一種簡便的相思開放式瓶內扦插生根方法與流程
2023-06-09 17:49:16
本發明屬於植物栽培技術領域，特別涉及一種簡便的相思開放式瓶內扦插生根方法。
背景技術：
無性繁殖能最大限度保持其優良母株的優良性狀，利於優樹優良性狀的固定。扦插是木本植物重要的無性快繁方式之一。已開展了許多林木樹種的扦插技術研究(孫紅梅，2011；胡勐鴻等，2014；王書勝等，2015)，扦插生根機理研究則是一大熱點，不定根的形成受到許多內在因子和環境因子影響的，包括光強、光質和溫度，植物激素和碳水化合物等(Leakey，2004)。學者以炭化稻殼和泥炭按體積比1：1混合為扦插基質，研究歐洲雲杉扦插生根過程中內源激素和酚類物質的變化(歐陽芳群等，2015)；以泥炭土和珍珠巖(1：3)為扦插基質，研究糙葉杜鵑生根過程中內源激素及營養物質的變化(趙雲龍等，2013)。扦插生根機理的研究卻一直沒有得到很好的進展，主要原因是學者們的研究，主要是在各種不同的扦插基質上進行，如黃心土、砂石、蛭石、泥炭土等等成分複雜的物質，這些基質成分的未知性，導致了生根機理研究結果的不準確。因此，建立一種全新的扦插技術體系，對今後深入、準確地開展扦插生根機理研究具有十分重要的意義。
本課題組長期從事相思育種理論和技術方面的研究(黃烈健等，2013；胡峰等，2015；施瓊等，2015；黃烈健等，2015)，建立了完善的相思扦插技術體系(易敏等，2010；易敏等，2011；易敏等，2014)，但仍以成分未知的基質進行扦插，扦插技術並未得到實質性的改變，導致對相思扦插生根機制的研究受限。
技術實現要素：
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在於提供一種簡便的相思開放式瓶內扦插生根方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現：
一種簡便的相思開放式瓶內扦插生根方法，包括如下步驟：
當年生腋芽飽滿枝條為外植體，消毒，浸泡，再開放式接種至扦插基質中，培養。
所述的相思為馬大雜種相思(A.mangium×A.auriculiformis)、馬佔相思(Acacia mangium)或大葉相思(A.auriculiformis)。
將當年生腋芽飽滿枝條，洗衣粉水浸泡，刷淨後流水衝洗，剪成長2.0～3.0cm帶腋芽的莖段。優選取中部帶葉莖段(即第3～5腋芽帶葉莖段)。
所述的洗衣粉水浸泡的時間優選為10～60min；所述的流水衝洗的時間優選為1～3h。
進一步的，所述的洗衣粉水浸泡的時間為30min；所述的流水衝洗的時間為2h。
所述的消毒是以多菌靈進行消毒；
所述的多菌靈的濃度為0.2～1.0g·L-1；消毒的時間為1～15min。
進一步的，所述的多菌靈的濃度為0.8g·L-1；消毒的時間為3min。
所述的浸泡是用生根劑IBA浸泡；
所述的生根劑IBA的濃度優選為0.1g·L-1～1.5g·L-1。
所述的浸泡的時間優選為1～3h。
進一步的，所述的生根劑IBA的濃度為0.2g·L-1～1.4g·L-1。所述的浸泡的時間為2～3h。
進一步的，馬大雜種相思的浸泡是用生根劑IBA0.4～1.0g·L-1浸泡2～3h；更進一步的，用生根劑IBA1.0g·L-1浸泡2h；
進一步的，馬佔相思的浸泡是用生根劑IBA 0.2～1.4g·L-1浸泡2h；更進一步的，用生根劑IBA 0.6g·L-1浸泡2h；
進一步的，大葉相思的浸泡是用生根劑IBA 0.4～1.0g·L-1浸泡2～3h；更進一步的，用生根劑IBA 0.8g·L-1浸泡3h；
所述的扦插基質為百菌清0.1～1.0g·L-1+瓊脂5～8g·L-1。
進一步的，所述的扦插基質為百菌清0.2～0.8g·L-1+瓊脂5～8g·L-1；更進一步的，所述的扦插基質為百菌清0.2g·L-1+瓊脂7g·L-1；
所述的培養的條件為培養溫度為25℃±2℃，每日光照12h，光照強度2500Lx。
本發明的機理是：本研究以馬大雜種相思，馬佔相思、大葉相思採穗圃當年生枝條為外植體，將其扦插至裝入玻璃瓶的極簡化的基質中，在室內進行生根，對外植體種類及消毒方式進行研究，同時對基質中加入的抑菌劑種類和濃度進行篩選，並對促進生根的生長調節劑的種類和濃度進行篩選，獲得了成分可控的扦插基質，並能在室內進行開放式扦插培養。建立的開放式扦插方法，由於基質的成分簡單、可控制，為今後深入研究相思扦插生根機理創製了一個良好的技術平臺，同時該扦插生根技術方法，也將為其他林木樹種開展扦插生根機理研究提供很好的借鑑。
本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果：
(1)本發明對馬大雜種相思、馬佔相思、大葉相思進行瓶內扦插生根研究，以建立三種相思可帶菌進行培養，扦插基質簡單，不需特殊培養條件的瓶內生根體系。
(2)本發明中三種相思均以百菌清為適宜的抑菌劑；以中部帶葉為最佳外植體，並以多菌靈0.8g·L-1浸泡3min對外植體進行預處理，並IBA 1.0g·L-1處理2h(馬大雜種相思)、IBA0.6g·L-1處理2h(馬佔相思)、IBA 0.8g·L-1處理3h(大葉相思)，在開放的實驗臺上接種至扦插基質中，生根率均高於90％，分別為：100％，94.33％，100％。
(3)本發明在扦插基中加入抑菌劑，不使用高溫高壓滅菌、超淨工作檯，利用植物的光自養能力在無營養元素的基質上進行扦插，獲得了較高的生根率，建立了三種相思開放式瓶內生根技術體系。
附圖說明
圖1是實施例1中的抑菌劑百菌清0.2g·L-1的情況。
圖2是實施例1中的中部帶葉莖段外植體，多菌靈消毒3min的情況。
圖3是實施例1中的生根劑IBA 1.0g·L-1處理2h對生根的影響。
圖4是實施例2中的抑菌劑百菌清0.2g·L-1的情況。
圖5是實施例2中的中部帶葉莖段外植體，多菌靈消毒3min的情況。
圖6是實施例2中的生根劑IBA 0.6g·L-1處理2h對生根的影響。
圖7是實施例3中的抑菌劑百菌清0.2g·L-1的情況。
圖8是實施例3中的中部帶葉莖段外植體，多菌靈消毒3min的情況。
圖9是實施例3中的生根劑IBA0.8g·L-1，處理3h對生根的影響。
圖10是生長調節劑濃度及處理時間對馬大雜種相思扦插生根率的影響。
圖11是生長調節劑濃度及處理時間對馬佔種相思扦插生根率的影響。
圖12是生長調節劑濃度及處理時間對大葉相思扦插生根率的影響。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1
1材料方法
1.1材料
從中國林業科學研究院熱帶林業研究所馬大雜種相思16年生試驗林中選取優良單株，在優良單株上採集枝條，先通過扦插繁殖，建立採穗圃，從一年生的採穗圃中採集腋芽飽滿的枝條為研究材料。
1.2方法
1.2.1抑菌劑種類及濃度對馬大雜種相思扦插的影響
於8月剪取馬大雜種相思採穗圃的當年生腋芽飽滿枝條，將採集的枝條剪去葉片，洗衣粉水浸泡30min，刷淨後流水衝洗2h，剪成長2.0～3.0cm帶腋芽的莖段。扦插於加入抑菌劑：百菌清或多菌靈的培養基中，兩種抑菌劑分別設4個濃度：0.2，0.4，0.6，0.8g·L-1。每個處理接種24個莖段，重複3次。
1.2.2外植體類型和消毒方式對馬大雜種相思扦插的影響
將馬大雜種相思當年生腋芽飽滿枝條的第1～2腋芽莖段(上段)、第3～5腋芽莖段(中段)、分別剪成帶葉、不帶葉兩種類型的長2.0～3.0cm帶腋芽莖段，扦插於培養基中。每個處理接種21個莖段，重複3次。
1.2.3IBA、NAA、ABT濃度及處理時間對馬大雜種相思扦插的影響
馬大雜種相思：以IBA、NAA、ABT濃度0.4，0.6，0.8，1.0g·L-1，處理時間分別為：2，3h。每個處理接種24個莖段，重複3次。
1.3培養條件
培養基中添加瓊脂7g·L-1，控制pH值為6.0(抑菌劑加入前測定)，在實驗室開放的實驗臺上接種，培養溫度為25℃±2℃，每日光照12h，光照強度2500Lx。培養45d後統計褐化率、汙染率、存活率、生根率。
1.4數據處理
使用Excel，SPSS19.0對數據進行處理和方差分析，以最小顯著差數法(LSD)評價差異的顯著性。
汙染率％＝汙染數÷接種數×100％........................................①
褐化率％＝褐化數÷接種數×100％..................................②
存活率％＝存活數÷接種數×100％....................................③
總生根率％＝生根的外植體數÷總接種外植體數×100％.......................④
存活生根率％＝生根的外植體數÷存活的外植體數×100％......................⑤
其中，①+②+③＝100％。
2結果與分析
2.1抑菌劑種類及濃度對馬大雜種相思外植體的影響
從表1可以看出，2種抑菌劑對馬大雜種相思外植體的影響，總體來說，多菌靈的汙染率較百菌清的高，多菌靈不適宜作為馬大雜種相思扦插生根的抑菌劑。
而百菌清對馬大雜種相思外植體的影響，隨著濃度的升高，褐化率增加，汙染率的變化不太明顯(馬大雜種相思，在百菌清0.8g·L-1時，汙染率較為嚴重，為20.83％)，外植體存活率也顯著降低。
綜合來看，百菌清濃度為0.2g·L-1時，馬大雜種相思的外植體存活率最高，為80.55％(圖1)。
表1抑菌劑種類和濃度對3種相思扦插的影響①
①同列數據小寫字母不同表示LSD檢驗差異顯著(P<0.05)，下同。
2.2外植體類型和消毒方式對馬大雜種相思外植體的影響
從表2可以看出，馬大雜種相思不同外植體類型，採用不同的消毒方式，其褐化率、汙染率和存活率均有顯著性差異。其中，上部帶葉、中部不帶葉莖段，無論採用哪種消毒方式，它們的褐化率均顯著高於中部帶葉的莖段；而存活率則顯著低於中部帶葉的莖段。因此，中部帶葉的莖段是馬大雜種相思適宜的外植體。
馬大雜種相思的中部帶葉莖段，採用不同方式消毒，褐化率、汙染率和存活率部分有顯著差異，表現為多菌靈處理3min的效果最好(圖2)，存活率為96.83％。
表2外植體類型及消毒方式對3種相思扦插的影響①
2.3生長調節劑濃度及處理時間對馬大雜種相思扦插的影響
馬大雜種相思接種於培養基後30d左右開始生根，40d左右根伸長至4cm左右。IBA 1.0g·L-1處理2h時，開放扦插生根率最高，為100％(圖3、圖10)。三種生長調節劑處理中，IBA處理的生根效果最優，其次是ABT。IBA處理2h的效果優於3h的(表3)。IBA處理時間為2h時隨著IBA濃度的增加，生根率持續上升，直至IBA 1.0g·L-1時生根率達100％；處理時間為3h時生根率隨著IBA濃度上升呈現先上升後下降的趨勢，0.8g·L-1對應的生根率為56.03％(顯著低於此濃度2h的生根率)，且IBA濃度繼續增加，生根率急劇下降，IBA1.0g·L-1時生根率僅為13.90％。NAA處理2h，3h生根率均隨著NAA濃度的增加呈現上升趨勢，但不同處理時間和濃度對應的生根率並無顯著差異。ABT處理2h時生根率隨濃度增加不斷下降，3h時生根率隨著濃度的增加呈現先上升後下降趨勢。
表3生長調節劑濃度及處理時間對馬大雜種相思扦插生根的影響①
實施例2
1材料方法
1.1材料
從中國林業科學研究院熱帶林業研究所馬佔相思16年生試驗林中選取優良單株，在優良單株上採集枝條，先通過扦插繁殖，建立採穗圃，從一年生的採穗圃中採集腋芽飽滿的枝條為研究材料。
1.2方法
1.2.1抑菌劑種類及濃度對馬佔相思扦插的影響
於8月剪取馬佔相思採穗圃的當年生腋芽飽滿枝條，將採集的枝條剪去葉片，洗衣粉水浸泡30min，刷淨後流水衝洗2h，剪成長2.0～3.0cm帶腋芽的莖段。扦插於加入抑菌劑：百菌清或多菌靈的培養基中，兩種抑菌劑分別設4個濃度：0.2，0.4，0.6，0.8g·L-1。每個處理接種24個莖段，重複3次。
1.2.2外植體類型和消毒方式對馬佔相思扦插的影響
將馬佔相思當年生腋芽飽滿枝條的第1～2腋芽莖段(上段)、第3～5腋芽莖段(中段)、分別剪成帶葉、不帶葉兩種類型的長2.0～3.0cm帶腋芽莖段，扦插於培養基中。每個處理接種21個莖段，重複3次。
1.2.3IBA、NAA、ABT濃度及處理時間對馬佔相思扦插的影響
馬佔相思：以IBA濃度0.2，0.6，1.0，1.4g·L-1，處理時間為：2h。每個處理接種24個莖段，重複3次。
1.3培養條件
培養基中添加瓊脂7g·L-1，控制pH值為6.0(抑菌劑加入前測定)，在實驗室開放的實驗臺上接種，培養溫度為25℃±2℃，每日光照12h，光照強度2500Lx。培養45d後統計褐化率、汙染率、存活率、生根率。
1.4數據處理
使用Excel，SPSS19.0對數據進行處理和方差分析，以最小顯著差數法(LSD)評價差異的顯著性。
汙染率％＝汙染數÷接種數×100％...........................................①
褐化率％＝褐化數÷接種數×100％........................................②
存活率％＝存活數÷接種數×100％............................................③
總生根率％＝生根的外植體數÷總接種外植體數×100％........................④
存活生根率％＝生根的外植體數÷存活的外植體數×100％......................⑤
其中，①+②+③＝100％。
2結果與分析
2.1抑菌劑種類及濃度對馬佔相思外植體的影響
從表1可以看出，2種抑菌劑對馬佔相思外植體的影響，總體來說，多菌靈的汙染率較百菌清的高，多菌靈不適宜作為馬佔相思扦插生根的抑菌劑。
而百菌清對馬佔相思外植體的影響，隨著濃度的升高，褐化率增加，汙染率的變化不太明顯，外植體存活率也顯著降低。
綜合來看，百菌清濃度為0.2g·L-1時，馬佔相思的外植體存活率最高，為86.11％(圖4)。
2.2外植體類型和消毒方式對馬佔相思外植體的影響
從表2可以看出，馬佔相思不同外植體類型，採用不同的消毒方式，其褐化率、汙染率和存活率均有顯著性差異。其中，上部帶葉、中部不帶葉莖段，無論採用哪種消毒方式，它們的褐化率均顯著高於中部帶葉的莖段；而存活率則顯著低於中部帶葉的莖段。因此，中部帶葉的莖段是馬佔相思適宜的外植體。
馬佔相思的中部帶葉莖段，採用不同方式消毒，褐化率、汙染率和存活率部分有顯著差異，表現為多菌靈處理3min的效果最好(圖5)，存活率為90.48％。
2.3生長調節劑濃度及處理時間對馬佔相思扦插的影響
馬佔相思扦插於培養基中35d左右開始生根，45d左右根伸長至4cm左右。三種生長調節劑對馬佔相思生根影響效果最優的是IBA，其次是ABT，NAA效果最差(圖11)。高濃度ABT會導致高的褐化率，ABT濃度為1.0g·L-1時褐化率高達48.61％，1.4g·L-1時褐化率增加到52.78％，顯著高於其它處理。各處理的汙染率均較低，並無顯著差異。IBA、NAA處理的褐化率較低，NAA濃度增加，生根率上升，但最高生根率僅為51.39％；隨著IBA濃度增加，馬佔相思生根率先上升後下降。IBA 0.6g·L-1時和1.0g·L-1時得總生根率無顯著差異，但IBA0.6g·L-1時存活生根率最高，為94.33％，顯著高於其它處理(表4)。因此，IBA0.6g·L-1處理2h為馬佔相思開放扦插生根最優處理(圖6)，生根率為94.33％。
表4生長調節劑濃度及處理時間對馬佔相思扦插生根的影響①
實施例3
1材料方法
1.1材料
從中國林業科學研究院熱帶林業研究所大葉相思16年生試驗林中選取優良單株，在優良單株上採集枝條，先通過扦插繁殖，建立採穗圃，從一年生的採穗圃中採集腋芽飽滿的枝條為研究材料。
1.2方法
1.2.1抑菌劑種類及濃度對大葉相思扦插的影響
於8月剪取大葉相思採穗圃的當年生腋芽飽滿枝條，將採集的枝條剪去葉片，洗衣粉水浸泡30min，刷淨後流水衝洗2h，剪成長2.0～3.0cm帶腋芽的莖段。扦插於加入抑菌劑：百菌清或多菌靈的培養基中，兩種抑菌劑分別設4個濃度：0.2，0.4，0.6，0.8g·L-1。每個處理接種24個莖段，重複3次。
1.2.2外植體類型和消毒方式對大葉相思扦插的影響
將大葉相思當年生腋芽飽滿枝條的第1～2腋芽莖段(上段)、第3～5腋芽莖段(中段)、分別剪成帶葉、不帶葉兩種類型的長2.0～3.0cm帶腋芽莖段，扦插於培養基中。每個處理接種21個莖段，重複3次。
1.2.3IBA、NAA、ABT濃度及處理時間對大葉相思扦插的影響
大葉相思：以IBA濃度0.4，0.6，0.8，1.0g·L-1，NAA、ABT濃度0.4，0.6，0.8g·L-1，分別處理2h，3h。每個處理接種24個莖段，重複3次。
1.3培養條件
培養基中添加瓊脂7g·L-1，控制pH值為6.0(抑菌劑加入前測定)，在實驗室開放的實驗臺上接種，培養溫度為25℃±2℃，每日光照12h，光照強度2500Lx。培養45d後統計褐化率、汙染率、存活率、生根率。
1.4數據處理
使用Excel，SPSS19.0對數據進行處理和方差分析，以最小顯著差數法(LSD)評價差異的顯著性。
汙染率％＝汙染數÷接種數×100％....................................①
褐化率％＝褐化數÷接種數×100％....................................②
存活率％＝存活數÷接種數×100％....................................③
總生根率％＝生根的外植體數÷總接種外植體數×100％..................④
存活生根率％＝生根的外植體數÷存活的外植體數×100％................⑤
其中，①+②+③＝100％。
2結果與分析
2.1抑菌劑種類及濃度對大葉相思外植體的影響
從表1可以看出，2種抑菌劑對大葉相思外植體的影響，總體來說，多菌靈的汙染率較百菌清的高，多菌靈不適宜作為大葉相思扦插生根的抑菌劑。
而百菌清對大葉相思外植體的影響，隨著濃度的升高，褐化率增加，汙染率的變化不太明顯，外植體存活率也顯著降低。
綜合來看，百菌清濃度為0.2g·L-1時，大葉相思的外植體存活率最高，為83.33％(圖7)。
2.2外植體類型和消毒方式對大葉相思外植體的影響
從表2可以看出，大葉相思不同外植體類型，採用不同的消毒方式，其褐化率、汙染率和存活率均有顯著性差異。其中，上部帶葉、中部不帶葉莖段，無論採用哪種消毒方式，它們的褐化率均顯著高於中部帶葉的莖段；而存活率則顯著低於中部帶葉的莖段。因此，中部帶葉的莖段是3種相思適宜的外植體。
大葉相思的中部帶葉莖段，採用不同方式消毒，褐化率、汙染率和存活率部分有顯著差異，表現為多菌靈處理3min的效果最好(圖8)，存活率為100.00％。
2.3生長調節劑濃度及處理時間對大葉相思扦插的影響
大葉相思扦插於基質中25d左右開始生根，35d左右根伸長至4cm左右，最高生根率為100％。三種生長調節劑不同處理時間的扦插生根率有顯著差異，處理時間對生根的影響大於生長調節劑種類的影響(表5、圖12)。三種生長調節劑的處理時間為3h時對應的扦插生根率均高於各自處理2h時的生根率。NAA對應的生根率總體較低，其處理2h時濃度高於0.4g·L-1(生根率為39.74％)生根率大幅增加，0.8g·L-1時生根率為78.65％；處理3h時濃度的變化幾乎不會引起生根率的變化。ABT 2h時生根率隨濃度升高而升高，但最高也僅為85.00％；3h時生根率隨濃度增加先上升後下降，當濃度為0.6g·L-1時生根率最高為87.83％。IBA 3h時生根率隨濃度上升而升高，至IBA0.8g·L-1時生根率最高(100％)，IBA2h時生根率先上升後下降，最高生根率為92.28％。故大葉相思扦插生根最優生長調節劑為IBA0.8g·L-1，處理3h(圖9)。
表5生長調節劑濃度及處理時間對大葉相思扦插生根的影響①
3結論與討論
3.1結論
馬大雜種相思、馬佔相思及大葉相思扦插生根的研究並不多，且尚未見對三者進行開放扦插生根的研究。本實驗結合開放組培的思路，以一種全新的方式對三種相思進行扦插：
加入抑菌劑進行開放式培養，並不要求嚴格無菌，在整個培養環節中完全不使用高溫高壓滅菌和超淨工作檯，區別於目前開放式光自養微繁技術，不使用任何特殊的培養設備及培養條件，培養環境中允許有菌；借鑑前人對培養基研究的經驗，選擇最簡化的培養基質，進行扦插研究。本研究以課題組已成功建立的開放操作，對抑菌劑種類、濃度，適宜的外植體類型，以及扦插生根促成劑進行篩選，獲得更為簡單易行，生根率較高的扦插生根體系：以瓊脂7g·L-1，加抑菌劑百菌清0.2g·L-1為培養基質，外植體選擇中部帶葉類型，以多菌靈0.8g·L-1消毒3min後，以適宜的生根劑浸泡：IBA1.0g·L-1處理2h(馬大雜種相思)、IBA0.6g·L-1處理2h(馬佔相思)、IBA0.8g·L-1處理3h(大葉相思)，在開放的實驗臺上接種至扦插基質中，生根率分別為：100％，94.33％，100％。建立的開放生根體系，使三種相思的扦插基質成分簡單可控，對今後深入開展相思扦插生根機理研究具有重要的現實意義。
3.2討論
找到適宜的抑菌劑是脫離嚴格無菌環境進行培養的關鍵，但適宜的抑菌劑篩選較困難，不同物種對抑菌劑的種類、濃度及組合方式有不同的要求，難以找到具有普適性的抑菌劑。對多菌靈、代森錳鋅、利福平、山梨酸鉀、鏈黴素、青黴素、氨苄西林鈉、硫酸慶大黴素、羧苄青黴素9種抑菌劑進行篩選，發現僅多菌靈和代森錳鋅適宜長柄扁桃的培養(孫佔育等，2013)。多菌靈對微球菌和杜氏青黴不能有效抑制，百菌清僅能抑制黑麴黴菌種(張薪薪等，2005)。多種植物中提取的生物組成物，與植物組織親和力高，可滲入植物內部，對植物內生菌有一定抑制作用，對植物的外植體的傷害也較小(崔剛等，2004)，但此類合成型抑菌劑成分較多，獲取不易，不利於在生產、研究中的運用。本研究中選取了生產中常用的效果較好的廣譜性抑菌劑：百菌清、多菌靈，結果三種相思適宜的抑菌劑均為百菌清，適宜的濃度0.2g·L-1，汙染率較低；多菌靈的汙染率均較高，對微生物的抑制效果較差，這與張薪薪等人(2005)的研究結果不一致，這可能是抑菌劑在不同培養環境、不同物種培養中表現出的差異性導致。因此，在今後不同物種培養中，仍應重視對抑菌劑篩選工作，以求找到能適應多個物種培養的方便獲取的抑菌劑。
在培養瓶內進行扦插生根，外植體的預處理和選擇是培養成功的首要關鍵步驟，目前多用濃度較高的升汞對外植體進行消毒，對外植體的毒害作用較大。也有學者們對其它具有抑菌作用的物質進行了嘗試，用利福平溶液對番木瓜側芽預處理，有效降低了汙染率，並對生長無毒副作用(Reuveni O，et al.，1990)。用多菌靈、聚乙烯吡咯烷酮、抗壞血酸、檸檬酸、氨苄青黴素的混合液對寬葉紫荊木的莖段進行預處理，減少了黴菌、細菌的汙染(Sing H P，et al.，1992)。但由於這些具有抑菌效果的物質並不是對所有微生物都有效，且不同來源的外植體帶的主要微生物也不同，針對不同樹種、來源的外植體需要進行對應的篩選。本實驗中選用多菌靈0.8g·L-1對外植體進行預處理，三種相思均選中部帶葉的莖段為外植體，以0.8g·L-1浸泡3min，均獲得了高的存活率：96.83％(馬大雜種相思)、90.48％(馬佔相思)、100％(大葉相思)。
培養基中無糖，進行外植體光自養培養，能進一步簡化培養基，使培養的汙染可能性大幅下降，但目前的光自養技術多依託於特殊的培養條件：需要特殊的培養容器、培養環境中CO2濃度需控制、以及特殊的光照模式。開放式光自養，以生根為目的時，使用透氣性好(如蛭石、珍珠巖、河沙等)的培養基質生根效果較好(丁國昌等，2009)。但對黒木相思光自養微繁的研究中，使用透氣性較差的瓊脂培養基，獲得的生根率(85％)也較高(丁國昌等，2010)。本研究以水加瓊脂為扦插基質，以適宜的生長調節劑處理，獲得了更高的生根率，100％(馬大雜種相思)，94.33％(馬佔相思)，100％(大葉相思)。可見透氣性差的瓊脂培養基同樣適於做光自養微繁生根的培養基質。另，此成分簡單可控的基質可運用於生根機制的研究，對科學研究而言，具有如蛭石等複雜培養基質不具備的優勢。
抑菌劑的加入對外植體的生長有一定影響，外植體對生長調節劑處理的響應會有何變化的研究尚少。本課題組以黃心土為扦插基質，已獲得三種相思傳統扦插方式的適宜處理，IBA處理的效果最佳，馬大雜種相思以IBA0.4g·L-1處理2h，生根率為93.33％(易敏等，2014)；馬佔相思以IBA0.4g·L-1處理2h，生根率為84.2％(易敏等，2010)；大葉相思以IBA0.2g·L-1處理2h，生根率為90％(易敏等，2011)。本實驗中適宜的生長調節劑均為IBA，與傳統扦插的一致，但IBA濃度及處理時間上有所差別：IBA1.0g·L-1處理2h(馬大雜種相思)、IBA0.6g·L-1處理2h(馬佔相思)、IBA0.8g·L-1處理3h(大葉相思)，適宜濃度均高於傳統的扦插培養，處理時間也有更長的趨勢，具體原因有待進一步的實驗探究。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。