截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子的製作方法

2023-06-28 05:08:36

專利名稱：截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子的製作方法
技術領域：
一般來說，本發明涉及本文稱為神經膠質細胞系來源的神經營養因子(也稱為膠質來源的神經營養因子或GDNF)的蛋白質，其特徵在於促進多巴胺被多巴胺神經元的吸收及支持在帕金森氏病中死亡的神經元的存活的能力。更具體地說，本發明涉及新的截短的GDNF蛋白質。發明背景神經營養因子是在神經系統中或由神經系統支配的非神經組織中發現的蛋白質，其功能是促進存活和維持神經和/或神經膠質細胞的表型分化(Varon等，神經科學年鑑1327，1979；Thoenen等，科學，229238，1985)。由於該生理學作用，神經營養因子在治療各種神經退化性疾病中出現的神經細胞的退化和分化功能的喪失中有用。
為了便於將具體的神經營養因子有效地用於治療神經損傷，損傷的神經細胞的類型或種類應對該因子有效應。不同的神經營養因子典型地影響明顯不同類型的神經細胞。因此，擁有各種不同的神經營養因子來治療在不同形式的疾病或損傷中出現的各種類型的損傷的神經元具有優勢。
神經營養因子可保護效應神經元抵抗各類無關損害。例如，神經生長因子(NGF)從經過切斷其軸突突起引起的死亡中(Rich等，神經細胞學雜誌16261 1987；Otto等，神經科學雜誌83156，1987)，從胚胎發育期間的個體發育死亡中(Hamburger等，神經科學雜誌4767，1984)和從施用紫杉醇或順式鉑氨引起的損傷中(Apfel等，神經學年鑑，2987，1991)挽救有效部分的感覺神經元。保護的明顯普遍性產生了這樣的觀點如果一種神經營養因子保護效應神經元抵抗實驗性損傷，那麼它可用於治療病人中涉及這些神經元損傷的疾病，即使該病原學可能是未知的。
一種給定的神經營養因子除了具有正確的神經元特異性外，還必須能獲得足夠量以用作藥物治療。由於神經營養因子在組織中典型地以少量存在(例如，Hofer和Barde，自然331261，1988；Lin等，科學2461023 1989)可能不便於直接從動物組織製備藥用量的神經營養因子。作為選擇，需要使用重組表達系統生產所需的蛋白質。
Lin等以前描述了篩選對灰質多巴胺能神經元的胚胎前體具有神經營養活性的生物學樣品的方法(參見1994年5月23日申請的美國專利申請號08/182,183及其專利申請；1992年9月17日申請的PCT/US92/07888(WO 93/06116)和歐洲專利申請號92921022.7(公開號EP610254)，本文引用其說明書以供參考)。該生物測定在鑑定可用於治療帕金森氏病的神經營養因子中有用(Friedman等，神經科學通訊，7965-72，1987)，因為該疾病的特徵在於支配紋狀體的中腦中的多巴胺能神經元的退化。
Lin等進一步描述了從一種該來源，成神經膠質瘤細胞系B49的條件培養基中純化的新神經營養因子的鑑定(Schubert等，自然249224-27，1974)。以前報導了該細胞系的條件培養基含多巴胺能神經營養活性(Bohn等，神經科學協會文摘，15277，1989)。在Lin等的文獻前，神經膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)尚未作為分離的生物學活性物質被鑑定或作為基本上純的蛋白質被分離。另外，Lin等描述了克隆編碼GDNF的人基因的方法，編碼GDNF的人基因的核酸序列和GDNF蛋白質的胺基酸序列。GDNF基因被亞克隆進表達載體，且該載體用於表達生物學活性GDNF。GDNF蛋白質是由2個以二硫鍵連接的134胺基酸，22kDa的亞基組成的同源二聚體。該描述進一步包括將GDNF用於防止和治療神經損傷和諸如帕金森氏病的神經相關疾病。
GDNF療法有助於治療由損傷一種或多種類型的神經細胞的存活和/或合適功能的情況引起的神經損傷。該神經損傷可從許多種類的不同原因引起。神經損傷可對一種或多種類型的神經細胞產生，它經過(1)物理損傷引起靠近損傷位點的軸突突起和/或神經細胞體退化；(2)部分神經系統的臨時或永久性血流停止，如中風；(3)故意或碰巧接觸神經毒素，如用於治療癌症的化學治療劑(例如，順式鉑氨)或用於治療AIDS的雙脫氧胞苷(ddC)；(4)慢性代謝疾病，如糖尿病或腎機能障礙；或(5)神經退化疾病，如帕金森氏病，Alzheimer氏疾病和肌萎縮性側索硬化(ALS)，它們由特定神經元群體的退化引起。
GDNF治療特別有助於治療涉及灰質多巴胺能神經元退化的神經退化性症狀，如帕金森氏病。對於帕金森氏病的唯一流行療法是治標，針對紋狀體中增加的多巴胺水平。GDNF療法預期的效果不是簡單地在紋狀體多巴胺能神經末端產生多巴胺能神經傳遞的增加(這將導致症狀的減輕)，而且還減緩了或甚至終止了退化性突起的進展並修復損傷的黑質紋狀體途徑並恢復其功能。GDNF還可用於治療病人的其它形式的多巴胺能神經細胞的損傷或不適當的功能。這種損傷或機能失常可能在精神分裂症和其它形式的精神病中出現。對這類症狀的唯一常規療法是針對有症狀的且需要作用於多巴胺吸收位點的多巴胺受體，這與該疾病過程可能涉及支配具有這些受體的神經元群體的多巴胺能神經元具有不合適的功能相一致。
發明概述在一個方面，本發明提供了新的截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白產物。在一個實施方案中，以重組遺傳工程技術生產截短的GDNF蛋白質。在一個另選的實施方案中，以化學技術，或重組與化學技術的結合合成該截短的GDNF蛋白質。
本發明截短的GDNF蛋白質產物包括由胺基酸序列X-[Cys41-Cys133]-Y代表的蛋白質。

圖1(SEQ ID NO2)中胺基酸殘基的編號方式用於幫助比較成熟GDNF蛋白質。[Cys41-Cys133]代表圖1(SEQ IDNO2)所示的Cys41到Cys133的胺基酸序列。Y代表Cys133的羧基末端基團或Ile134的羧基末端胺基酸殘基。X代表Cys41的甲硫氨醯化或非甲硫氨醯化的氨基或選自下列基團的氨基末端胺基酸殘基。
GRGNRGKNRG(SEQ ID NO3)GKNRG(SEQ ID NO4)RGKNRG(SEQ ID NO5)QRGKNRG(SEQ ID NO6)GQRGKNRG(SEQ ID NO7)RGQRGKNRG(SEQ ID NO8)RRGQRGKNRG(SEQ ID NO9)G RRGQRGKNRG(SEQ ID NO10)
KG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO11)GKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO12)RGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO13)SRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO14)NSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO15)ENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO16)PENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO17)NPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO18)ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO19)A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO20)AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO21)AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO22)QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO23)RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO24)NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO25)RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO26)ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO27)RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO28)RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO29)P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO30)LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO31)VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO32)AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO33)MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO34)QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO35)KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO36)DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO37)PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO38)預期該截短的GDNF蛋白產物包括具有由X-[Cys41-Cys133]-Y所代表的胺基酸序列的截短的GDNF蛋白質和其變異體和衍生物。因此，本發明的截短的GDNF蛋白質產物還包括由X-[Cys41-Cys133]-Y所代表的胺基酸序列的添加，取代和內部缺失變異體及衍生物。截短的GDNF蛋白質產物進一步包括甲硫氨醯化或非甲硫氨醯化的形式以及截短的GDNF蛋白的糖基化或非糖基化形式。
本發明的舉例性的截短的GDNF蛋白質包括[Arg16-Ile134]，[Asn22-Ile134]，[Pro23-Ile134]，[Ser26-Ile134]，[Arg32-Ile134]，[Gly33-Ile134]，[Lys37-Ile134]和[Asn38-Ile134]，截短的GDNF蛋白質，甲硫氨醯化或非甲硫氨醯化形式及其變異體或衍生物。目前本發明優選的截短的GDNF蛋白質包括[Lys37-Ile134]和[Asn38-Ile134]截短的GDNF蛋白質，甲硫氨醯化或非甲硫氨醯化形式及其變異體或衍生物。舉例性的取代變異體是[Asn22ΔSer22-Ile134]和[Pro23-Lys37ΔAsn37-Ile134]截短的GDNF蛋白質。舉例性的添加變異體是Ser-[Por23-Ile134]截短的GDNF蛋白質。
在本發明的另一方面，可以以糖基化的或非糖基化的形式製備截短的GDNF蛋白質。截短的GDNF蛋白質衍生物典型地包括將截短的GDNF蛋白質附著於水溶性多聚體上。例如，截短的GDNF蛋白質可結合到一個或多個聚乙二醇分子上以減小截短的GDNF蛋白質產物在水環境中的沉澱。
本發明還有另一個方面包括編碼截短GDNF蛋白質的各種多核苷酸。這些核酸序列一般用於在真核或原核宿主細胞中表達截短的GDNF，其中該表達產物或其衍生物的特徵在於減少多巴胺被多巴胺能細胞吸收的能力。該多核苷酸也可用於細胞治療或基因治療的應用中。合適的核酸序列包括在附圖中被具體描述的序列以及其它的簡併序列和天然存在的等位基因變異體。
本發明的另一方面包括含有可操作地連接到擴增和/或表達控制序列上的編碼截短的GDNF蛋白質的多核苷酸的載體。用該載體穩定轉化或轉染原核和真核宿主細胞以表達截短的神經膠質細胞來源的神經營養因子。本發明進一步包括截短的GDNF蛋白質的重組生產，其中該轉化的或轉染的宿主細胞在合適的營養培養基中生長，且任選從宿主細胞和/或營養培養基中分離由該細胞表達的截短的GDNF。本發明進一步包括編碼截短的GDNF的多核苷酸和含有該多核苷酸的載體在基因治療或細胞治療中的應用。
另一方面，本發明涉及含有成熟GDNF蛋白質和一種或多種從其得來的截短的GDNF蛋白質的混合物的重組產生的GDNF組合物，其中成熟GDNF蛋白質分子量為大約44kDa，且其中截短的GDNF蛋白質分子量大約為36到40kDa。GDNF組合物可含至少兩種截短的GDNF種類，其中第一類分子量大約為36kDa，第二類分子量大約為40kDa。分子量為大約40kDa的截短的GDNF種類是具有分子量大約為22kDa的GDNF單體和具有分子量大約為18kDa的截短的GDNF單體的異型二聚體。還預期可從該混合物中分離一種或多種截短的GDNF種類用於治療用途。
本發明的另一方面包括含有截短的GDNF蛋白產物的藥用組合物。典型的是，與藥學上可接受的載體一起配製截短的GDNF蛋白質產物。可使用各種其它的製劑物質以利於生產，貯存，處理，傳遞和/或效能。在本發明的另一方面，截短的GDNF蛋白質產物增加多巴胺吸收和多巴胺能神經元的存活。因此，截短的GDNF蛋白質產物特別適用於治療由損傷或疾病，如帕金森氏病，引起的神經系統損傷。
根據下面對本發明的實施的詳細描述，本發明的其它方面和優點對本領域的技術人員而言將是顯而易見的。
附圖簡述參考附圖，本發明的許多特徵和優點將變得顯而易見，其中圖1描述了編碼成熟的人神經膠質細胞系來源的神經營養因子(hGDNF)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。還描述了成熟人GDNF蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2描述了為表達重組截短GDNF蛋白而製備的質粒構建體的圖示。
圖3描述了編碼GDNF的另一核酸序列(SEQ ID NO39)和截短的GDNF多核苷酸的限制性圖譜。
圖4描述了編碼GDNF的另一個核酸序列(SEQ ID NO40)和截短的GDNF多核苷酸的限制性圖譜。
圖5描述了編碼[Pro23-Lys37ΔAsn37-Ile134]截短的GDNF蛋白質取代變異體(SEQ ID NO42)的核酸序列(SEQ ID NO41)。該蛋白質也可描述成Met-Ser-[Pro23-Lys37ΔAsn37-Ile134]截短的GDNF蛋白質添加/取代變異體。
圖6描述了編碼[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質(SEQ IDNO44)的核酸序列(SEQ ID NO43)。
圖7描述了編碼[Gly33-Ile134]截短的GDNF蛋白質(SEQ IDNO46)的核酸序列(SEQ ID NO45)。
圖8描述了成熟hGDNF的胺基酸序列(SEQ ID NO47)與一些舉例性的截短GDNF蛋白質Met-[Arg32-Ile134](SEQ ID NO48)。Met-[Gly33-Ile134](SEQ ID NO49)和Met-Ser-[Pro23-Lys37ΔAsn37-Ile134](SEQ ID NO50)的比較。
發明詳述人神經膠質細胞系來源的神經營養因子(hGDNF)以前體合成，該前體被加工並分泌為134個胺基酸的成熟蛋白質。以前測定了成熟人GDNF具有圖1所示的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
本發明基於這樣一種意想不到的發現成熟GDNF蛋白質大小可減小(本文也稱為「剪短」或「截短」蛋白質或截短GDNF蛋白質)，但仍保留其生物學活性。剪短蛋白在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞重組生產GDNF期間首次發現。簡單地說，重組人GDNF(rhGDNF)製備如下。將編碼成熟人GDNF蛋白的完整開放閱讀框的核酸序列克隆進表達質粒。證實該核酸序列的正確性(DNA測序為相當於GeneBank中hGDNF序列)並翻譯成與成熟人GDNF公開序列相同的胺基酸序列(Lin等，科學260，1130-1132，1993)。將質粒DNA線型化並使用磷酸鈣沉澱法轉染入二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞(CHOd-細胞)中。在選擇培養基中培養轉染的細胞，選擇在選擇過程中存活的那些菌落用於分別分析hGDNF表達。
收集來自單個克隆的無血清條件培養基並使用對hGDNF特異性的抗血清進行Western印跡分析。該抗血清包含從用在大腸桿菌中表達的重組hGDNF免疫的兔中得到的兔多克隆抗體。在還原條件下，存在於這些樣品中的hGDNF分辨出具有表觀分子量為大約22kDa和18kDa的兩條主要的帶。每條帶分別由大約22+22.5kDa和18+17.5kDa的位置接近的雙聯體組成(為簡單起見，這些雙聯體稱為22kDa和18kDa帶或種類)。
以前報導了GDNF以由分子量為大約20到22kDa的成熟GDNF蛋白的兩個相同亞基組成的二硫鍵鍵合的同型二聚體存在。在非還原條件下分析GDNF時，據報導已鑑定出32到42kDa(Lin等，科學，260，1130-1132，1993)或33到45kDa(Lin等，神經化學雜誌，63(2)，758-768，1994)的寬帶。該範圍的存在解釋為由於在成熟單體上存在糖基化的不均一性，且進一步用去糖基化實驗證實。
儘管該22kDa帶相應於文獻報導的成熟GDNF蛋白質，但以前未報導18kDa的帶。在從不同克隆收集的樣品中22kDa和18kDa蛋白質的相對量有變化。另外，發現從同一克隆的多次收穫物中顯示出兩種帶的比例可變化。而且，發現CHO表達的GDNF蛋白質的貯存通常導致18kDa帶的存在增加，同時22kDa帶減少。
以Western印跡在非還原條件分析轉化的CHOd-細胞的條件培養基時，觀察到具有表觀分子量為36，40和44kDa的3種高分辨帶。該發現也與以前的報導相反。這些帶的相對強度可變，但它們與存在於各樣品中的22和18kDa單體帶的比例非常相關。用單克隆抗血清進一步分析時，確定了在非還原凝膠中的3條帶相應於由兩個單體組成的3種可能的二聚體。最大的44kDa蛋白質是以前所報導的22kDa成熟GDNF蛋白質的二聚體。中間的40kDa蛋白質由二聚體組成，其中一個成熟蛋白質分子量減少為18kDa的形式。最小的36kDa二聚體似乎含2個18kDa蛋白質，即，2個22kDa形式分子量減小。這些數據首次證實在二聚體構型中不僅存在GDNF單體的新形式，而且還存在剪短的GDNF蛋白質。貯存時還發現，樣品的單體組成向剪短形式轉變，且可見相應的二聚體種類，即36kDa蛋白質的量增加。
然後進行研究以鑑定與以前報導的成熟GDNF蛋白質相比哪一部分蛋白質被消除或改變，從而引起了分子量的減小。首先確定了分子量的減小不是由於糖基化的改變而引起。
GDNF含2個潛在的N-連接的糖基化位點並已報導被糖基化。然而，剪短蛋白並不簡單地是成熟GDNF的非糖基化的或糖基化不足的形式。在去糖基化實驗中證實了這一點，其中用N-聚糖酶，O-聚糖酶和神經氨酸苷酶處理樣品。在還原凝膠上，以N-聚糖酶消化使18kDa蛋白質減小成13.5kDa的帶，這表明存在相當於4.5kDa的N-連接的糖。用神經氨酸苷酶和O-聚糖酶處理導致18kDa帶略微改變成17kDa。這表明在蛋白質上存在O-連接的糖。已報導成熟的22kDa帶被糖基化且也被N-葡聚糖酶減小到18kDa(即，也有4.5kDa)。通過使用對凝膠上的22kDa帶特異性的單克隆抗體進一步證實了這點。未還原的二聚體的聚糖酶消化方式更複雜，但能解釋且與3種形式的最初說明一致。
結果，認為蛋白質分子量減小4.5kDa是由於缺失大約30-35個胺基酸殘基而不是由糖基化改變引起。由於下列原因預期缺失很可能在成熟GDNF蛋白質的氨基末端發生。成熟GDNF含總共7個胱氨酸。如果缺失從羧基末端，將失去7個胱氨酸中的2到4個，且這可能導致蛋白質失活。然而，當對主要由剪短形式組成的試驗樣品進行生物測定以測量其多巴胺能神經元神經營養活性時，該樣品表現出的活性比得上在比例上含更多GDNF成熟形式的樣品。
然後經過對純化蛋白的胺基酸序列分析測定裂解位點。根據廠家說明書，使用應用生物系統494A蛋白質測序儀經10個循環測序樣品。儘管胺基酸序列分析技術和程序對本領域的技術人員是熟知的，但在Fausset等，電泳1222-27，1991和1990年8月24日申請的美國專利申請號576316(歐洲專利申請號90310899，公開號EP 423980，申請日1990年10月4日，題目「幹細胞因子」)中提供了蛋白質測序的進一步的描述，本文引用這些文獻作為參考文獻。經過分析，測定了剪短蛋白的氨基末端是「RGQRGK」或Arg-Gly-Gln-Arg-Gly-Lys。因此在條件培養基中從成熟蛋白質去掉了前31個胺基酸。此外，以胺基酸Arg32開始的剪短蛋白質的剩餘胺基酸序列與圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟GDNF胺基酸序列一致。
在多巴胺能神經元試驗中，發現[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質在定性基礎上有活性。多巴胺能神經營養活性試驗用於鑑定可能在治療帕金森氏病中有益的神經營養因子。該試驗以以前描述的試驗(Friedman等，神經科學通訊，7965-72，1987，本文引用該文獻以供參考)為基礎且可包括在Lin等(見1994年5月23日申請的美國專利申請號08/182,183和其母申請；1992年9月17日申請的PCT/US92/07888(WO 93/06116)；和歐洲專利申請號92921022.7)(公開號EP 610254)所述的修改。該試驗的詳細描述在下面實施例5中提供。
隨後的純化程序中經胺基酸測序後發現另一種蛋白質，其中成熟GDNF的N端被去掉了前36個胺基酸殘基，得到[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質，N端序列為KNRG(C)VL--。此外剪短蛋白的剩餘胺基酸殘基與成熟人GDNF胺基酸序列一致。在多巴胺吸收生物測定中還分析了[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質。發現截短的GDNF蛋白質具有活性，ED50為大約50pg/ml，相似於純化的重組大腸桿菌表達的成熟GDNF。
進一步發現細菌表達的成熟GDNF可變成截短形式。在轉化的大腸桿菌中表達的成熟GDNF(如在Lin等，美國專利申請號08/182,183，出處同上)用CHO-產生的條件培養基培養。重組大腸桿菌GDNF在還原凝膠上的表觀分子量為17kDa。當該物質與CHO細胞條件培養基混合併在4℃培養5天時，該蛋白質完全剪短為12.5kDa。在培養1小時或24小時時這種裂解不太完全，表明在該條件下是一種時間依賴性過程。還發現用含0.1％胎牛血清的培養基簡單培養重組大腸桿菌GDNF過夜不產生剪短形式。因此，培養基中活細胞的存在似乎對剪切加工的發現是必需的。因此可能在體內某些組織內也發生剪短事件。
另外，發現成熟大腸桿菌表達的hGDNF的衍生物，如PEG化的GDNF(也在Lin等，美國專利申請號08/182,183，出處同上中描述)在CHO-產生的條件培養基存在下可被加工成截短形式。成熟GDNF可在氨基末端被PEG化以延長其在循環中的清除時間。PEG化增加了蛋白質的大小，在還原條件下修飾的成熟GDNF遷移到大約45kDa。與未PEG化的成熟形式一樣，PEG化的大腸桿菌GDNF與CHO細胞(未轉染的)條件培養基培養產生12.5kDa的帶。在兩種情況下，12.5kDa種類以二硫鍵結合的二聚體存在，如在非還原凝膠上所示。從N端PEG化的成熟蛋白產生該剪短形式進一步證實剪短事件在該蛋白質的N端發生，因為在剪切過程中PEG化的殘基丟失。
根據這些發現，且由於剪短事件也可在體內發生，因此GDNF蛋白質的截短形式可能是在生理條件下hGDNF的最終自然加工的形式。因此，認為產生截短的GDNF蛋白質或其衍生物用於治療應用具有優勢。例如，直接表達或合成截短的GDNF蛋白質，如[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質預期可對上述蛋白水解活性產生抗性。而且，如果需要產生截短的GDNF衍生物，如PEG化的[Arg32-Ile134]截短GDNF蛋白質，預期所得的衍生物具有對成熟GDNF衍生物所觀察到的特異性剪切不敏感的優勢。
也可預期截短的GDNF蛋白質產物的其它優勢。首先，截短的蛋白質，如[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質的pI從大約10減小到大約8.0-8.5。這使得蛋白質鹼性明顯變小，從而提供了有益的效果，包括更好的受體結合和在用藥位點，如膜內注射位點的細胞毒性下降。其次，在成熟GDNF的前26個胺基酸內，胺基酸序列有兩個脫醯胺位點Arg-Asn-Arg(胺基酸14-16)和Glu-Asn-Ser(胺基酸24-26)。在截短GDNF蛋白質中缺失一個或兩個這類位點預期增加了該蛋白質的穩定性。截短的GDNF蛋白質產物在基本實施方案中可用下面胺基酸序列代表本發明的截短的GDNF蛋白質，其中使用圖1的胺基酸殘基編號方式以利於與成熟GDNF蛋白質相比較X-[Cys41-Cys133]-Y其中[Cys41-Cys133]代表圖1(SEQ ID NO2)所示的從Cys41到Cys133的胺基酸序列；Y代表Cys133的羧基端基團或Ile134的羧基端胺基酸殘基；X代表Cys41的甲硫氨醯化或非甲硫氨醯化的氨基或選自下列基團的氨基末端胺基酸殘基GRGNRGKNRG(SEQ ID NO3)GKNRG(SEQ ID NO4)RGKNRG(SEQ ID NO5)QRGKNRG(SEQ ID NO6)GQRGKNRG(SEQ ID NO7)RGQRGKNRG(SEQ ID NO8)RRGQRGKNRG(SEQ ID NO9)G RRGQRGKNRG(SEQ ID NO10)KG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO11)GKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO12)RGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO13)SRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO14)NSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO15)ENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO16)PENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO17)NPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO18)ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO19)A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO20)AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO21)AAA ANPENSRGKG RRGORGKNRG(SEQ ID NO22)
QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO23)RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO24)NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO25)RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO26)ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO27)RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO28)RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO29)P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO30)LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO31)VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO32)AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO33)MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO34)QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO35)KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO36)DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO37)PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO38)本文使用的術語「截短的GDNF蛋白質產物」包括有生物學活性的合成的或重組的截短GDNF蛋白質，從成熟GDNF生產的截短的GDNF蛋白質，有生物學活性的截短的GDNF變異體(包括插入，取代和缺失變異體)及其化學修飾的衍生物。還包括與具有SEQ ID NO2所述胺基酸序列的人GDNF蛋白質基本上同源的截短的GDNF蛋白質。
本文所用的術語「生物學活性」指截短的GDNF蛋白質表現出與具有SEQ ID NO2所述胺基酸序列的GDNF蛋白質相似的神經營養特性，但不必是全部相同的特性，且不必是相同的程度。感興趣的具體神經營養特性的選擇取決於施用截短的GDNF蛋白質產品的用途。截短的GDNF蛋白質產物具有生物學活性，且正如下面實施例中所討論的，使用評價多巴胺吸收和酪氨酸羥化酶(TH)表達作為舉例性生物測定時表現出的多巴胺能神經元存活特徵相似於成熟GDNF蛋白質所表現出的特徵。
本文所用的術語「基本上同源的」指與具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的人GDNF的同源性程度優選超過70％，更優選超過80％，甚至更優選超過90％或甚至95％。本文所述的同源性百分數計算為，在100個胺基酸長度中引入4個殘基變化以幫助序列比較時在兩個序列的較小序列中發現的待比較的序列中對比為相同胺基酸殘基的胺基酸殘基的百分數，如Dayhoff在蛋白質序列和結構圖表集Vol.5，p.124(1972)，國家生化研究基金會，華盛頓區中所述，本文引用該文獻以供參考。基本上同源還包括用與抗SEQ ID NO2的GDNF的抗體的交叉反應性特徵可分離的任何截短的GDNF蛋白質或其基因可通過與SEQID NO1的編碼GDNF的基因或其片段雜交而分離的任何截短的GDNF蛋白質。
通過閱讀本說明書對本領域的技術人員而言顯而易見的是，基本上同源的蛋白質包括對X-[Cys41-Cys133]-Y所代表的截短的GDNF蛋白質的胺基酸殘基進行的一個或多個的缺失，添加或取代。該變異體的產生在下文進一步詳細描述。還可預期由於本發明清楚地闡述了「截短」的GDNF蛋白質，可預期氨基末端添加變異體包括添加甲硫氨酸殘基或非-GDNF胺基酸殘基或序列，但不包括添加可導致成熟GDNF蛋白質重構的胺基酸殘基。以天然存在的等位基因突變體或變異體為基礎的截短的GDNF蛋白質也在本發明的範圍內。變異的截短GDNF蛋白質在下面進一步詳細地描述。
Lin等(美國專利申請號08/182,183，出處同上)描述了經蛋白水解加工Lys-Arg殘基在羧基末端截短成熟GDNF，其中該Lys-Arg分別從成熟GDNF羧基末端為第6位和第5位殘基(即、根據圖1(也同SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)的胺基酸殘基編號為Lys129-Arg130)。這種截短從成熟GDNF蛋白質上去掉了兩個半胱氨酸殘基。這很可能導致蛋白質的摺疊不合適，從而導致形成失活的蛋白質。相反，本發明的X-[Cys41-Cys133]-Y截短的GDNF蛋白質產物含Cys131和Cys133殘基且經多巴胺吸收試驗測定為活性蛋白質。
在本發明的一個實施方案中，優選的截短的GDNF蛋白質產物缺乏一個或多個脫醯胺化位點。這種缺乏脫醯胺化位點可能導致純化蛋白質的生化穩定性增強及減少可能的降解產物，從而產生貯存更穩定的蛋白質。舉例性的截短的GDNF蛋白質產物是[Ser26-Ile134]截短的GDNF蛋白質，它缺乏可能導致成熟蛋白質脫醯胺化的位點。另外，[Arg16-Ile134]截短的GDNF蛋白質缺乏至少存在於成熟蛋白質中的第一脫醯胺化位點。
目前優選的截短的GDNF蛋白質產物是[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質。該截短的GDNF蛋白質缺乏發生成熟蛋白質的蛋白水解剪切的位點或靠近它的位點。因此，預期該截短的GDNF蛋白質對也可能發生於體內的加工事件有抗性。目前另一優選的截短的GDNF蛋白質產物是[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質。這種截短可能進一步降低了截短蛋白質的pI，正如分別從N端和C端去掉達到且包括Gly40和Ile134的殘基的其它截短一樣。目前最優選的截短GDNF蛋白質產物保留在成熟GDNF蛋白質中發現的全部半胱氨酸殘基，但缺乏在表達和生產期間或體內用藥後截短的GDNF蛋白質迅速蛋白水解加工的任何可識別的位點。這些優選的蛋白質包括[Arg32-Ile134]，[Gly33-Ile134]，[Gln34-Ile134]，[Arg35-Ile134]，[Gly36-Ile134]，[Lys37-Ile134]，[Asn38-Ile134]和[Arg39-Ile134]截短的GDNF蛋白產物。
與以前所述的Lin等(美國專利申請號07/855,413出處同上)的結果相似，已證實本發明的截短的GDNF蛋白質具有增強灰質多巴胺能神經元胚胎前體對多巴胺的吸收的能力。截短的GDNF蛋白質的生物測定在下面實施例4中進一步描述。
典型地分離新截短的GDNF蛋白質並純化形成基本上不含其它(非GDNF)蛋白物質的截短的GDNF蛋白質。優選的是，截短的GDNF蛋白質產物為大約80％不含由於用於截短的GDNF蛋白質產物的製備的生產技術而存在的其它蛋白質。更優選的是，截短的GDNF蛋白質產物為大約90％不含其它蛋白質，特別優選的，大約95％不含其它蛋白質，最優選大約＞98％不含其它蛋白質。另外，本發明具有提供用於生產同源截短的GDNF蛋白質的多核苷酸序列的獨特優勢。例如，使用編碼[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質的多核苷酸序列允許在大腸桿菌和其它合適的表達系統中重組生產截短的GDNF蛋白質。換句話說，新的多核苷酸允許生產對蛋白水解加工不敏感的或對該加工及上面所述的其它生化加工效應的敏感性降低的截短的GDNF蛋白質。因此，新的多核苷酸使其易於製備和/或分離單個種類的截短GDNF蛋白質，因此，截短的GDNF蛋白質和/或其產物不含異型和同型二聚體的上述混合物或其含量下降。然而可預期最終截短的GDNF蛋白質產物可在用藥前與其它因子，化學組合物和/或合適的藥用組合物物質結合，如在下面所進行的詳細描述。
在本發明的一個方面，截短的GDNF蛋白質經重組技術生產具有優勢，因為它們能以更大的純度獲得比較起來含量更高的蛋白質。重組截短的GDNF蛋白質形式包括蛋白質的糖基化和非糖基化形式及在細菌，哺乳動物或昆蟲細胞系統中表達的蛋白質。另外，截短的GDNF蛋白質可經化學合成。目前優選的生產方法在下面進行更詳細的描述。截短的GDNF變異體和衍生物A.截短的GDNF變異體本發明的另一方面包括截短的GDNF蛋白質的變異體。本文所用的術語「截短的GDNF蛋白質產物」包括變異的蛋白質，其中在天然存在的GDNF胺基酸序列內胺基酸殘基被缺失(「缺失變異體」)，插入(「添加變異體」)或取代(「取代變異體」)。經過將合適的核苷酸變化導入編碼該蛋白質的DNA中或經體外化學合成所需的蛋白質來製備該變異體。本領域的技術人員可預期可製備許多缺失，插入和取代的組合，只要最終的蛋白質具有GDNF生物學活性。
一個或多個選定的胺基酸殘基的取代，插入或缺失的誘變技術對本領域的技術人員來說是熟知的(例如，美國專利號4518584，本文引用其說明書以供參考)。在胺基酸序列變異體的構建中有2個原則上的變化誘變位點的位置和誘變性質。在截短的GDNF變異體的設計中，誘變位點的位置和誘變性質取決於待修飾的生化特徵。可單獨或系列修飾突變位點，例如，經過(1)首先用保守的胺基酸選擇，然後根據所得的結果用更激進的選擇進行取代，(2)缺失靶胺基酸殘基，或(3)相鄰於選定位點插入胺基酸殘基。
胺基酸序列缺乏範圍一般從大約1到30個胺基酸殘基，更常見的是從大約1到10個殘基，典型地從大約1到5個殘基。例如，位於Cys41N端的胺基酸殘基「X」部分的缺失範圍從大約1到30個殘基，而[Cys41-Cys133]半胱氨酸殘基之間的缺失根據其位置典型地從大約1到5個殘基，以便不破壞蛋白質摺疊。可在與轉化生長因子-β(TGF-β)家族成員同源性較低的區域對截短的GDNF蛋白質進行缺失。在與其它TGF-β家族序列基本上同源的區域截短GDNF蛋白質的缺失很可能會更顯著地改變生物學活性。選擇總缺失數和/或連續缺失以保護受影響的區域的截短GDNF蛋白質的三級結構，例如，半胱氨酸交聯。
胺基酸序列添加包括長度範圍從1個殘基到100或更多個殘基的氨基和/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基的內部序列內插入。內部添加範圍一般從大約1到10個胺基酸殘基，更典型地是從大約1到5個胺基酸殘基，通常是從大約1到3個胺基酸殘基。如上所述，預期本發明的氨基末端添加變異體包括添加甲硫氨酸(例如，在細菌重組細胞培養物中作為直接表達GDNF的假像)或非GDNF胺基酸殘基或序列。氨基末端添加變異體不包括添加可導致成熟GDNF蛋白質重構的胺基酸殘基。末端插入的另一個例子包括異源性N-端信號序列與N端的融合以利於從重組宿主細胞分泌蛋白質。該信號序列一般可從目的宿主細胞種類獲得且因此與之同源。插入或添加還可包括來自其它神經營養因子的序列的胺基酸序列。
另一組變異體是胺基酸取代變異體。這些變異體在截短的GDNF蛋白質至少去掉了一個胺基酸殘基且在其位置插入了不同的殘基。例如，見圖5，其中天然存在的Asn22被變成Ser以利於進一步去掉Met殘基。使用X-[Cys41-Cys133]-Y胺基酸序列表達式和該截短的GDNF蛋白產物的該定義，這種截短的GDNF蛋白質可稱為取代變異體Met-[Asn22ΔSer22-Ile134]截短的GDNF蛋白質或添加變異體Met-Ser-[Pro23-Ile134]截短的GDNF蛋白質。取代變異體包括等位基因變異體，其特徵在於在種群中存在可導致胺基酸改變或不變的天然存在的核苷酸序列改變。
截短的GDNF蛋白質的序列的特異性突變可包括糖基化位點(例如，絲氨酸，蘇氨酸或天冬醯胺)的修飾。缺乏糖基化或僅部分糖基化可由在任意天冬醯胺連接的糖基化識別位點或在經添加O-連接的糖類修飾的蛋白質的任意位點的胺基酸取代或缺失引起。天冬醯胺連接的糖基化識別位點包括被合適的細胞糖基化酶特異性識別的三肽序列。這些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是非Pro的任意胺基酸。在糖基化識別位點的一個或第一及第三胺基酸位置的各種胺基酸取代或缺失(和/或在第二位置的胺基酸缺失)導致在修飾的三肽序列上非糖基化。因此，適當改變的核苷酸序列的表達產生在該位點未糖基化的變異體。另外，該序列可修飾成在截短的GDNF蛋白質上添加糖基化位點。
鑑定用於誘變的截短GDNF胺基酸殘基或區域的一個方法稱為「丙氨酸掃描誘變」，如Cuningham和Wells所述(科學，2441081-1085，1989)。在該方法中，鑑定了胺基酸殘基或靶殘基的基團(例如，帶電殘基，如Arg，Asp，His，Lys和Glu)並用中性或帶負電的胺基酸(最優選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代以影響胺基酸與細胞內或細胞外的周圍水環境的相互作用。經過在該取代位點導入其它或任選的殘基精選對取代表現出功能性敏感的區域。從而預定用於導入胺基酸序列修飾的位點並選擇在給定位點的最佳突變效果，進行丙氨酸掃描或隨機誘變並篩選所需活性和活性程度的最佳組合的變異體。
用於取代誘變的最感興趣的位點包括在各種類型的GDNF蛋白質中發現的胺基酸在側鏈大小，電荷和/或疏水性方面基本上不同的位點。感興趣的其它位點包括從各種類型獲得的GDNF樣蛋白質的特定殘基相同的那些位點。這些位置一般來說對蛋白質的生物學活性是重要的。開始，以相當保守的方式經取代修飾這些位點。這些保守的取代在表1中優選的取代下顯示。如果這些取代導致生物學活性改變，那麼導入更大的改變(舉例性取代)和/或進行增加/缺失，篩選所得的產品。
表1胺基酸取代原始殘基 優選的取代 舉例性取代Ala(A)Val Val；Leu；lleArg(R)Lys Lys；Gln；AsnAsn(N)Gln Gln；His；Lys；ArgAsp(D)Glu GluCys(C)Ser SerGln(Q)Asn AsnGlu(E)Asp AspGly(G)Pro ProHis(H)Arg Asn；Gln；Lys；ArgIle(I)Leu Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸Leu(L)Ile 正亮氨酸Ile；Val；Met；Ala；PheLys(K)Arg Arg；Gln；AsnMet(M)Leu Leu；Phe；IlePhe(F)Leu Leu；Val；Ile；AlaPro(P)Gly GlySer(S)Thr ThrThr(T)Ser SerTrp(W)Tyr TyrTyr(Y)Phe Trp；Phe；Thr；SerVal(V)Leu Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸預期對胺基酸序列的保守修飾(和對編碼核酸序列的相應修飾)產生功能和化學特徵相似於下面實施例中所述的截短GDNF蛋白質的截短GDNF蛋白質。相反，經過選擇對維持(a)取代區域的多肽骨架結構，例如，片層或螺旋構象，(b)靶位點的蛋白質電荷或疏水性，或(c)側鏈大小其影響明顯不同的取代可實現截短GDNF蛋白質的功能和/或化學特徵的明顯改變。天然存在的殘基根據其共同的側鏈特徵分組1)疏水的正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；2)中性親水的；Cys，Ser，Thr；3)酸性Asp，Glu；4)鹼性Asn，Gln，His，Lys，Arg；5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro；和6)芳香族Trp，Tyr，Phe非保守性取代包括一種類型中的成員與另一類型的交換。這些取代的殘基可導入與其它TGF-β蛋白質同源的截短GDNF蛋白質區域或該蛋白的非同源區域。B.截短的GDNF衍生物按本文說明書本領域的技術人員可製備截短GDNF或截短GDNF變異體的化學修飾的衍生物。最適於衍變截短GDNF蛋白質的化學基團包括水溶性多聚體。需要水溶性多聚體是因為附著於其上的蛋白質在水環境，如生理環境中不沉澱。優選的是，該多聚體對於製備治療性產品或組合物是藥學上可接受的。本領域的技術人員根據多聚體/蛋白質結合物是否能在治療上使用，及如果能，所需的劑量，循環時間，對蛋白水解的抗性及其它因素的這種考慮可選擇所需的多聚體。經過以所需形式(即，經滲壓泵，或更優選的是，經注射或輸注或進一步配製成口服、肺或其它傳遞途徑)施用該衍生物並測定其效果可確定衍變的效果。
合適的水溶性多聚體包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚體，單甲氧基聚乙二醇，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊烷，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/馬來酸酐共聚體，多聚胺基酸(同型多聚體或隨機共聚體)，聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇同型多聚體，脯氨醯基氧化丙烯/環氧乙烷共聚體，聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)，聚乙二醇丙醛和其混合物。本文使用的聚乙二醇指包含用於衍變其它蛋白質的PEG的任何形式，如單-(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性而在生產中具有優勢。該多聚體可以是任意分子量，且可以是分枝的或不分枝的。
本發明特別涉及包括截短的GDNF蛋白質連接到至少一個PEG分子上的截短的GDNF蛋白質產物。另一方面，本發明涉及經醯基或烷基鍵附著於至少一個PEG分子上的截短的GDNF蛋白質。
以本領域已知的任一PEG化反應可進行PEG化。例如，參見Focus on Growth Factors，3(2)4-10(1992)；EP 0154316；EP 0401384；和Malik等，實驗血液學；201028-1035(1992)(報導了使用tresyl chloride將GM-CSF PEG化)。優選的是，用活性水溶性多聚體經醯基化反應或烷基化反應進行PEG化。這些用於衍變的優選的方法在下面進行更詳細的討論。對於醯化反應，優選選擇的多聚體具有單個活性酯基。對於還原性烷基化反應，優選選擇的多聚體具有單個活性醛基。另外，選擇的多聚體可修飾成具有單個反應基團，如用於醯基化的活性酯或用於烷基化的醛，以便控制聚合程度。一般來說，水溶性多聚體不能選自天然存在的糖基殘基，因為這些殘基通常可經哺乳動物重組表達系統更方便地製備。
醯基化在本發明中，經醯基化的PEG化通常涉及將聚乙二醇的活性酯衍生物與截短的GDNF蛋白質反應。任何已知的或隨後發現的活性PEG分子可用於進行PEG化過程。優選的活化的PEG酯是PEG酯化到N-羥基琥珀醯亞胺(「NHS」)上。本文使用的「醯基化」預期包括但不限於下列類型的在截短的GDNF蛋白質和諸如PEG的水溶性多聚體間形成的鏈醯胺，氨基甲酸，尿烷等。見生物結合物化學，5133-140(1994)。反應條件可選自PEG化領域已知的或隨後建立的任何條件，但應避免或限制接觸能使待修飾的截短的GDNF蛋白質失活的諸如溫度、溶劑和pH水平的反應條件。
經醯基化反應來PEG化一般產生多個PEG化的截短GDNF蛋白質，其中經醯基連接基團PEG化賴氨酸ε-氨基。優選的是，連接鏈可以是醯胺。還優選的是，所得的產物基本上僅(例如≥95％)單個，二個或三個PEG化。然而，根據所使用的具體反應條件可形成在總量上具有更高的PEG化程度的一些結合物。如果需要，經過標準純化技術，其中包括透析、鹽析、超濾、離子交換色譜，凝膠過濾色譜和電泳，可從混合物中製備更純化的PEG化的結合物。
烷基化在本發明中，以烷基化進行的PEG化一般包括在還原劑存在的條件下將PEG的末端醛基衍生物與截短的GDNF蛋白質反應。經烷基化進行的PEG化也可產生多個PEG化的截短的GDNF蛋白質。另外，可控制反應條件以幫助基本上僅在蛋白質N端的α氨基上PEG化(即，單個PEG化的種類)。在單個PEG化或多個PEG化的情況下，PEG基團優選經-CH2-NH-基團附著於蛋白質上。特別對於-CH2-基團，這類連接本文稱為「烷基」鏈。
經還原性烷基化可實現選擇性N端化學修飾，這利用了對於特定蛋白質的衍變可用的不同類型的伯胺基的不同反應性(賴氨酸與N端)。在合適的反應條件下，用含羰基的多聚體在N端進行對蛋白質的基本上選擇性的衍化。例如，在允許利用賴氨酸殘基ε-氨基和蛋白質N端殘基α-氨基之間的pKa差異的pH下進行反應可選擇性地在N端PEG化該蛋白質。經過這種選擇性衍變，可控制水溶性多聚體與蛋白質的附著與多聚體的連接主要發生在蛋白質的N端，且在其它反應基團，如賴氨酸側鏈氨基基團上沒有明顯的修飾出現。使用還原性烷基化時，水溶性多聚體優選具有用於偶聯蛋白質的單個反應性醛。可使用含單個反應性醛的聚乙二醇丙醛。
本發明包括PEG化截短的GDNF蛋白質，其中PEG基團經醯基或烷基基團附著。正如上面所討論的，這種截短的GDNF蛋白質產物可被單個PEG化或多個PEG化(例如，含2-6個，優選2-5個PEG基團)。這種PEG基團一般在胺基酸的α-或ε-氨基基團上附著於蛋白質上，但還預期PEG基團可附著於蛋白質的任何反應基團上。在合適的反應條件下，該反應基團具有足夠的反應性以附著於PEG基團上。因此，聚乙二醇可經過諸如游離氨基或羧基的反應基團共價結合於蛋白質上。反應性基團是那些激活的PEG分子可結合上的基團。具有游離氨基的胺基酸殘基可包括賴氨酸殘基和N-端胺基酸殘基。具有游離羧基的那些殘基包括天冬氨酸殘基，穀氨酸殘基，和C-端胺基酸殘基。硫氫基基團也可用作附著PEG分子的反應基團。為達到治療目的，典型地優選在氨基上附著，如在N端或賴氨酸基團上附著。如果需要受體結合，應避免附著在對受體結合重要的殘基上。
在一個方面，本發明提供了單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物的基本上均一的製品，其中多聚體分子基本上僅(即≥95％)在單個位置附著。更具體地說，如果使用PEG，本發明還提供了缺乏可能的抗原性連接基團，且PEG分子直接偶聯到截短的GDNF蛋白質上的PEG化的截短的GDNF蛋白質。
另外，使用糖基化的，非糖基化的或去糖基化的截短GDNF蛋白質可製備衍生物。典型地是，使用非糖基化的截短的GDNF蛋白質。例如，原核表達的[Arg32-Ile134]截短GDNF蛋白質可化學衍變成包括經醯基或烷基基團附著的單個或多個，例如2-4個PEG部分一般來說，在用於將生物學活性物質與活化的多聚體分子反應的任何合適的條件下可進行化學衍變。製備PEG化的截短的GDNF蛋白質的方法一般包括下列步驟(a)在截短的GDNF蛋白質附著到一個或多個PEG基團的條件下將截短的GDNF蛋白質與聚乙二醇(如PEG的反應性酯或醛衍生物)反應，(b)獲得反應產物。一般來說，根據已知的參數和所需的結果逐例測定醯基化反應的最佳反應條件。例如，PEG蛋白質的比例越大，多個PEG化的產物百分數越大。以諸如衍化的所需程度(例如，單個，2個，3個等)，選擇的多聚體的分子量，多聚體是分枝的還是不分枝的及所用的反應條件的因素可測定最佳比例(反應的效率在於無剩餘的未反應的蛋白質或多聚體)。
產生基本上均一的單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物的群體的還原性烷基化一般包括下列步驟(a)在還原性烷基化條件下，在適於使截短的GDNF蛋白質的氨基末端α-氨基選擇性修飾的pH下將截短的GDNF蛋白質與反應性PEG分子反應，(b)獲得反應產物。
為得到單個多聚體/截短的GDNF蛋白質連接物的基本上均一的群體，還原性烷基化反應條件是允許水溶性多聚體部分選擇性附著於截短的GDNF蛋白質N端的那些條件。該反應條件一般提供了賴氨酸氨基和N端α-氨基間的pKa差異(pKa是50％氨基質子化而50％非質子化的pH)。pH還影響多聚體與所用的蛋白質之間的比率。一般來說，如果pH較低，需要超出蛋白質的多聚體量越大(即，N端α-氨基的反應性越小，達到最佳條件需要的多聚體越多)。如果pH更高，多聚體蛋白質比率不必太大(即，可獲得的反應基團越多，所需的多聚體分子越小)。為達到本發明的目的，pH一般落在3-9的範圍內，優選3-6。
另一考慮是多聚體的分子量。一般來說，多聚體的分子量越高，可附著於蛋白質上的多聚體分子數越少。同樣，在優選這些參數時應考慮多聚體的分枝。一般來說，分子量越高(或分枝越多)，多聚體蛋白質的比率越高。一般情況下，為進行本文預期的PEG化反應，優選的平均分子量是大約2kDa到大約100kDa(術語「大約」指在聚乙二醇製品中，有些分子比所述的分子量更大，有些更小)。優選的平均分子量是大約5kDa到大約50kDa，特別優選大約12kDa到大約25kDa。水溶性多聚體與截短的GDNF蛋白質的比率一般範圍為從1∶1到100∶1，優選(對於多個PEG化)1∶1到20∶1，和(對於單個PEG化)1∶1到5∶1。
使用上面所述條件，還原性烷基化可使多聚體選擇性附著到在氨基末端具有α-氨基的任意截短的GDNF蛋白質，且產生單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物的基本上均一的製品。本文使用的術語「單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物」指含附著於截短的GDNF蛋白質上的單個多聚體分子的衍生物。單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物優選具有位於N端，而不在賴氨酸氨基上的多聚體分子。該製品優選含有大於90％的單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物，更優選含大於95％的單個多聚體/截短的GDNF蛋白質結合物，餘下的值得注意的蛋白質是未反應的(即，缺乏多聚體部分的蛋白質)。
為進行還原性烷基化，還原劑應在水溶液中穩定，且優選僅能還原在還原性烷基化的起始過程中形成的西佛鹼。舉例性的還原劑可選自氫硼化鈉，氰基氫硼化鈉，二甲胺甲硼烷，三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷。特別優選的還原劑是氰基氫硼化鈉。其它反應參數，如溶劑，反應時間，溫度等，和產品的純化方式，可根據按常規可獲得的涉及用水溶性多聚體衍變蛋白質的信息逐一測定。
經醯基化和/或烷基化方法可選擇製備多聚體/蛋白質結合物的混合物，本文提供的優勢在於可選擇單個多聚體/蛋白質連接物的比例以包括進混合物中。因此，如果需要，可製備各種數目的多聚體分子附著於其上的蛋白質的混合物(即，二個，三個，四個等)並與使用本方法製備的單個多聚體/蛋白質結合物組合及具有預定比例的單個多聚體/蛋白質連接物的混合物。編碼截短的GDNF蛋白質的多核苷酸本發明進一步提供了編碼截短的GDNF蛋白質的新的多核苷酸。當用作雜交探針或擴增引物時，該核酸序列基本上不含所有其它核酸序列。為在重組蛋白質表達中使用，該核酸序列一般基本上不含編碼其它蛋白質的核酸序列，除非需要一種融合蛋白質。基於本說明書並使用通用密碼子表，本領域的普通技術人員易於確定編碼截短的GDNF蛋白質的胺基酸序列的所有核酸序列。目前優選的核酸序列包括編碼[Arg16-Ile134]，[Ser26-Ile134]，[Arg32-Ile134]及[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質的那些多核苷酸。各種多核苷酸的例子在圖5，6和7及編碼截短的GDNF蛋白質的圖1，3和4的那些部分中描述。本領域的技術人員還可預期到編碼截短的GDNF蛋白質的新多核苷酸包括編碼變異的截短的GDNF蛋白質的那些核酸序列，不管是人造的還是天然存在的核酸序列。
根據下面所提供的描述可實施重組表達技術以生產這些多核苷酸並表達各種截短的GDNF蛋白質。例如，經過將編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列插入合適的載體中，本領域的技術人員易於生產大量的所需核苷酸序列。然後該序列可用於生產檢測探針或擴增引物。另外，可將編碼截短的GDNF蛋白質的多核苷酸插入表達載體中。經過將表達載體導入合適的宿主中，可大量生產所需的截短的GDNF蛋白質。
如本文進一步所述，有許多宿主/載體系統可用於擴增核酸序列和/或生產截短的GDNF蛋白質。這些包括，但不限於，質粒，病毒和插入載體及原核和真核宿主。本領域的技術人員可改進能擴增或表達異源DNA以生產或表達本發明的序列的宿主/載體系統。
藉助於該重組技術，容易以商用量生產本發明的截短的GDNF蛋白質。而且，根據本說明書，本領域的技術人員可預料到新核酸序列包括編碼在附圖中特別提到的截短的GDNF蛋白質，該截短的GDNF蛋白質的變異體的簡併核酸序列，及那些優選在嚴緊雜交條件下與這些核酸序列的互補序列雜交的核酸序列(見，Maniatis等，分子克隆(實驗手冊)；冷泉港實驗室，387到389頁，1982)。舉例性的嚴緊雜交條件是在4×SSC中62-67℃雜交，接著在0.1×SSC中62-67℃洗滌大約1小時。另外，舉例性的嚴緊雜交條件是在45-55％甲醯胺，4×SSC中40-45℃雜交，在松馳型雜交條件下與編碼截短的GDNF蛋白質的互補序列雜交的且編碼本發明的截短的GDNF蛋白質的DNA序列也在本文中包括。這種松馳型嚴緊雜交條件的例子是4×SCC，45-55℃或用30-40％甲醯胺在40-45℃雜交。
本發明還提供了包括載體DNA與編碼截短GDNF蛋白質的DNA序列的重組DNA構建體。在該DNA構建體中，編碼截短的GDNF蛋白質(具有或不含信號肽)的核酸序列與能指導截短GDNF蛋白質在選定的宿主中複製和/或表達的合適的表達控制或調節序列以可操作的方式相連。截短的GDNF蛋白質的重組表達編碼截短的GDNF的多核苷酸的製備編碼截短的GDNF或成熟GDNF起始材料的核酸序列可用包括但不限於化學合成，cDNA或基因組文庫篩選，表達文庫篩選和/或cDNA的PCR擴增的各種方法易於獲得。這些方法和用於分離這類核酸序列的其它方法，例如由Sambrook等(分子克隆；實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY，1989)，Ausubel等編輯(分子生物學常規方法，常規方法出版社，(1994)和Berger和Kimmel(酶學方法分子克隆技術指南，Vol.152，學院出版公司，San Diego，CA，1987)進行了闡述。優選的編碼GDNF的核酸序列是哺乳動物序列。
編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列的化學合成也可使用本領域已知的方法實現，如由Engels等所述的方法(Angew，Chem，Intl.Ed.28716-734，1989)。這些方法特別包括核酸序列分析的磷酸三酯，亞磷醯胺和H-磷酸酯方法。編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列具有幾百個鹼基對(bp)或核苷酸的長度。大型的核酸序列，例如長度大於大約100個核苷酸的那些核酸序列可作為一些片段來合成。然後將這些片段連接起來形成編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列。優選的方法是使用標準亞磷醯胺化學進行多聚體支持的合成。
另外，經過篩選合適的cDNA文庫(即從據信表達該蛋白質的一個或多個組織來源製備的文庫)或基因組文庫(從總基因組DNA製備的文庫)可獲得合適的核酸序列。這些cDNA文庫的來源典型地是據信以合理量表達GDNF的任何種類的組織。基因組文庫的來源可以是任意組織或據信含有編碼GDNF或GDNF同源物的基因的任何哺乳動物或其它種類的組織。可使用選擇性地與存在於文庫中的GDNF或GDNF同源性cDNA或基因雜交的一個或多個核酸探針(與待克隆的GDNF或GDNF同源性cDNA或基因具有可接受水平的同源性的寡核苷酸cDNA或基因組DNA片段)篩選存在GDNF cDNA/基因的文庫。典型地用於該文庫篩選的探針通常編碼與製備文庫的種類相同或相似的種類的GDNF DNA序列的小區域。另外，該探針可以是本文所討論的簡併序列。
典型地是，在防止非特異性結合但允許與探針或引物具有有意義的同源水平的那些克隆結合的嚴緊條件下經過退火寡核苷酸探針或cDNA與文庫中的克隆實現文庫的篩選。典型的雜交和洗滌嚴緊條件部分取決於cDNA或寡核苷酸探針的大小(即，核苷酸數目的長度)以及該探針是否具簡併性。獲得克隆的可能性也考慮到雜交溶液的設計(即，待篩選的是cDNA還是基因組文庫，如果是cDNA文庫，以高水平存在感興趣的cDNA的可能性)。
如果DNA片段(如cDNA)用作探針，典型的雜交條件包括在Ausubeb等，編輯，出處同上中闡述的那些雜交條件。雜交後，含該文庫的印跡根據諸如探針大小，探針與克隆的預期同源性，待篩選的文庫類型，待篩選的克隆數等一些因素以合適的嚴緊性洗滌。嚴緊洗滌溶液的例子(通常為低離子強度和在相當高溫度下使用)如下。一種這類嚴緊洗滌為0.015M NaCl，0.005M檸檬酸Na和0.1％SDS，55-65℃。另一種該嚴緊緩衝液是1mM Na2EDTA，40mM NaHOP4，pH 7.2和1％SDS，大約40-50℃。一種其它嚴緊洗滌為0.2×SSC和0.1％SDS，大約50-65℃。
對於將寡核苷酸探針用於選擇cDNA或基因組文庫的嚴緊洗滌條件還有一些舉例性的方案。例如，第一種方案使用具有0.05％焦磷酸鈉的6×SSC，根據探針長度溫度為大約35到62℃之間。例如，14個鹼基探針在35-40℃洗滌，17個鹼基探針在45-50℃，20個鹼基探針在52-57℃，23個鹼基探針在57-63℃。當出現較高的背景非特異性結合時，溫度可增加2-3℃。第二方案使用氯化四甲銨(TMAC)用於洗滌。一個這種嚴緊洗滌溶液是3M TMAC，50mMTris-HCl，pH8.0和0.2％SDS。
獲得編碼GDNF蛋白質的核酸序列的另一合適的方法是聚合酶鏈式反應(PCR)。在該方法中，poly(A)+RNA或總RNA從表達GDNF的組織中提取。然後使用逆轉錄酶從RNA製備cDNA。然後向CDNA與諸如Taq聚合酶的聚合酶中加入典型地與GDNF cDNA的兩個分離的區域互補的二種引物(寡核苷酸)，該聚合酶擴增兩種引物間的cDNA區域。
如果選擇製備編碼所需截短的GDNF蛋白質的核酸序列的方法需要使用寡核苷酸引物或探針(例如，PCR，cDNA或基因組文庫篩選)，選擇作為探針或引物的寡核苷酸序列應足夠長和足夠清楚以減小在文庫篩選或PCR擴增期間出現的非特異性結合的量。探針或引物的實際序列通常以另一生物的相同或相似基因的保守的或高度同源的序列或區域為基礎。另外，探針或引物可以是完全或部分簡併的，即，含探針/引物的混合物，均編碼相同胺基酸序列，但使用不同的密碼子編碼。製備簡併探針的一種選擇是在不同種類中有變化的一些或全部密碼子中放入肌苷。用上面所述的DNA的化學合成方法可製備寡核苷酸探針或引物。
以編碼GDNF的這些核酸序列及其突變體或變異序列為基礎的截短的GDNF蛋白質也包含在本發明範圍內。如上所述，突變體或變異體序列是與野生型序列相比含一個或多個核苷酸取代，缺失和/或插入的序列及與野生型胺基酸序列相引起表達胺基酸序列變異體的序列。在某些情況下，由於存在天然等位基因變異體，可存在天然產生的GDNF胺基酸突變體或變異體。以這些天然產生的突變體或變異體為基礎的截短的GDNF蛋白質也在本發明的範圍內。合成突變體序列的製備也是本領域熟知的，且在例如Wells等(基因，34315，1985)，和Sambrook等，出處同上中進行了描述。
載體將編碼截短GDNF蛋白質的cDNA或基因組DNA插入載體中以便進一步克隆(DNA的擴增)或表達合適的載體是商業上可獲得的，或該載體可特定構建。合適載體的選擇或構建取決於1).它是用於DNA擴增還是用於DNA表達，2).將要插入載體中的DNA的大小，3).將要用該載體轉化的宿主細胞(例如，哺乳動物，昆蟲，酵母，真菌，植物或細菌細胞)。各載體根據其功能(DNA擴增或DNA表達)及其與目的宿主細胞的相容性可含有各種成分。載體成分一般包括，但不限於下列的一種或多種信號序列，複製起點，一個或多個選擇或標記基因，增強子元件，啟動子，轉錄終止序列，等。這些成分可從天然來源獲得或用已知方法合成。本發明的載體包括選擇性連接到一個或多個能指導，控制或否則影響選定的宿主細胞表達截短的GDNF蛋白質的下列表達控制或調節序列上的編碼感興趣的截短的GDNF蛋白質的核酸序列。
信號序列信號序列可以是載體的一種成分，或它可以是插入載體中的部分GDNF DNA。天然GDNF，DNA編碼在蛋白質的翻譯後加工期間被裂解以形成成熟GDNF蛋白質的位於蛋白質的氨基末端的信號序列。在本發明的範圍內包括具有天然信號序列和其它蛋白原前體序列的截短的GDNF多核苷酸以及天然信號序列被刪除並用異源性信號序列取代的截短的GDNF多核苷酸。選定的異源性信號序列應是能被宿主細胞識別並加工(即，經過信號肽酶裂解)的序列。對於不能識別和加工天然GDNF信號序列的原核宿主細胞，用選自，例如鹼性磷酸酶，青黴素酶或熱不穩定性腸毒素II前導區的原核信號序列取代信號序列。對於酵母分泌，可用酵母轉化酶，α因子或酸性磷酸酶前導區取代天然GDNF信號序列。在哺乳動物細胞表達中，天然信號序列是合適的，儘管其它哺乳動物信號序列可能是合適的。
複製起點表達和克隆載體一般包括能使載體在一種或多種選定的宿主細胞中複製的核酸序列。在克隆載體中，該序列典型地是能使載體獨立於宿主染色體DNA複製的序列且包括複製起點或自主複製序列。該序列對於各種細菌，酵母和病毒來說是熟知的。質粒pBR322的複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，且各種起點(例如，SV40，多形瘤，腺病毒，VSV或BPV)對於哺乳動物細胞中的克隆載體有用。一般來說，複製成分的起點對於哺乳動物表達載體是不需要的(例如，經常使用SV40起點僅僅因為它含有早期啟動子)。
選擇基因表達和克隆載體典型地含有一個選擇基因。該基因編碼生長於選擇性培養基中時對轉化宿主細胞的存活或生長必需的「標記」蛋白質。未被載體轉化的宿主細胞不含選擇基因，因此，它們不能在培養基中存活。典型的選擇基因編碼(a)提供對抗生素或其它毒素，例如氨苄青黴素，新黴素，氨甲蝶呤或四環素的抗性；(b)補充營養缺陷；或(c)提供不能從培養基中獲得的關鍵營養成分的蛋白質。
其它選擇基因可用於擴增待表達的基因。擴增是為生產對生長關鍵性的蛋白質大量需要的基因在重組細胞的連續傳代染色體內串聯重複的過程。哺乳動物細胞的合適的選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷激酶。哺乳動物細胞轉化子置於選擇壓力下，由於在載體中存在的標記的特徵，在該選擇壓力下僅專一性地適於轉化子存活。在培養基中選擇劑的濃度連續改變，從而導致選擇基因和編碼截短GDNF的DNA擴增的條件下培養轉化細胞來加強選擇壓力。結果，從擴增的DNA合成增加量的截短的GDNF。
例如，經過在含氨甲蝶呤(DHFR的競爭性拮抗劑)的培養基中培養所有的轉化子首先鑑定用DHFR選擇基因轉化的細胞。當使用野生型DHFR時合適的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢細胞系(例如，參見Urlaub和Chasin，美國國家科學院學報，77(7)4216-4220(1980))。然後，將轉化的細胞系與水平增加的氨甲蝶呤接觸。這導致合成多拷貝的DHFR基因，並伴隨著合成多拷貝的存在於表達載體中的其它DNA，如編碼截短的GDNF蛋白質的DNA。
啟動子本發明的表達和克隆載體典型地含有被宿主生物識別的，可操作地連接到編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列上的啟動子。啟動子是位於結構基因(一般大約為100到1000bp)起始密碼子上遊(5′)的不翻譯序列，它控制特定核酸序列，如編碼截短的GDNF的序列的轉錄和翻譯。啟動子按常規分成2類，誘導性啟動子和組成性啟動子。誘導性啟動子在其控制下與培養條件中的某些改變，如存在或不存在一種營養成分或溫度改變反應而啟動增加從DNA的轉錄水平。被各種潛在的宿主細胞識別的許多啟動子是熟知的。經過用限制性酶消化從來源DNA取出啟動子並將所需的啟動子序列插入載體中將這些啟動子可操作地連接到編碼截短GDNF的DNA上。可使用天然GDNF啟動子序列指導截短的GDNF DNA的擴增和/或表達。然而如果異源性啟動子與天然啟動子相比允許表達的蛋白質轉錄更多和產量更高，且如果它與選擇使用的宿主細胞系統相配伍，那麼優選該異源性啟動子。
適用於原核宿主的啟動子包括β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統；鹼性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統和諸如tac啟動子的雜合啟動子。其它已知的細菌啟動子也是合適的。已公開了其核苷酸序列，從而使本領域的技術人員能按需要使用接頭或銜接子以提供任意所需的限制性位點將它們連接到所需DNA序列上。
用於酵母宿主的合適的啟動子序列也是本領域所熟知的。酵母增強子與酵母啟動子一起使用具有優勢。用於哺乳動物宿主細胞的合適的啟動子是熟知的且包括從諸如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(如腺病毒2)，牛乳頭瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨細胞病毒，逆轉錄病毒，B肝病毒且最優選猴病毒40(SV40)的病毒基因組獲得的那些啟動子。其它合適的哺乳動物啟動子包括異源性哺乳動物啟動子，例如，熱休克啟動子和肌動蛋白啟動子。在CHO細胞中生產GDNF蛋白質的常用啟動子是SRα。見Takebe等，分子細胞生物學，8(1)466-472(1988)。合適的表達載體是pDSRα2，在下面進一步描述。
增強子元件可將增強子序列插入載體中以增強高等真核生物轉錄編碼本發明的截短GDNF蛋白質的DNA序列。增強子是DNA的順式作用元件，通常大約10-300bp長，它作用於啟動子上以增強其轉錄。增強子相對來說對取向和位置是非依賴性。已發現它們位於轉錄單位的5′和3′端。可從哺乳動物基因獲得的一些增強子序列是已知的(例如，珠蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，α-甲胎蛋白和胰島素)。然而，典型的是，可使用來自病毒的增強子。SV40增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子，多瘤增強子和腺病毒增強子是激活真核啟動子的舉例性增強元件。儘管增強子可剪切進載體中的截短的GDNF DNA的5′或3′位置，但典型的是它位於啟動子5′位置。
轉錄終止用於真核宿主細胞(酵母，真菌，昆蟲，植物，動物，人類或來自其它多細胞生物的真核細胞)的表達載體還含有為終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。這些序列通常從真核DNA或cDNA的5′及偶爾從3′非翻譯區獲得。這些區域含有轉錄為編碼截短的GDNF的mRNA非翻譯部分的多聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
含一個或多個上述成分及所需截短的GDNF編碼序列的合適的載體的構建以標準連接技術實現。分離的質粒或DNA片段被裂解，加尾並以所需的順序再連接以產生所需的質粒。為證實已構建了正確的序列，可使用連接混合物轉化大腸桿菌，用已知技術，如上面所述的氨苄青黴素或四環素抗性可選擇成功的轉化子。然後製備來自轉化子的質粒，以限制性內切酶消化分析，和/或測序以證實所需構建體的存在。
也可使用在哺乳動物細胞中提供瞬時表達編碼截短GDNF的DNA的載體。一般來說，瞬時表達涉及使用能在宿主細胞中有效複製的表達載體，使宿主細胞積累許多拷貝的表達載體，然後合成高水平的該表達載體編碼的所需蛋白質。包含合適的表達載體和宿主細胞的瞬時表達系統允許用於對克隆DNA編碼的蛋白質進行常規陽性鑑定，以及用於迅速篩選所需生物學或生理學特性的該蛋白質。因此，瞬時表達系統在鑑定蛋白質的變異體中特別有用。
宿主細胞的選擇和轉化本發明還提供了用核酸序列轉化的宿主細胞(例如，細菌，哺乳動物，昆蟲，酵母，或植物細胞)用於表達重組截短的GDNF蛋白質。該轉化的宿主細胞在允許核酸序列表達的合適條件下培養轉化的宿主細胞。合適的宿主細胞的選擇及用於轉化，培養，擴增，篩選和產品生產及純化的方法在本領域中是熟知的。例如見，Gething和Sambrook，自然293620-625(1981)，或Kaufman等，分子細胞生物學，5(7)1750-1759(1985)或Howley等，美國專利號4419446。根據Lin等(美國專利申請號07/855,413；申請號PCT/US 92/07888，WO 93/06116)的描述可在大腸桿菌中表達截短的GDNF，該文獻中涉及成熟GDNF的表達。其它舉例性的材料和方法在下文進一步詳細討論。在合適的培養基中培養轉化的宿主細胞，然後以本領域的技術人員已知的合適方法選擇性地從培養基(或從細胞，如果在細胞內表達)中回收，分離和純化表達因子。
用於克隆或表達本文的載體的合適的宿主細胞是如上所述的原核、酵母或高等真核細胞。原核宿主細胞包括但不限於真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌，諸如枯草桿菌的桿菌屬，諸如銅綠假單孢菌的假單胞菌屬種類，傷寒沙門氏菌或粘質沙雷氏菌。另外，體外克隆方法，例如，PCR或其它核酸聚合酶反應，也是合適的。
除了原核宿主細胞外，諸如絲狀真菌或酵母的真核微生物可以是表達截短的GDNF蛋白質的合適的宿主。在低等真核宿主微生物中最常使用的是啤酒糖酵母或常見麵包酵母，但許多其它的屬，種類和菌株也是熟知的和通常可得到的。
表達糖基化的截短的GDNF蛋白質的合適的宿主細胞來自多細胞生物。該宿主細胞具有複雜的加工和糖基化活性。原則上，可使用任何高等真核細胞培養物，不管該培養物是脊椎的還是非脊椎動物的細胞，包括植物和昆蟲細胞。脊椎動物細胞一般用於在培養物(組織培養物)中繁殖脊椎動物細胞，這是一種熟知的方法。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括、但不限於以SV 40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7)，人胚胎腎細胞系(293或亞克隆用於在懸浮培養物中生長的293細胞)，幼倉鼠腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞。其它合適的哺乳動物細胞系包括但不限於Hela，小鼠L-929細胞，來自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3細胞系，BHK或HaK倉鼠細胞系。
作為適用於本發明的宿主細胞同樣有用的有細菌細胞。例如，大腸桿菌的各種菌株(例如HB101，DH5α，DH10和MC1061)在生物技術領域中作為宿主細胞是熟知的。也可採用鏈黴菌屬種類的各種菌株和類似菌株。目前優選的用於生產截短的GDNF蛋白質的宿主細胞是細菌細胞(例如，大腸桿菌)和哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞，COS細胞等)。
宿主細胞用上面所述的表達或克隆載體轉染並優選轉化並在常規營養培養基中培養。培養基可改變為適於誘導啟動子，選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因。使用本領域的技術人員熟知的且選擇為適於所涉及的宿主細胞的標準技術進行轉染和轉化。例如，對於無細胞壁的哺乳動物細胞，可使用磷酸鈣沉澱方法。也可使用電穿孔，顯微注射和其它已知技術。
培養宿主細胞用於生產本發明的截短的GDNF蛋白質的轉化細胞在合適的培養基中培養。該培養基可按需要補充激素和/或其它生長因子(如胰島素，轉鐵蛋白或表皮生長因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂和磷酸鹽)，緩衝液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素(如慶大黴素)，痕量元素(定義為無機化合物，通常以微摩爾範圍的終濃度存在)，葡萄糖或其它能源。也可包括適當濃度的其它補充物，正如本領域的技術人員可預料到的。對於選定的宿主細胞使用的合適的培養條件，如溫度，pH等也是本領域的技術人員所熟知的。
還可能經過同源重組或使用將控制元件導入已含編碼GDNF的DNA的細胞中的重組生產方法來生產截短的GDNF蛋白質。同源重組是最初為靶向基因以誘導或修正轉錄活性基因中的突變而建立的一種技術(Kucherlapati，核酸研究和分子生物學進展，36301(1989))。該基本技術作為將特異性突變導入哺乳動物基因組特定區域(Thomas等，細胞，44419-428，1986；Thomas和Capecchi，細胞，51503-512，1987；Doetschman等，美國國家科學院學報，858583-8587，1988)或校正缺陷基因內的特異性突變(Doetschman等，自然，330576-578，1987)的方法而建立。舉例性的同源重組技術在U.S.5272071(EP91903051，歐洲專利公開號505 500；PCT/US 90/07642，國際公開號WO91/09955)中描述，本文引用其說明書以供參考。
通過同源重組，將要插入基因組的DNA序列經過將其附著於靶向DNA上而導入目的基因的特定區域。靶向DNA是與基因組DNA區域互補(同源)的DNA。互補於基因組特定區域的靶向DNA的小片段在DNA複製過程中與母連結觸。插入細胞後通過共享同源區與內源性DNA的其它片段雜交和重組是DNA的一般特徵。如果該互補鏈附著於含突變或DNA的不同序列的寡核苷上，作為重組的結果它也摻入新合成的鏈上。作為校正功能的結果，DNA的新序列可能用作模板。因此，將轉移的DNA摻入基因組。
如果已知特定基因的序列，如GDNF的核酸序列，蛋白原前體序列或表達控制序列，可合成或經過如在感興趣的特定識別位點結合區合適的限制性酶切消化天然DNA獲得與基因的選定區域互補的DNA片段。該片段在插入細胞時用作靶向序列且在基因組內與其同源區雜交。如果在DNA複製期間發生雜交，該DNA片段及附著於其上的任何其它序列可充當崗奇片段並反向填補(backstitched)進新合成的DNA子鏈中。
在本發明中，附著到靶向DNA的這些片段上的是可與GDNF蛋白質的表達相互作用的DNA區域。例如，啟動子/增強子元件，抑制子或外源性轉錄調節元件以足以影響編碼所需截短的GDNF的DNA轉錄的鄰近距離和取向插入目的宿主細胞的基因組中。控制元件不編碼截短的GDNF，但控制宿主細胞基因組中存在的部分DNA。因此，不用編碼截短的GDNF基因本身的DNA轉染而使用與DNA調節片段偶聯的靶向DNA(含與感興趣的內源性基因同源的區域)可實現截短的GDNF蛋白質的表達，其中該DNA調節片段含內源性基因序列和轉錄截短的GDNF蛋白質的可識別的信號。
根據本發明，也可使用同源重組方法以修飾含正常情況下轉錄靜止的GDNF基因的細胞以產生表達GDNF的細胞。然後可加工GDNF蛋白質以形成截短的GDNF蛋白質。截短的GDNF藥用組合物截短的GDNF蛋白質產物的藥用組合物典型地包括與一種或多種藥學上和生理學上可接受的製劑材料混合的治療上有效量的截短的GDNF蛋白質產物。合適的製劑材料包括但不限於抗氧化劑，防腐劑，著色劑，調味劑和稀釋劑，乳化劑，懸浮劑、溶劑，填充劑，混合劑，緩衝劑，傳遞載體，稀釋劑，賦形劑和/或藥用佐劑。例如，合適的載體可以是注射用水，生理鹽水溶液或人工腦脊液(CSF)，很可能補充在腸胃外用藥的組合物中常用的其它物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是進一步的舉例性載體。
載體中的第一溶劑可以是含水或不含水性質的溶劑。另外，載體可含有用於修飾或維持組合物的pH，滲透壓，粘度，澄清性，顏色，無菌性，穩定性，溶解率或氣味的其它藥用上可接受的賦形劑。同樣，載體還可含有用於修飾或維持截短的GDNF蛋白產物的穩定性，溶解率或釋放率或用於促進截短的GDNF蛋白質產物吸收或穿透腦血屏障的其它藥學上可接受的賦形劑。該賦形劑是通常和習慣上用於配製以單位劑量或多劑量形式用於腸胃外用藥或以從埋植泵的連續或間歇性輸注用於直接輸注入CSF的劑型的那些物質。
一旦配製了治療性組合物，可作為溶液，懸液，凝膠，乳劑，固體或脫水或凍幹的粉末在無菌小瓶中貯存。該組合物可以以易於使用的形式或以例如凍幹，需在用藥前重配的形式貯存。
最佳藥物製劑可由本領域的技術人員根據用藥途徑和所需劑量來測定。例如，參見《Remington的藥用科學》，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA，18042)，1435-1712頁，本文引用其公開內容以供參考。組合物也可包括諸如聚乳酸，聚乙醇酸等的多聚體化合物或在脂質體中的特定製品。也可使用Hylauronic acid，它具有延長在循環中的保留時間的效力。該組合物可影響該蛋白質及衍生物的物理狀態，穩定性體內釋放速率和體內清除速率。
其它有效的用藥形式，如腸胃外緩釋製劑，吸入霧劑，口服活性製劑或栓劑也是可想像的。通常的截短的GDNF蛋白質產物藥用組合物被配製成腸胃外用藥，例如腦靜脈內注射。該腸胃外用藥的治療性組合物典型地以無致熱原的包含在藥用上可接受的載體中的截短GDNF蛋白質產物的腸胃外可接受的水溶液的形式。一個優選的載體是生理鹽水。
還預期某些含截短的GDNF蛋白質產物的組合物以口服方式用藥。以該方式用藥的截短的GDNF蛋白質產物可製成膠囊且可用或不用通常在固體劑量形式的製劑中使用的那些載體來配製。該膠囊可設計成當生物可獲得性最大且系統前降解最小時在胃腸道的該位點釋放該製劑的活性部分。可包括其它賦形劑以利於截短的GDNF蛋白質產物的吸收。也可採用稀釋劑，調味劑，低熔點蠟，植物油，潤滑劑，懸浮劑，片劑崩解劑和粘合劑。截短的GDNF蛋白質產物的用藥截短的GDNF蛋白質產物可經過皮下，肌肉內，靜脈內，經肺，經皮膚，鞘內或腦內途徑進行腸胃外用藥。不穿過血腦屏障的蛋白質生長因子可直接經腦內給藥或與將它們運輸通過屏障的其它成分相聯給藥。優選的是截短的GDNF蛋白質產物經腦靜脈內給藥或施用到腦或脊索蛛網膜下隙。截短的GDNF蛋白質產物也可經腦內直接施用到腦實質中。含包埋於生物可降解的多聚體基質中的神經營養因子的腦內緩釋型埋植體也能傳遞截短的GDNF蛋白質產物。截短的GDNF蛋白質產物可以化學修飾或包裝的形式經腦外用藥以便其穿過血腦屏障，或可與一種或多種能促進截短的GDNF蛋白質產物穿過屏障的試劑相聯用藥。例如，NGF與單克隆抗運鐵蛋白受體抗體的連接物已顯示經過結合運鐵蛋白受體而運輸到大腦。為了達到截短的GDNF蛋白質產物的所需劑量，可每天重複或偶爾注射來用藥，或從恆速或可控制流速的植入泵連續或間歇性地輸注截短的GDNF蛋白質產物。劑量頻率取決於所配製的截短的GDNF蛋白質產物的藥物動力學參數和用藥途徑。
不管何種用藥方式，典型地根據體重或體表面積計算具體劑量。對於與大腦有關的疾病，典型地根據病人的近似大腦重計算具體劑量，也可根據體重或體表面積估計。測定包括上述各種配方的合適治療劑量所需的計算的進一步精選可由本領域的普通技術人員按常規，特別是根據本文公開的劑量信息和試驗來作出。通過使用為測定所用的劑量與合適的劑量反應數相聯繫而建立的測定來確定合適的劑量。對於治療具體症狀的方法的最終劑量方案由出診醫生考慮改變藥品作用的各種因素，如病人的年齡，狀態，體重，性別和飲食，感染的嚴重性，用藥時間和其它臨床因素來確定。
本發明的截短的GDNF蛋白質產物在神經性疾病的治療中也可單獨或與其它生長因子結合使用。例如，截短的GDNF蛋白質產物可與神經生長因子結合在治療某些形式的神經性疾病中使用。另外，其它因子或其它分子，包括化學組合物可與截短的GDNF蛋白質產物一起使用。在帕金森氏病的治療中，可預期使用截短的GDNF蛋白質產物本身或與施用左旋多巴結合，其中截短的GDNF可增加內源性多巴胺的生產和神經元對濃度增加的多巴胺的吸收。
如上所述，也期望其它的神經營養或神經元營養因子對於治療某些神經元細胞群體或某些類型的損傷或疾病有用或是必需的。可用於與截短的GDNF結合的其它因子包括但不限於諸如胰島素，胰島素樣生長因子，表皮生長因子，血管活性生長因子，垂體腺苷酸環化酶激活多肽，幹擾素和促生長素抑制素的促細胞分裂原；諸如大腦產生的神經營養因子的神經營養因子，神經營養蛋白-3，神經營養蛋白4/5，神經營養蛋白-6，胰島素樣生長因子，睫狀神經營養因子，酸性和鹼性成纖維細胞生長因子，成纖維細胞生長因子-5，轉化生長因子-β，古柯鹼苯異丙胺調節的轉錄本(CART)和成熟GDNF；其它的生長因子，如表皮生長因子，白血病抑制因子，白細胞介素，幹擾素和集落刺激因子；以及與這些因子功能相當的分子和物質。
預期連續用藥或持久傳遞截短的GDNF蛋白質產物對於給定治療具有優勢。儘管經機械裝置，如用輸注泵可實現連續用藥，預期可實施連續或幾乎連續用藥的其它方式。例如，化學衍變可產生蛋白質的持續釋放形式，它具有根據確定的劑量方案以可預計量在血流中連續存在的效果。因此，截短的GDNF蛋白質產物包括衍變成實現該連續用藥的截短的GDNF蛋白質。
本發明還包括截短的GDNF蛋白質細胞療法，例如，腦內植入生產截短的GDNF蛋白質的細胞。本發明的該實施方案可包括將能合成並分泌截短的GDNF蛋白質的生物活性形式的細胞植入病人體內。這種生產截短的GDNF蛋白質的細胞可以是在正常情況下不生產神經營養因子但被修飾成生產截短的GDNF的細胞，或者它們可以是經過用適於表達和分泌截短的GDNF蛋白質的多核苷酸轉化而增強了其生產GDNF的能力的細胞。為了減小因施用外源種類的GDNF而在病人中的潛在的免疫學反應，優選該細胞是人類來源的且產生截短的人GDNF蛋白質。
植入的細胞可包入膠囊以避免細胞滲入腦組織。人類或非人類動物細胞可以在生物相容性，半通透性聚合外套或膜中植入病人以允許釋放截短的GDNF蛋白質產物，但防止病人免疫系統或來自周圍組織的其它有害因素破壞該細胞。另外，來自體內的轉化成生產截短的GDNF的病人自身的細胞可不經這類包被直接植入病人。
活細胞的膜包被的方法學對本領域的普通技術人員來說是熟悉的，可實現包被細胞的製備並將其植入病人。例如，見美國專利號4892538；5011472；和5106627，本文引用其說明書以供參考。用於包裝活細胞的系統也在Aebischer等的PCT申請WO 91/10425中進行了描述，本文特別引用以供參考。也參見Aebischer等的PCT申請WO91/10470；Winn等，實驗神經學，113322-329，1991；Aebischer等，實驗神經學，111269-275，1991；Tresco等，ASAIO，3817-23，1992，此處引用這些文獻以供參考。
也可想像體內截短的GDNF蛋白質基因治療。其中將編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列直接導入病人。例如，經過局部注射含或不含合適的傳遞載體，如腺伴隨病毒載體的核酸構建體可將編碼截短的GDNF蛋白質的核酸序列導入靶細胞。任選的病毒載體包括，但不限於逆轉錄病毒，腺病毒，單純皰疹病毒和乳頭瘤病毒載體。經過局部注射所需的核酸構建體或含所需核酸序列的其它合適的傳遞載體，直接注射(裸露DNA)，受體介導的轉移(配體-DNA複合物)，或微粒子轟擊(基因槍)可在體內實現物理轉移。
應注意本文描述的截短的GDNF蛋白質製劑可用於脊椎動物及人類的應用，且術語「病人」不應以限制性方式解釋。在脊椎動物應用的情況下，劑量範圍應與上面限定的相同。
作為進一步鑑定本發明的截短的GDNF蛋白質的一種工具，可形成結合截短的GDNF蛋白質，如X-[Cys41-Cys133]-Y胺基酸序列內的抗原決定簇的抗體。本領域的普通技術人員可使用熟知的，公開的程序獲得特異性地識別和結合由本發明的胺基酸序列所編碼的各種蛋白質的單克隆和多克隆抗體或重組抗體。然後，該抗體可用於純化和鑑定截短的GDNF蛋白質。另外，該抗體可用作它們所針對的蛋白質的治療性抑制劑。
考慮到下列舉例性的實施例將會明白本發明的其它方面和優勢。實施例1闡述了成熟GDNF在哺乳動物細胞系統中的表達及截短的GDNF蛋白質的製備。實施例2闡述了成熟GDNF在細菌細胞系統中的表達。實施例3闡述了各種截短的GDNF蛋白質在細菌細胞系統中的表達。實施例4在多巴胺能神經元神經營養活性試驗中比較了成熟GDNF蛋白質與截短的GDNF蛋白質的生物學活性。
實施例實施例1成熟的人GDNF在CHO細胞中的表達及CHO細胞產生的截短的GDNF蛋白質的純化材料下列材料用於在二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞(CHOd-細胞，例如，如Urlaub和Chasin，美國國家科學院學報77(7)4216-4220(1980)所述)中表達人GDNF。
CHOd-培養基含Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)-高葡萄糖(Gibco/BRL)；5％胎牛血清(HyClone)；MEM非必需胺基酸(1％)(Gibco/BRL)；次黃嘌呤/胸苷(1％)(Gibco/BRL)；和穀氨醯胺/青黴素/鏈黴素(1％)(Irvine Scientific)。
選擇性培養基含DMEM(高葡萄糖)；5％透析的胎牛血清(HyClone)；MEM非必需胺基酸；和穀氨醯胺/青黴素/鏈黴素。
2X HEPES-緩衝鹽水(HBS)含280mM NaCl；10mM KCl；1.5mM Na2HPO4；12mM葡聚糖；和50mM HEPES。
Tris-緩衝鹽水加Tween(TBST)含137mM NaCl；20mM Tris/HClpH 7.5；和0.1％Tween-20。方法轉染和選擇將CHOd-細胞(第20代)以8×105個細胞/皿的密度接種入60mm組織培養皿(Falcon)的CHOd-生長培養基中。在第二天，轉染前大約3小時時，用新鮮培養基換掉細胞中的培養基。
使用熟知技術製備含合適的GDNF cDNA的質粒構建體。例如，基本上按1990年3月29日申請的共同擁有和共同未決的美國專利申請系列號501904(也見1990年3月18日申請的歐洲專利申請號90305433，公開號EP 398753和WO 90/14363(1990)，本文引用其說明書以供參考)所述的方法製備質粒構建體pDSRα2。說明載體的結構組織的舉例性質粒圖譜在圖2中描述。本領域的技術人員可預料到也可使用各種編碼成熟GDNF蛋白質的核酸序列，如在圖1，3和4中所述的序列。
經限制性酶消化從pcDNA3為基礎的表達載體(Invitrogen，SanDieg o，CA)中回收含人GDNF編碼序列和共有Kozak序列，CCACC(ATG)的Hind III-XbaI DNA片段。將DNA片段直接克隆進HindIII/Xbal切割pDSRα2中。所得的質粒稱為pSW5。pSW5的質粒DNA在轉染前在Puvl位點線性化。
pDSRα2(圖2)是質粒pCD(Okayama和Berg，分子細胞生物學，3280-289，1983)的衍生物，具有3個主要的改變(i)SV40多聚腺苷化信號被來自牛卵泡刺激激素的α亞基，α-bFSH的信號(Goodwin等，核酸研究，116873-6882，(1983)取代，(ii)將小鼠二氫葉酸還原酶小基因(Gasser等，美國國家科學院學報，796522-6526，1982)插入表達盒下遊以允許選擇和擴增轉化子；和(iii)按以前所述(Takebe等，分子細胞生物學，8466-472，1988)克隆含「R-元件」和部分人T-細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的長末端重複(LTR)的「U5」序列的267bp片段並插入SV40啟動子和剪接信號之間。
製備含終濃度為3.0μg/皿GDNF-質粒DNA，7.0μg/皿小鼠腎基因組載體DNA(Clontech)，25μl/皿2.5M CaCl2和無菌蒸餾水至終體積為250μl/皿的DNA溶液。同樣製備含pDSRα2載體DNA的DNA溶液或單獨的載體DNA分別作為陽性和陰性對照。向等體積的2×HEPES-緩衝鹽水中逐滴加入DNA溶液，同時向溶液通入氣泡。將DNA/HBS溶液在室溫下培養30分鐘。
從CHOd-細胞培養物中去掉培養基，在每皿中加入500μl DNA溶液。培養皿在室溫下培養30分鐘，此後向每皿中加入CHOd-培養基(5.0ml)。然後將皿在37℃培養過夜。
在第二天用新鮮的CHOd-培養基換掉培養基。在第二天當細胞達到匯合時，培養物用胰酶消化並以1×60mm皿到8×100mm皿的比率再塗布到100mm皿(Falcon)上。在選擇性培養基中再塗布細胞。每2到3天用新鮮培養基再培養培養物。
15天後，使用玻璃克隆筒分離轉染的細胞集落，胰蛋白酶消化並再塗布到24孔盤(Falcon)上。從GDNF/pSW5-轉染的細胞分離總共40個集落。剩餘的在盤上的細胞經胰酶消化，合併且再塗布進2個100mm皿中(每個DNA構建體一個細胞庫)。
轉染細胞的篩選24孔及合併培養物生長到匯合，此時去掉生長培養基並用無血清培養基取代(400μl/孔或4ml/皿)。將細胞培養48小時並收穫條件培養基。以Western印跡分析條件培養基樣品的GDNF蛋白質表達。條件培養基的等分試樣(20μl或40μl)用電泳樣品緩衝液(有或無β-巰基乙醇)稀釋。含β-巰基乙醇的樣品煮沸3分鐘(還原條件)。將還原的和非還原的樣品走16％Tris-甘氨酸凝膠(Novex)。將凝膠電印跡到硝酸纖維素濾膜(Schleicher和Schuell BA-83，0.2μ)上。用TBST漂洗印跡，然後在TBST中的5％幹牛牛奶(Carnation)的封閉溶液中室溫下培養30分鐘。然後將印跡用GDNF抗血清(抗大腸桿菌產生的GDNF的兔多克隆抗血清；1∶1000溶於5％牛奶/TBST中)在室溫下處理1小時。然後用TBST漂洗印跡並用1％牛奶/TBST洗滌1×10分鐘和2×5分鐘。然後用抗兔Ig辣根過氧化物酶連接的第二抗體(1∶15,000，在1％牛奶/TBST中)處理20分鐘。漂洗印跡並用TBST洗滌1×20分鐘和2×10分鐘，接著用ECL試劑(Amersham)處理1分鐘並對Hyperfilm-ECL(Amersham)曝光。
下面過程描述了從1升條件培養基中純化CHO-表達的GDNF和CHO-產生的剪短的GDNF同型二聚體。由於在CHO培養基中明顯的蛋白酶作用在殘基31處剪斷該鏈，該過程可包括在純化期間使用蛋白酶抑制劑。步驟1，玻珠色譜經過加入1/5體積的1M MES，pH 6.0，使無血清條件培養基含20mM 2-[N-嗎啉代]乙烷磺酸(MES)，pH6.0。加入25ml用20mMMES，pH6.0平衡的SP瓊脂糖大顆粒樹脂(Pharmacia)並在4℃攪拌1小時。經過使其沉降並倒掉條件培養基來收集樹脂。倒掉的培養基通過多孔圓片濾紙過濾以回收未沉降的樹脂。沉降的樹脂及經過濾回收的樹脂重懸並倒入2.5cm直徑的柱中，用3倍柱體積的0.15M NaCl，20mM MES，pH6.0(A緩衝液)洗滌。用300ml從A緩衝液到1.0M NaCl，20mM MES，pH6.0(B緩衝液)的梯度以0.2柱體積/分的流速洗脫蛋白質，在280nm處監測吸光率。收集含1.1柱體積的級份。以Western印跡分析檢測級份中GDNF的存在。合併含GDNF的級份用於進一步純化。GDNF在0.3和0.6M NaCl之間洗脫。步驟2，HPLC C4色譜使步驟1的合併液含0.1％(v/v)三氯乙酸(TFA)，通過0.45微米濾膜真空過濾，使之通過用含水的10％的乙腈，0.1％TFA(A緩衝液)條件化的Vydac C4柱(0.46×25cm)。用2％/分的線性梯度在50分鐘內從A緩衝液到含水的90％乙腈，0.1％TFA(B緩衝液)洗脫蛋白質，在280nm處測吸光率。收集1毫升級分，以Western印跡分析檢測GDNF的存在。在45％和55％乙腈之間洗脫GDNF。級分在真空中乾燥。步驟3，高效S色譜來自步驟2的含GDNF的級分重溶於1ml 0.15M NaCl，10mM Tris，pH8.0中並使之過0.75×7.5cm TSK-Gel 5WP高效S柱(Toso Haas)。以1ml/分的流速在50分鐘內從0.15M NaCl，10mM Tris，pH8.0(A緩衝液)到1.0M NaCl，10mM Tris，pH8.0(B緩衝液)流過0.4％/分的線型梯度。在280nm處測量吸光率收集1分鐘級分。在35％B緩衝液時，將梯度變成在10分鐘內6.5％/分。級分的Western印跡分析顯示出四個主要的GDNF成分。在0.4％/分鐘梯度期間洗脫出其中的3種成分，在6.5％/分梯度期間洗脫出第4種成分。製備具有相似成分的合適的合併液並進行測序。測序分析將大約29-36kD的合併液鑑定為[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質。大約38-40kD的成分鑑定為[Arg32-Ile134]截短的GDNF/成熟GDNF異型二聚體。最後，在後一部分梯度期間分離的大約41-44kD的成分經測序鑑定為成熟GDNF同型二聚體。
實施例2在大腸桿菌中生產的成熟人GDNF根據Lin等所述的方法(1994年5月23日申請的美國專利申請號08/182,183和其優先權申請；1992年9月17日申請的PCT/US 92/07888(WO 93/06116)；和歐洲專利申請號92921022.7(公開號EP 610254)；本文引用其說明書以供參考)實現成熟的人GDNF在細菌中的表達。根據本發明的描述，本領域的普通技術人員可預料到各種材料和方法容易用於或適應於在大腸桿菌和其它細菌中進行合適的表達。例如，選擇的多核苷酸，如在圖1，3和4中所述的那些多核苷酸可用於表達方法。表達的成熟GDNF的再摺疊和純化按下面所述在5℃(除非另有說明)處理轉化的細胞使用含5mMEDTA的25mM Tris，pH8.5將細胞沉澱(paste)(30gm)懸浮於200ml的終體積中以產生15％(w/v)的最終細胞懸液。使用Biospec手握式低剪切勻漿器徹底分散細胞。將懸液以14,500psi通過微流儀2次以破碎細胞並釋放包含體。然後將所得的勻漿產物在16,000xg下離心30分鐘。離心所得的包含體沉澱經過使用如前所述的Biospec勻漿器重懸於冷水中達到終體積為240ml以形成懸液進行洗滌。保留該懸液樣品用於GDNF表達水平的HPLC分析。所得的懸液在16,000xg下離心30分鐘。棄去上清，向離心瓶中加入少量冷水並輕輕旋動以去掉在包含體沉澱頂部疏鬆形成的膜層。用Biospec勻漿器使用足夠體積的冷水重懸沉澱以產生2mg/ml的GDNF濃度。經過將最終包含體懸液(25ml)與含180mM半胱氨酸HCl，和50mM Tris HCl，pH8.7的8M鹽酸胍(25ml)混合溶解包含體。溶解混合物在25℃攪拌60至90分鐘，然後伴隨混合將其注入含20mM Tris HCl，pH8.75和0.2M鹽酸胍的2M尿素(450ml，5℃)中。在5℃緩慢攪拌重摺疊混合物72小時。
按如下方法部分純化重摺疊的GDNF伴隨著迅速攪拌向重摺疊混合物中加入20mM乙酸鈉緩衝液(250ml，pH5)，5℃。用冰乙酸將pH調到5。經過以13,600xg在5℃離心45分鐘去掉所得的沉澱。離心的上清用作上樣溶液，用於涉及用SP-大顆粒樹脂(Pharmacia)的陽離子交換色譜的下一步純化。使用20mM乙酸鈉(pH5)作為平衡，漂洗和洗脫緩衝系統在5℃操作柱。用5倍柱體積(CV)的0.2N NaOH衛生處理樹脂床(5ml)，然後用乙酸緩衝液(5CV)平衡。將上樣溶液(190ml)以0.5CV/分過柱，接著用乙酸緩衝液以相同的流速進行10CV洗滌。然後用在乙酸緩衝液中的從0.3M到0.9M的20CV的NaCl，線性梯度以0.1CV/分的流速從樹脂中洗脫出GDNF。以280nm的吸光率監測柱的洗脫並收集級分進行SDS-PAGE試驗。從前面GDNF峰10％的峰高到峰後10％的峰高合併含GDNF的級分。在該合併液中的蛋白質完全是GDNF，根據所使用的生產菌株，含有32％到12％修飾的GDNF形式的汙染物。然後將合併液用PBS或其它配方形式的緩衝液透析，在某些情況下，經超濾濃縮到25mg/ml。為了比較涉及相應的生產菌株的製品的純度，用反相HPLC，陽離子交換HPLC，質譜法、和內毒素水平鑑定以該方法純化的GDNF野生型和類似物形式。
實施例3截短的GDNF在大腸桿菌中的重組生產基本上按照Lin等所述的技術(1994年5月23日申請的美國專利申請號08/182,183，出處同上)生產舉例性的截短的GDNF蛋白質。也可使用如上所述的另選的細菌表達材料和方法。大腸桿菌表達的截短的GDNF蛋白質包括分別在圖5，6和7中所述的[Pro23-Ile134]，[Arg32-Ile134]和[Gly33-Ile134]截短的GDNF蛋白質。編碼這些舉例性的截短的GDNF蛋白質的多核苷酸按圖5，6和7所述構建，但也可使用諸如在圖1，3和4中所述的那些多核苷酸的相應多核苷酸。按在PCR技術，DNA擴增的原則和應用，Henry A，Erlich編輯，Stockton Press，NY，1989(第6章，使用PCR改造DNA)中所述的標準PCR程序構建多核苷酸，本文引用該文獻以供參考。
實施例4多巴胺能神經元神經營養活性的生物測定在定量基礎上評價實施例3的大腸桿菌表達的[Pro23-Ile134]，[Arg32-Ile134]，[Gly33-Ile134]和[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質及實施例1的CHO產生的[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質促進灰質多巴胺能神經元的多巴胺吸收的能力。材料下列材料用於在截短的GDNF蛋白質存在下評價多巴胺能神經元存活的試驗
細胞培養基高葡萄糖Dulbecco’s修飾的Eagle’s培養基(DMEM，目錄號11965-092)，Ham’s F12培養基(F12，#11765-021)，無碳酸氫鈉的Leibovitz’s L15培養基(#41300-039)，B27培養基補充劑(#17504-010)，青黴素/鏈黴素(#15070-014)，L-谷胺醯胺(#25030-016)，Dulbecco’s磷酸鹽緩衝鹽水(D-PBS，#14190-052)，具有鈣和鎂鹽的Hank平衡鹽溶液(HBSS；#24020-026)，N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES；#15630-015)，小鼠層粘連蛋白(#23017-015)，和牛血清白蛋白級分V(#110-18-017)均來自GIBCO，Grand Island，NY。熱滅活的馬血清來自HyClone，Logan，Utah。伴白蛋白(C-7786)，多聚-L-鳥氨酸溴氫化物(P-3655)，牛胰島素(I-5500)，人運鐵蛋白(T-2252)，腐胺(P-6024)，孕酮(P-6149)，亞硒酸鈉(S-9133)，三碘苯甲醯氨基葡萄糖(M-3383)均來自Sigma化學公司，Saint-Louis，MO。木瓜蛋白酶，脫氧核糖核酸酶I(DNAase)和卵清蛋白(木瓜蛋白酶解離系統)來自Worthington Biochemicals，Freehold，NJ。
Falcon無菌96-孔微量平板(#3072)，組織培養塑料用品和聚丙烯離心管來自Becton-Dickinson，Oxnard，CA。Nunc Lab-Tek組織培養室蓋玻片(#136439)來自Baxter，Irvine，CA；20μm(#460)尼龍網來自Tetko，Elmsford，NT；4#解剖鑷和4″解剖剪來自Roboz Surgical，Washington，DC。
抗體和相關試劑多克隆兔抗酪氨酸羥化酶抗體(TE101)來自Eugene Tech，Ridgefield Park，NJ；多克隆兔抗-神經元特異性烯醇化酶抗體(NSE，AB951)來自Chemicon，Temecula，CA；生物素標記的羊抗兔IgG和過氧化物酶連接的親和素/生物素複合物(ABC Elite；Vectastain試劑盒PK-6100)來自載體實驗室，Burlingame，CA。3′，3′-二氨基聯苯胺來自Cappel Laboratories，West Chester，PA。PBS中的Superblock封閉緩衝液來自Pierce化學公司，Rockford，IL。Triton X-100(X100)，Nonidet P-40(N6507)和過氧化氫(30％，v/v，H1009)來自Sigma。GBR-12909多巴胺吸收抑制劑(D-052)來自RBI，Natick，MA。3H-多巴胺(滴定多巴胺，NE-131；21 Ci/mmol)來自New England Nuclear，Boston，MA。Optiphase Supermix閃爍混合物來自Wallac，Turku，Finland。白色ViewPlate-96孔微滴定板(#6005182)來自Packard儀器公司，Meriden，CT。所有其它試劑可從Sigma化學公司獲得，除非另有說明。
培養基的製備以DMEM和F12培養基的1∶1混合物製備基礎培養基，以加入50倍濃縮的貯液補充B27培養基。以大約2mM的終濃度加入L-穀氨醯胺，加入青黴素至大約100IU/l，鏈黴素至大約100mg/l。加入熱滅活的馬血清至大約15％的終濃度。混合後，將pH調到大約7.3，培養基在4℃保存。為了減小實驗內變化，用前新製備培養基。整個過程中使用塑料吸管和容器以減少蛋白質吸附。
培養基質為了使神經元和神經突的外延最佳附著於基質上，按下面所述用多聚-L-鳥氨酸和層粘連蛋白順序覆蓋修飾微滴度板表面(培養基質)。用在0.1M硼酸(pH8.4)中的0.1mg/ml無菌多聚-L-鳥氨酸溶液在室溫下完全覆蓋平板表面至少1小時，接著用Super-Q水無菌洗滌。然後吸出水洗液，加入在PBS中的1.0μg/ml小鼠層粘連蛋白溶液並在37℃下培養2小時。為了保證結果的可重複性，剛好在使用平板前進行這些程序。
胚胎大鼠灰質培養物的製備胚胎大鼠腦用作灰質多巴胺能神經元的來源。使用15日胚期的定時受孕Sprague-Dawley大鼠。每個實驗最多處理36個胚胎(大約3升)。經過接觸CO2殺死妊娠大鼠，用解剖剪打開腹腔，從子宮取出胎兒。然後解剖胚胎的大腦，消除血液和腦膜，使用精確的解剖界標解剖含灰質的下被蓋區(Altman和Bayer，產前大鼠腦發育圖譜，CRC出版社，Boca Raton，FL.1995)。在冰冷的D-PBS中收集組織，轉移進10ml解離培養基(120單位木瓜蛋白酶和2000單位的DNAase溶於HBSS)中並在大約200rpm的搖床上大約37℃培養45分鐘。然後經過用火磨光的巴斯德吸管研磨分散細胞，篩過20μm Nitex網以棄去未解離的組織，使用IEC臨床離心管以200xg離心5分鐘。所得的細胞沉澱重懸入含卵清蛋白和大約500單位的DNA酶的HBSS中，頂部覆蓋4％的卵清蛋白溶液(HBSS)，在500xg下離心大約10分鐘。最終的沉澱重懸於完全培養基(見上)中，調到大約28,000個細胞/ml，以等份試樣(90μl)接種入預先用多聚鳥氨酸和層粘連蛋白覆蓋的6mm孔的96孔微滴度平板中。迅速發生細胞的附著且塗板效率為大約75％。
多巴胺能神經元的免疫組織化學使用如下略有修改的Louis等(藥物學實驗及治療雜誌，2621274-1283，1992；科學，259689-692，1993)所述的間接免疫過氧化物酶方法鑑定灰質培養物中的多巴胺能神經元。在室溫下用D-PBS，pH7.4中的4％低聚甲醛固定培養物大約30分鐘，接著在D-PBS(每6mm孔200μl)中洗滌3次。然後在含1％NP-40的PBS中的Superblock封閉緩中液中培養固定的培養物以增加抗體的穿透。然後應用在相同緩衝液中以大約1∶2000稀釋的第一兔抗酪氨酸羥化酶抗體並在搖床中37℃培養1小時。用D-PBS洗滌3次後，使用大約1∶500稀釋的羊抗兔生物素標記的IgG檢測結合的抗體；將這些第二抗體與細胞在37℃下培養大約1小時。然後用D-PBS洗滌細胞3次。用1∶500稀釋的抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物檢測第二抗體，將細胞在37℃下培養大約45分鐘。用D-PBS再洗滌3次後，培養物在含0.04％，3′，3′-二氨基聯苯胺(HCl)4，0.06％NiCl2和0.02％過氧化氫的0.1M Tris-HClpH7.4的溶液中反應5-20分鐘。
測定神經元的存活如上所述固定和處理灰質培養物用於免疫染色，然後用亮視野顯微鏡以200×放大倍數檢查。在96孔微滴度平板的整個6mm孔中計數酪氨酸羥化酶染色的神經元數目。活神經元鑑定為具有規則形狀的細胞體，具有主要軸狀突起和一些樹狀突起。從計數中排除顯示出退化特徵的神經元，如具有不規則的，具泡的核周質或片段化的神經突(然而，大多數退化神經元從培養基質上脫離)。多巴胺能神經元細胞數表達為TH陽性神經元/6-mm孔或相對於對照多巴胺能神經元密度的倍性改變。
測定多巴胺吸收在白色View Plate-96孔微滴度平板上形成的15日齡胚胎大鼠灰質神經元培養物中測定多巴胺吸收。用由含大約120mM NaCl，4.7mM KCl，1.8mM CaCl2，1.2mM MgSO4，32mM NaHPO4，1.3mM EDTA，和5.6mMD-葡萄糖的修飾的Krebs-Ringer溶液pH7.4組成的預溫的吸收緩衝液(大約100μl)洗滌培養物。吸收緩衝液也含1mM抗壞血酸和50μMpargyline以防止多巴胺的氧化。然後細胞在吸收緩衝液中37℃預培養大約10分鐘。然後以在75μl吸收緩衝液中大約50nM的濃度向灰質培養物中加入氚標記的多巴胺(3H-DA，21Ci/mmol)，培養物在37℃培養大約60分鐘。經過用含多巴胺吸收抑制劑GBR-12909(1μM)的吸收緩衝液培養培養物測定非特異性多巴胺吸收。非特異性的吸收代表不超過總吸收的大約1％。經過吸出培養基接著用冰凍的吸收緩衝液(大約120μl)迅速洗滌3次停止吸收試驗。然後經過加入OptiphaseSupermix閃爍混合物(200μl)裂解細胞，使用Wallac MicrobetaPlus 96-孔微滴度平板計數器經閃爍譜計測定放射活性(即，經閃爍計數培養物中保留的氚分析多巴胺的吸收)。結果表達為dpm/6-mm孔或相對於對照培養物的倍數改變。分析多巴胺能神經元存活和形態學發育富含多巴胺能神經元的15日胚(E15)大鼠灰質培養物用於證實截短的GDNF蛋白質對多巴胺能神經元存活的效力。培養物在多聚鳥氨酸和層粘連蛋白覆蓋的96-孔微滴度平板上單獨或在各種濃度(變化範圍從大約1pg/ml到大約10ng/ml)的下列蛋白質大腸桿菌表達的成熟hGDNF；大腸桿菌表達的[Pro23-Ile134]，[Arg32-Ile134]，[Gly33-Ile134]和[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質；CHO細胞表達的成熟人GDNF；和CHO細胞產生的[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質，存在的條件下生長達6天。培養基由補充15％熱滅活的馬血清(E15培養物)或2.5％熱滅活的馬血清，D-葡萄糖，HEPES，胰島素和運鐵蛋白(P6培養物)的DMEM/F12組成。對酪氨酸羥化酶(TH)，多巴胺生物合成中的限速酶的免疫染色用作多巴胺能神經元的標記。由於菱腦中的去甲腎上腺素能神經元也對TH染色呈陽性，所以應極小心地解剖局限於中腦下被蓋的區域以避免含去甲腎上腺素能細胞體的更向後的區域。6天後，E15培養物典型地由以神經元特異性烯醇化酶免疫染色(上述)鑑定的大約70％的神經元和30％非神經元細胞(具有扁平的，顏色較暗的外觀)組成；多巴胺能神經元代表大約10-15％的神經元群體。
6天後，用低聚甲醛固定培養物並免疫染色鑑定培養物中多巴胺能神經元的標記，酪氨酸氧化酶。在亮視野顯微鏡下計數存在於6-mm孔中的所有酪氨酸羥化酶陽性神經元。在各實驗條件下分析3到6個不同的孔。結果表達為在對照培養物中發現的酪氨酸羥化酶陽性神經元數的百分數。
用1.0ng/ml GDNF，CHO細胞表達的GDNF或大腸桿菌表達的GDNF處理的E15灰質培養物比未處理的對照培養物分別多含大約38％和27％的TH-免疫活性神經元，表明兩種GDNF種類促進多巴胺能神經元的存活。用1.0ng/ml截短的GDNF蛋白質處理的E15灰質培養物體外培養6天後培養物中TH-陽性神經元數同樣增加；CHO細胞產生的[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質為42％；大腸桿菌表達的[Arg32-Ile134]和[Gly33-Ile134]截短的GDNF蛋白質分別為26％和17％。
對照培養物與用成熟和截短的GDNF蛋白質處理的培養物的比較也揭示了所有GDNF蛋白質對多巴胺能神經元形態分化的顯著影響。[Arg32-Ile134]和[Gly33-Ile134]截短的GDNF蛋白質的效力與它們各自的成熟GDNF蛋白質對應物的效力相同。在所有GDNF處理的培養物中TH免疫反應神經元比對照培養物中的TH-陽性神經元具有明顯更複雜和廣泛的神經突樹狀分枝以及更高程度的神經突分枝和總體上更大的細胞體大小。
多巴胺吸收多巴胺吸收測量了高親和力多巴胺再吸收運載蛋白位點的數目和活性並反應了多巴胺能神經元的功能分化。在含有或不含成熟GDNF或截短的GDNF蛋白質的E15大鼠灰質培養物中體外培養6天後測量多巴胺的吸收。在這些培養物中，多巴胺吸收具有多巴胺能神經元的藥物學形態特徵，即被1.0μM GBR-12909一種對多巴胺能神經元特異性的多巴胺運載蛋白抑制劑(ID50＝20nM)幾乎完全抑制(超過98％)。這表明多巴胺吸收測量不反應汙染的去甲腎上腺素能神經元的存在，該神經元能通過去甲腎上腺素吸收多巴胺，但對GBR-12909抑制不敏感。CHO-細胞表達的成熟GDNF和CHO產生的[Arg32-Ile134]截短的GDNF蛋白質的效力相同，大約增加65％，ED50為大約20pg/ml。圖5所示的大腸桿菌表達的[Pro23-Lys37ΔAsn37-Ile134]截短的GDNF蛋白質表現出增加65％，ED50為大約40pg/ml。大腸桿菌表達的成熟蛋白質和大腸桿菌表達的[Arg32-Ile134]，[Glg33-Ile134]和[Lys37-Ile134]截短的GDNF蛋白質對多巴胺吸收的影響相同大約增加50％，ED50為大約50pg/ml。
這些結果表明，截短的GDNF蛋白質對灰質多巴胺能神經元充當有效的促進存活和誘導分化的因子。因此，可想像它們在帕金森氏病，以情緒敏感度下降，隨意和不隨意肌肉運動變慢，肌肉僵硬和震顫為特徵的神經學紊亂的治療中特別有用。這些症狀由位於灰質中的產多巴胺神經元的逐步退化引起。這些神經元(「多巴胺能神經元」)的退化導致稱為紋狀體的大腦相近區域的多巴胺減少。序列描述(1)一般信息(i)申請人Hu，Sylvia(ii)發明題目截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子(iii)序列數50(iv)聯繫地址(A)聯繫人安姆根有限公司(B)街道德哈維蘭路1840號(C)城市千橡樹(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵政編碼91320(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Curry，Daniel R.
(B)登記號32，727(C)參考/摘要號A-357(ix)電信信息(A)電話805-447-8102(B)電傳805-499-8011(C)電報(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度402個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵
(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1…402(xi)序列描述SEQ ID NO1TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT CGG 48Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg1 5 10 15CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT CGG AGA 96Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg20 25 30GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT TTA 144Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu35 40 45AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA CTG ATT 192Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile50 55 60TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT GAG ACA ACG TAC GAC 240Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp65 70 75 80AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG AGT GAC AAA 288Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys85 90 95GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC CTG TCG 336Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser100 105 110TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT 384Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala115 120 125AAA AGG TGT GGA TGT ATC 402Lys Arg Cys Gly Cys Ile130(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度134個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg20 25 30Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu35 40 45Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile50 55 60Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp65 70 75 80Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys85 90 95Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser100 105 110Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala115 120 125Lys Arg Cys Gly Cys Ile130(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Lys Asn Arg Gly1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Gly Lys Asn Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特徵(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5 10(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5 10(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly1 5 10(2)SEQ ID 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Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys1 5 10 15Asn Arg Gly(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly1 5 10 15Lys Asn Arg Gly20(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特徵(A)長度21個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg1 5 10 15Gly Lys Asn Arg Gly20(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特徵(A)長度22個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln1 5 10 15Arg Gly Lys Asn Arg Gly20(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特徵(A)長度23個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly1 5 10 15Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特徵(A)長度24個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg1 5 10 15Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特徵(A)長度25個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg1 5 10 15Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特徵(A)長度26個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO25Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly1 5 10 15Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特徵(A)長度27個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys1 5 10 15Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特徵(A)長度28個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly1 5 10 15Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO28Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg1 5 10 15Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特徵(A)長度30個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO29Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser1 5 10 15Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25 30(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特徵(A)長度31個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO30Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn1 5 10 15Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25 30(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特徵(A)長度32個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO31Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu1 5 10 15Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly20 25 30(2)SEQ ID NO32信息(i)序列特徵(A)長度33個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO32Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro1 5 10 15Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg20 25 30Gly(2)SEQ ID NO33信息(i)序列特徵(A)長度34個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO33Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn1 5 10 15Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn20 25 30Arg Gly(2)SEQ ID NO34信息(i)序列特徵(A)長度35個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO34Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala1 5 10 15Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys20 25 30Asn Arg Gly35(2)SEQ ID NO35信息(i)序列特徵(A)長度36個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO35Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala1 5 10 15Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly20 25 30Lys Asn Arg Gly35(2)SEQ ID NO36信息(i)序列特徵(A)長度37個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO36Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg20 25 30Gly Lys Asn Arg Gly35(2)SEQ ID NO37信息(i)序列特徵(A)長度38個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO37Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln20 25 30Arg Gly Lys Asn Arg Gly35(2)SEQ ID NO38信息(i)序列特徵(A)長度39個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO38Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln1 5 10 15Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly20 25 30Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly35(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特徵(A)長度417個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO39CATATGTCTC CGGATAAACA AATGGCTGTT CTTCCACGTC GTGAACGTAA CCGTCAGGCG 60GCCGCTGCTA ACCCGGAGAA TTCCCGTGGT AAAGGTCGTC GTGGTCAGCG TGGTAAAAAC 120CGCGGTTGCG TTCTGACCGC TATCCACCTG AACGTTACCG ACCTGGGTCT CGGTTACGAA 180ACCAAAGAAG AATTAATCTT CCGTTACTGC TCCGGTTCCT GCGACGCTGC TGAAACCACG 240TACGACAAAA TCCTGAAAAA CCTGTCCCGT AACCGTCGTC TGGTTTCCGA CAAAGTTGGT 300CAAGCTTGCT GCCGTCCGAT CGCTTTCGAC GACGACCTGT CCTTCCTGGA CGACAACCTG 360GTTTACCACA TCCTGCGTAA ACACTCCGCT AAGCGTTGCG GTTGCATCTA AGGATCC417(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特徵(A)長度417個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO40CATATGAGCC CGGACAAACA GATGGCAGTA CTTCCACGTC GTGAACGTAA TCGCCAGGCA60GCAGCTGCAA ACCCGGAAAA CTCCCGTGGT AAAGGTCGCC GTGGCCAGCG CGGCAAAAAC 120CGTGGTTGTG TTCTGACTGC AATCCACCTG AACGTTACTG ACCTGGGTCT GGGCTACGAA 180ACCAAAGAAG AACTGATCTT CCGCTACTGC AGCGGCTCTT GCGACGCAGC TGAAACCACT 240TACGACAAAA TCCTGAAAAA CCTGTCCCGT AACCGCCGTC TGGTAAGCGA CAAAGTAGGT 300CAGGCATGCT GCCGTCCGAT CGCATTCGAC GATGACCTGA GCTTCCTGGA TGACAACCTG 360GTTTACCACA TCCTGCGTAA ACACTCCGCT AAACGCTGCG GTTGCATCTA AGGATCC 417(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特徵(A)長度345個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1…342(xi)序列描述SEQ ID NO41ATG TCC CCA GAA AAT TCT CGT GGT AAA GGT CGT CGT GGT CAG CGT GGT 48Met Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly135 140 145 150AAT AAC CGC GGT TGC GTT CTG ACC GCT ATC CAC CTG AAC GTT ACC GAC 96Asn Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp155 160 165CTG GGT CTC GGT TAC GAA ACC AAA GAA GAA TTA ATC TTC CGT TAC TGC 144Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys170 175 180TCC GGT TCC TGC GAC GCT GCT GAA ACC ACG TAC GAC AAA ATC CTG AAA 192Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys185 190 195AAC CTG TCC CGT AAC CGT CGT CTG GTT TCC GAC AAA GTT GGT CAA GCT 240Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala200 205 210TGC TGC CGT CCG ATC GCT TTC GAC GAC GAC CTG TCC TTC CTG GAC GAC 288Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp215 220 225 230AAC CTG GTT TAC CAC ATC CTG CGT AAA CAC TCC GCT AAG CGT TGC GGT 336Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly235 240 245TGC ATC TAA 345Cys Ile(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特徵(A)長度114個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO42Met Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly1 5 10 15Asn Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp20 25 30Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys35 40 45Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys50 55 60Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala65 70 75 80Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp85 90 95Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly100 105 110Cys Ile(2)SEQ ID NO43信息(i)序列特徵(A)長度315個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞 CDS(B)位置1…312(xi)序列描述SEQ ID NO43ATG CGT GGT CAA CGT GGT AAA AAC CGC GGT TGC GTT CTG ACT GCA ATC48Met Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile115 120 125 130CAC CTG AAC GTT ACT GAC CTG GGT CTG GGC TAC GAA ACC AAA GAA GAA96His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu135 140 145CTG ATC TTC CGC TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAC GCA GCT GAA ACC ACT 144Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr150 155 160TAC GAC AAA ATC CTG AAA AAC CTG TCC CGT AAC CGC CGT CTG GTA AGC 192Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser165 170 175GAC AAA GTA GGT CAG GCA TGC TGC CGT CCG ATC GCA TTC GAC GAT GAC 240Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp180 185 190CTG AGC TTC CTG GAT GAC AAC CTG GTT TAC CAC ATC CTG CGT AAA CAC 288Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His195 200 205 210TCC GCT AAA CGC TGC GGT TGC ATC TAA 315Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile215(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特徵(A)長度104個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO44Met Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile1 5 10 15His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu20 25 30Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr35 40 45Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser50 55 60Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp65 70 75 80Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His85 90 95Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile100(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特徵(A)長度312個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1…309(xi)序列描述SEQ ID NO45ATG GGT CAA CGT GGT AAA AAC CGT GGT TGT GTT CTG ACT GCA ATC CAC48Met Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His105 110 115 120CTG AAC GTT ACT GAC CTG GGT CTG GGC TAC GAA ACC AAA GAA GAA CTG96Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu125 130 135ATC TTC CGC TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAC GCA GCT GAA ACC ACT TAC 144Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr140 145 150GAC AAA ATC CTG AAA AAC CTG TCC CGT AAC CGC CGT CTG GTA AGC GAC 192Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp155 160 165AAA GTA GGT CAG GCA TGC TGC CGT CCG ATC GCA TTC GAC GAT GAC CTG 240Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu170 175 180AGC TTC CTG GAT GAC AAC CTG GTT TAC CAC ATC CTG CGT AAA CAC TCC 288Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser185 190 195 200GCT AAA CGC TGC GGT TGC ATC TAA 312Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile205(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特徵(A)長度103個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO46Met Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His1 5 10 15Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu20 25 30Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr35 40 45Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp50 55 60Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu65 70 75 80Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser85 90 95Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile100(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特徵(A)長度135個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO47Met Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn1 5 10 15Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg20 25 30Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His35 40 45Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu50 55 60Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr65 70 75 80Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp85 90 95Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu100 105 110Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser115 120 125Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile130 135(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特徵(A)長度104個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO48Met Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile1 5 10 15His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu20 25 30Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr35 40 45Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser50 55 60Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp65 70 75 80Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His85 90 95Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile100(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特徵(A)長度103個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO49Met Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His1 5 10 15Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu20 25 30Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr35 40 45Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp50 55 60Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu65 70 75 80Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser85 90 95Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile100(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特徵(A)長度114個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO50Met Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly1 5 10 15Asn Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp20 25 30Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys35 40 45Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys50 55 60Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala65 70 75 80Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp85 90 95Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly100 105 110Cys Ile
權利要求
1.具有胺基酸序列X-[Cys41-Cys133]-Y的截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白質產物，及其添加，取代和內部缺失變異體和衍生物，其中[Cys41-Cys133]代表圖1(SEQ ID NO2)所述的Cys41到Cys133的胺基酸序列；Y代表Cys133的羧基末端基團或Ile134的羧基末端胺基酸殘基；X代表Cys41的甲硫氨醯化的或非甲硫氨醯化的氨基或選自下列基團的氨基末端胺基酸殘基GRGNRGKNRG(SEQ ID NO3)GKNRG(SEQ ID NO4)RGKNRG(SEQ ID NO5)QRGKNRG(SEQ ID NO6)GQRGKNRG(SEQ ID NO7)RGQRGKNRG(SEQ ID NO8)RRGQRGKNRG(SEQ ID NO9)G RRGQRGKNRG(SEQ ID NO10)KG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO11)GKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO12)RGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO13)SRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO14)NSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO15)ENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO16)PENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO17)NPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO18)ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO19)A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO20)AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO21)AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO22)QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO23)RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO24)NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO25)RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEO ID NO26)ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO27)RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO28)RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO29)P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO30)LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO31)VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO32)AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO33)MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO34)QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO35)KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO36)DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO37)和PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO38)。
2.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO24)。
3.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝NPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO18)。
4.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝PENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO17)。
5.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝SRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO14)。
6.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝RGQRGKNRG(SEQ ID NO8)。
7.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝GQRGKNRG(SEQ ID NO7)。
8.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝KNRG(SEQ ID NO3)。
9.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物或其變異體，其中X＝NRG。
10.根據權利要求1到9的截短的GDNF蛋白質產物，其中所說的胺基酸序列是糖基化的。
11.根據權利要求1到9的截短的GDNF蛋白質產物，其中所說的胺基酸序列是非糖基化的。
12.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物，其中所說的衍生物是與水溶性多聚體結合的X-[Cys41-Cys133]-Y胺基酸序列。
13.編碼根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質的多核苷酸。
14.根據權利要求13的多核苷酸，包含圖1所述序列的一部分。
15.根據權利要求13的多核苷酸，包含圖3所述序列的一部分。
16.根據權利要求13的多核苷酸，包含圖4所述序列的一部分。
17.根據權利要求13的多核苷酸，包含圖5所述的序列。
18.根據權利要求13的多核苷酸，包含圖6所述的序列。
19.根據權利要求13的多核苷酸，包含圖7所述的序列。
20.一種載體，包含可操作地連接到表達控制序列上的權利要求13的多核苷酸。
21.用權利要求13的多核苷酸轉化或轉染的原核或真核宿主細胞。
22.製備截短的GDNF蛋白質的方法，包含在合適的營養培養基中培養權利要求21的宿主細胞並任選從所說的細胞或所說的營養培養基中分離所說的截短的GDNF。
23.根據權利要求22的製備截短的GDNF蛋白質的方法，其中所說的宿主細胞是大腸桿菌。
24.根據權利要求22的製備截短的GDNF蛋白質的方法，其中所說的宿主細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
25.製備截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白質的方法，包含下列步驟(a)培養用權利要求20的載體轉化或轉染的原核或真核宿主細胞；(b)在允許所說的宿主細胞表達截短的GDNF蛋白質的條件下維持所說的宿主細胞；和(c)任選分離由所說的宿主細胞表達的截短的GDNF蛋白質。
26.一種截短的GDNF蛋白質，它是含權利要求13的外源性多核苷酸的原核或真核宿主細胞的重組表達產物。
27.一種藥物組合物，包含與藥學上可接受的載體相關的根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物。
28.一種藥物組合物，包含與藥學上可接受的載體相關的根據權利要求22的方法生產的截短的GDNF蛋白質。
29.一種藥物組合物，包含與藥學上可接受的載體相關的、根據權利要求25的方法產生的截短的GDNF蛋白質。
30.一種治療帕金森氏病的方法，包含給病人施用權利要求27的藥用組合物。
31.一種治療帕金森氏病的方法，包含給病人施用權利要求13的多核苷酸序列以提供體內生產所說的截短的GDNF蛋白質。
32.治療帕金森氏病的方法，包含給病人植入用權利要求13的多核苷酸序列轉化的細胞以提供體內生產所說的截短的GDNF蛋白質。
33.一種神經膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)組合物，包含成熟的GDNF蛋白質和一種或多種截短的GDNF蛋白質，其中所說的成熟GDNF蛋白質具有大約44kDa的分子量，且其中所說的截短的GDNF蛋白質具有大約29到40kDa的分子量。
34.根據權利要求33的GDNF組合物，包含至少2種截短的GDNF蛋白質，其中第一種分子量為大約36kDa，第二種分子量大約為40kDa。
35.根據權利要求34的GDNF組合物，其中所說的具有大約40kDa分子量的第二截短的GDNF種類是具有大約22kDa分子量的成熟GDNF單體和具有大約18kDa分子量的截短的GDNF單體的異源二聚體。
36.從權利要求33的GDNF組合物分離的截短的GDNF蛋白質，並且具有大約29到40kDa的分子量。
37.從權利要求33的GDNF組合物分離的截短的GDNF蛋白質，並且具有大約29到36kDa的分子量。
38.從重組修飾的細菌或哺乳動物細胞表達的成熟GDNF蛋白質產生的截短的GDNF蛋白質以及其添加，取代和內部缺失變異體，所說的截短的GDNF蛋白質具有胺基酸序列X-[Cys41-Cys133]-Y。其中[Cys41-Cys133]代表圖1(SEQ ID NO2)所示的Cys41到Cys133的胺基酸序列；Y代表Cys133的羧基末端基團或Ile134的羧基末端胺基酸殘基；X代表Cys41的氨基或選自下列基團的氨基末端胺基酸殘基GRGNRGKNRG(SEQ ID NO3)GKNRG(SEQ ID NO4)RGKNRG(SEQ ID NO5)QRGKNRG(SEQ ID NO6)GQRGKNRG(SEQ ID NO7)RGQRGKNRG(SEQ ID NO8)RRGQRGKNRG(SEQ ID NO9)G RRGQRGKNRG(SEQ ID NO10)KG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO11)GKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO12)RGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO13)SRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO14)NSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO15)ENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO16)PENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO17)NPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO18)ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO19)A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO20)AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO21)AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO22)QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO23)RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO24)NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO25)RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO26)ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO27)RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO28)RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ IO NO29)P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO30)LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO31)VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO32)AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO33)MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO34)QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO35)KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO36)DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO37)和PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(SEQ ID NO38)
39.根據權利要求38的截短的GDNF蛋白質及其變異體，其中X選自下列序列GRGNRGKNRG(SEQ ID NO3)GKNRG(SEQ ID NO4)RGKNRG(SEQ ID NO5)QRGKNRG(SEQ ID NO6)GQRGKNRG(SEQ ID NO7)RGQRGKNRG(SEQ ID NO8)和RRGQRGKNRG(SEQ ID NO9)。
40.根據權利要求38的截短的GDNF蛋白質，其中成熟的GDNF蛋白質由重組修飾的細菌細胞表達且所說的截短的GDNF蛋白質在體外或體內生產。
41.一種製備藥物組合物的方法，其中治療上有效量的根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物與一種或多種藥學上可接受的載體混合。
42.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物在治療由疾病或損傷引起的神經系統的損傷中的應用。
43.根據權利要求42的截短的GDNF蛋白質的應用，用於治療帕金森氏病。
44.根據權利要求1的截短的GDNF蛋白質產物在製備治療由疾病或損傷引起的神經系統的損傷的藥物組合物中的應用。
全文摘要
本發明公開了新的蛋白質,稱為截短的神經膠質細胞系來源的神經營養因子(截短的GDNF)蛋白,它促進多巴胺被多巴胺能細胞吸收且促進神經細胞的存活。還公開了經重組遺傳工程技術獲得截短的GDNF蛋白質的方法。
文檔編號C07KGK1197461SQ96197233
公開日1998年10月28日 申請日期1996年9月16日 優先權日1995年9月28日
發明者胡小芬 申請人:安姆根有限公司