和 1. 9%到 4. 2%之間。7)特異性檢測以 IO8, IO7, IO6, IO5, IO4 拷貝 / 微升的標準質粒，PED、TGE、RV、PRRS 的 cDNA 和 PCVl 的DNA為模板做特異性檢測，結果顯示，實驗過程中非豬圓環病毒2型質粒模板的反應中無螢光量的增加，本發明設計的特異性引物和探針具有很好的特異性。以建立的螢光定量PCR體系作臨床樣品檢測，結果顯示，97. 3%的樣品為豬圓環病毒2型陽性，比定性PCR檢測的檢出率提高了 18%。以上實驗結果表明，本發明所述的一種豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法簡單、快速、準確、特性性強、重複性好，並且檢測的定量極限和檢測極限極低，可準確定量檢測出豬圓環病毒2型，起到預防和控制豬圓環病毒2型的流行。最後應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍中。
權利要求
1.一種豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟1)首先設計與合成特異性上、下遊引物和探針所述上、下遊引物的序列如SEQID No 1和SEQ ID No 2所示，具體如下上遊引物 5' -CGGATATTGTAKTCCTGGTCGTA-3 『，下遊引物 5' -CCTGTCCTAGATTCCCCTATTGATT-3 『，所述探針的序列如SEQ ID No 3所示，具體如下FAM-5『 -CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC-3『 -TAMRA ；2)目的片段的獲得配製PCR反應體系，按照PCR反應程序進行反應得到目的片段；3)配製連接反應液；4)轉化並提取質粒模板；5)定性PCR檢測；6)定量PCR檢測。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述PCR反應體系為2XPCRMix 10-13 μ 1，上下遊引物各0.9-1. 3 μ 1，基因組DNA 1_2 μ 1，去離子水補加至總體積25 μ 1 ； 所述 PCR 反應程序為-MV 5min，94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，72°C lOmin，30-40 循環。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述連接反應液為2X快速連接緩衝液4-6μ l，pGEM-T easy載體1 μ 1，PCR產物1_3 μ 1，T4連接酶1 μ 1，補加去離子水至總體積 10 μ 1。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述定性PCR檢測的反應體系為 IOXbuffer 2. 0-3. O μ 1，25mM MgCl2 2 μ 1, dNTP 2 μ 1，上下遊引物各 0. 9-1. 3 μ 1，1. 25U DNA聚合酶，模板1-2μ1，去離子水補加至總體積25μ1 ；所述定性PCR檢測的反應程序為 940C 5min，94°C 30S,60°C 20S,72°C 20S,72°C 7min，25-35 循環。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述定量PCR檢測的反應體系為 IOXbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl2 4. 5 μ 1，dNTP 2. 5 μ 1，上下遊引物各 0. 9-1. 3 μ 1，探針 0. l-Ι.Ομ 1，1.25U DNA聚合酶，模板DNA 1 μ 1，去離子水補加至總體積25 μ 1 ；所述定量 PCR 檢測的反應程序:94°C 10min,94°C 15S，60°C 40S，40-50 循環。
6.權利要求1所述的檢測方法在製備螢光定量PCR試劑盒中的應用。
7.權利要求1所述的檢測方法在快速和定量檢測豬圓環病毒2型中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬圓環病毒2型實時螢光定量PCR檢測方法，包括以下步驟1)首先設計併合成特異性引物和探針；2)目的片段的獲得配製PCR反應體系，按照PCR反應程序進行反應得到目的片段；3)配製連接反應液；4)轉化並提取質粒模板；5)定性PCR檢測；6)定量PCR檢測。本發明的檢測方法簡單、快速、靈敏度高、特性性強、重複性好，並且檢測的定量極限和檢測極限極低，靈敏度高，可準確定量檢測出豬圓環病毒2型，達到預防和控制豬圓環病毒2型流行的作用。
文檔編號C12Q1/70GK102382900SQ201010271159
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者劉啟文, 吳瀟, 唐雪明, 施偉, 朱宏, 李春華, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 鄒勇, 陶世如, 韓芳婷 申請人:上海市農業科學院