攜帶雙鏈rna靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗的製作方法

2023-06-27 23:19:46

專利名稱：:攜帶雙鏈rna靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗的製作方法攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗
技術領域：
：本發明涉及一種攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗，該疫苗可進行基因轉移、免疫和疫苗接種，屬於生物
技術領域：
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背景技術：
慢病毒是一種RNA病毒，屬於逆轉錄病毒科，因其病毒顆粒中含有依賴RNA的逆轉錄酶而得名。慢病毒基因主要編碼gag,pol和env3個基本的結構蛋白，以及4個輔助蛋白和2個調節蛋白。該科病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV),猴免疫缺陷病毒(SIV)，白血病病毒等，其中以HIV-I的研究最多，並在相關研究的基礎上發展出慢病毒載體系統，被廣泛應用於基因轉導與基因表達等方面的研究[1-3]。慢病毒載體的構建的基本原理就是將HIV-I基因組中的順式作用元件和編碼反式作用因子的序列進行分離。整個載體系統由包裝部分和載體部分構成包裝部分去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列，但能夠反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白；載體部分則含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV-I順式作用序列，並具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。載體包含的結構基因包括編碼病毒的核心蛋白的gag基因，基因編碼病毒複製所需酶類的pol，編碼病毒的包膜糖蛋白的env基因，以及編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶的pro基因[4]。1996年，為了進一步降低兩部分基因發生同源重組而生成具有複製能力的病毒的可能性，Naldini等人採用表達水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質粒，取代表達HIV本身包膜蛋白Env的質粒，包裝獲得了以HIV-Igagpol為骨架，以VSV-G或MLV-E蛋白作為包膜的嵌合病毒。該方案突破了最初的HIV-I載體僅對CD4+細胞的親嗜性限制，並且病毒滴度可達到IO7108TU/ml。這為採用逆轉錄病毒載體進行其他病毒的包膜蛋白功能研究提供了方便[5-6]。通過對載體序列的優化和改造，慢病毒載體作為基因治療工具已有大量文獻報導[7-9]。與其他病毒載體相比，其優點主要表現為1.能高效轉導廣泛的細胞(包括DC細胞)。2.針對載體骨架的免疫原性較弱，可多次反覆加強免疫。3.體外轉導特異抗原的DC可引起較強的體內外細胞應答。但是，單純採用慢病毒載體作為疫苗，其需要能夠穩定、永久地整合到宿主染色體上,通過持續表達目的蛋白刺激機體才能產生相應的免疫反應,從生物安全性方面而言，這是一個極大的缺陷。所以，本發明著眼於採用慢病毒載體轉染細胞包裝獲得的假型病毒顆粒作為疫苗應用[10-12]。Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLR)是參與非特異性免疫的一類極其重要的蛋白受體，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁。當微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時，TLR可以識別它們並激活機體產生免疫細胞應答。新近研究發現，病毒複製的中間產物雙鏈RNA能被TLR3特異識別，通過激活NF-κB和幹擾素IFN-β前體誘導炎症細胞釋放I型幹擾素，從而增強抗原特異性CD8+T細胞應答，促進樹突狀細胞的抗原呈遞，激活抗病毒天然免疫[13-16]。因此本發明將能編碼病原蛋白的雙鏈RNA引入假病毒顆粒，一方面可利用其與TLR3的結合激活天然免疫，另一方面可通過介導其在宿主細胞的表達從而誘導產生病原特異的細胞免疫反應。本發明具有以下特點1.利用反式互補技術，可利用慢病毒載體快速獲得攜帶天然構象中和抗原的假型病毒顆粒，並可對包膜蛋白進行人工突變快速獲得相應的病毒樣顆粒。2.與其他蛋白亞單位疫苗相比，假病毒顆粒更穩定，並可通過超離方法或超濾濃縮純化。3.對於難以培養或表達的病毒糖蛋白以及存在生物安全隱患的病毒，假病毒顆粒的製備是一種可選擇的替代途徑。4.結合雙鏈RNA佐劑效應的假病毒顆粒疫苗可兼顧病毒顆粒樣(VLP)疫苗與DNA疫苗兩者的優勢，同時激發天然免疫，和抗原特異的體液免疫與細胞免疫，可以用於多次同型或異型疫苗聯合免疫。基於以上特點，通過基因改造獲得攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗進行基因轉移、免疫和疫苗接種相關應用具有良好的前景。
發明內容本發明的目的是提供一種免疫效果好、安全、製備周期短的採用假型慢病毒顆粒的新型疫苗及其製備方法。該型疫苗可以刺激機體產生體液與細胞雙重免疫應答，可用於防治HCV，流行性感冒等病毒感染性疾病。在本發明的第一方面，提供了包裝獲得假型慢病毒顆粒所需的三質粒包裝系統。具體包括I.包裝質粒PCMVDR8.2D64E:整合酶區域第64位胺基酸D(GAT)突變為E(GAG)，使其成為整合酶缺陷的包裝載體。2.轉導質粒PCS:具有自我滅活特性的並且帶有佐劑基因，除此之外還可選擇插入其他抗原蛋白基因或報告基因。其攜帶的表達基因將隨假病毒顆粒轉染宿主細胞並進行表達。3.表達質粒包含完整的病原包膜蛋白基因系列，可高效表達目的病原的包膜蛋白。所述的表達質粒，可在包括pVRC、phCMV、pcDNA3.I、pcDNA6.0、pCIneo(+)、pReceiver等真核表達質粒中進行優選。在本發明的第二方面，提供了一種假型慢病毒顆粒，它由權利要求I所述的重組表達質粒轉染靶細胞後表達形成，除含有按要求插入病原蛋白編碼序列外不含慢病毒核苷酸。所述的靶細胞包括BHK21、293、239T、Hela等來源於真核生物的傳代細胞系。在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合，它含有上述重組表達質粒表達的假型慢病毒顆粒和藥學上可接受的佐劑或載體。在本發明的第四方面，提供了本發明的假型慢病毒顆粒的用途，用於製備預防和治療C型肝炎或流感的藥物。在本發明的第五方面，提供了一種製備假型慢病毒顆粒的方法，包括以下步驟I)將權利要求I所述的含有病原微生物結構蛋白編碼序列的重組表達質粒對靶細胞進行瞬時轉染。2)當所述的祀細胞充分表達抗原結構蛋白時,收穫細胞上清。3)將上清過濾去除細胞碎片後，採用蔗糖超速離心對病毒進行分離富集，亦可採用免疫親和層析進行分離純化。藥物組合本發明所述的藥用組合物可以包含實際使用時所選用的藥學上可以接受的緩衝齊U，也包含用於預定用途的其它物質。本領域已有多種緩衝劑適用於預定用途，本領域的技術人員都善於選擇的緩衝劑。在一些實例中，該藥用組合可以含有藥學上可接受的保溼齊U，藥學上可接受的各種保溼劑在多種公開出版物都有敘述，包括如中華人民共和國藥典(2010版)。所述的藥用組合物可製備出各種劑型，如注射劑、片劑、丸劑、膠囊、噴霧劑等。適用於局部使用和口服的藥用級別的有機或無機載體或稀釋劑。本領域已知的稀釋劑包括水性介質、植物性和動物性油脂。還可用穩定劑、乳化劑、維持PH值的各種緩衝劑和皮膚滲透增強劑等作為輔助材料。當本發明用作疫苗時，假型慢病毒顆粒疫苗可採用多種方法進行配製。通常情況下，按本領域熟知的各種方法，用藥學上可以接受的載體或運載體配製本發明的疫苗。合適的藥用載體包括無菌生理鹽水，也可用其它無菌的水性和非水性的等滲注射液，是本領域技術人員熟知的藥學上可接受的載體。配製本發明的疫苗組合物時還可含有其它成分，如佐劑、穩定劑、PH調節劑、防腐劑等。這些成分都是疫苗領域的技術人員所熟知的。佐劑包括(但不限於)鋁鹽佐劑、皂苷佐劑、CpG佐劑等。穩定劑包括(但不限於)精氨酸、乙基纖維素、多元醇、胺基酸、無機鹽、PEG等。給藥途徑與劑量當用作疫苗時，可用本領域技術人員熟知的方法將本發明的假型慢病毒顆粒疫苗施用於個體。通常採用與常規疫苗相同的施用途徑或模擬病毒感染的途徑施用這些疫苗。採用疫苗組合物的形式時，除含有假型慢病毒顆粒外，還可包括藥學上可以接受的載體、佐齊U、穩定劑、pH調節劑等。給藥常規與途徑包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、靜脈注射、經口服等，如果需要也可採用組合給藥途徑。疫苗組合物的給用劑量可以單劑量，也可多劑量，且可給予加強劑量以維持被施用個體的免疫力。在所選用的給藥途徑中，應以"有效劑量"為給予假型慢病毒顆粒疫苗的量，足以引發被施用個體的免疫應答，能有效保護被施用個體抵抗目的病原微生物的感染。所述的有效劑量，是指在疫苗組合物中所選用的假型慢病毒顆粒疫苗的量是按可引發個體免疫保護性應答而無明顯的副作用的量確定。本發明以疫苗組分中P24蛋白抗原的定量為基礎計算有效劑量，該劑量包括例如相當於O.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒。在小鼠中，優選劑量可為O.5ng至50ng，而在馬中優選劑量可為50ng至500ng。具體疫苗的最佳用量可通過實驗免疫後觀察對象的抗體滴度和其它反應來確定，通過檢測疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強劑量，施用佐劑或免疫刺激劑可提高本發明假病毒顆粒的免疫應答，這些都是本領域的技術人員所熟知的。本發明人經過深入的研究，建立了假型慢病毒顆粒疫苗製備技術，並快速製備獲得了安全性好、免疫效價高的假型慢病毒顆粒疫苗，在此基礎上完成了本發明。和現有技術相比，本發明具有以下優點I.提高了免疫的有效性假型慢病毒顆粒表面預免疫病原微生物的主要包膜蛋白成分，免疫宿主個體後可以產生對目的病原的免疫活性。並且由於假病毒的組織親嗜性和感染過程與真病毒相同，因此可以模擬天然病毒的早期感染過程，有效刺激機體的免疫應答。2.提高了疫苗的安全性。[0032]本發明的假型慢病毒顆粒所含的核酸僅為單一抗原基因，為一過性表達，不具有複製和再度感染的能力，並且在載體構建過程中對載體的整合酶進行了功能缺失，極大的降低了載體隨機整合的可能性，從而可以最大程度地降低疫苗使用的風險。3.操作簡便，生產周期短。在構建了重組表達質粒後，轉染細胞後收穫上清，再經離心分離或過柱純化即可獲得該顆粒疫苗。步驟過程簡單，從獲得病原包膜蛋白基因到獲得假型病毒顆粒，規範操作的周期僅為一周左右，並且擴增規模可以通過轉染質粒量進行量化控制，非常適合應急病原疫苗的製備。圖I:HCV假病毒顆粒包裝系統的製備與鑑定a為包裝質粒pCMVDR8.2D64E的結構圖示及，突變後測序結果山為轉導質粒pCS(pCS-NS3為例)結構示意，及瞬時轉染293T細胞後的表達鑑定結果；c為表達質粒PVRC-E1E2的結構示意，及瞬時轉染293T細胞後的表達鑑定結果。圖2:HCV假病毒顆粒及其鑑定a為包裝獲得的假病毒顆粒結構示意圖b為負染電鏡顯示的病毒顆粒形態；c和d為濃縮的病毒顆粒進行westernblot鑑定E2，P24,NS3的結果。圖3=HCV假病毒疫苗免疫後的體液免疫反應測定a為單獨採用HCV假病毒顆粒免疫，第二針與第四針免疫後採血檢測的小鼠針對HCVE1，E2，NS3的特異性抗體水平；b為添加佐劑後第二，三，四針後檢測的抗體水平。兩者顯示隨著免疫次數的增加，抗體水平逐漸提高，而且不添加佐劑的抗體水平與添加組相似，說明本疫苗單純免疫及有很好的免疫增強效果。圖4=HCV假病毒疫苗免疫後的細胞免疫反應測定採用ELISP0T檢測HCV假病毒顆粒疫苗免疫四針後小鼠針對HCVEl,E2，NS3的特異性T細胞免疫水平。具體實施方式下面以HCV假型慢病毒顆粒疫苗作為具體實施實例，對本發明進行闡明。應當指出，這些實例僅用於進一步闡明本發明，而不用於限制本發明的適用範圍。以下實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社，2005)等本領域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產廠家所建議的條件進行。實施例I:假病毒包裝系統的製備I.I整合酶缺陷的包裝質粒pCMVDR8.2D64E的製備根據文獻的報導，將包裝質粒pHR』CMVAR8.2中聚合酶區域第64位胺基酸D(GAT)突變為E(GAG)，可以使整合酶活性喪失，卻不影響轉導效率[17，18]。具體流程如下I)將pHR』CMVΔR8.2質粒與含突變序列的pNL_IND64E質粒分別轉化甲基化缺陷的E.coliK12細菌感受態2)質粒提取後均採用SalI和BclI雙酶切，切膠回收pHR』CMVΛR8.2中的IOkb片段和PNL-IND64E中的3.4kb片段。[0046]3)將上述回收片段以I:5的摩爾比例連接後轉化DH5a感受態。4)提取質粒酶切鑑定後測序確認。I.2轉導質粒PCS-CG-NS3的製備及表達能力鑑定根據模板質粒PUC-H155序列設計引物，上下遊引物各引入酶切位點。引物為NS3-5:TCTGCTAGCTGGTGGTGCTGGATATCAT(NheI)；NS3-3TCACTCGAGCATTAGGTCACCACTTCCA(XhoI)。將引物用無菌水稀釋成10μΜ,反應體系為pfxDNApolymeraselμI,dNTP(2.5mΜ)6μI,IOXAmp.buffer5μI,模板5叩，1^041111，引物各2111，模板5^，無菌水補足至5(^1。？0反應條件為:94°C預變性5min；94°C30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，共30個循環；最後72°C延伸IOmin15PCR產物經I%瓊脂糖凝膠電泳檢測大小，片段大小預期約為1900bp。切膠回收，取55μ1Elutionbuffer洗脫,瓊脂糖凝膠電泳估計濃度約為IOOng/μI。用NheI和XhoI分別酶切PCR產物和載體pCS_CG，酶切體系如下PCR產物(NS3)I.5μg，酶NheI和XhoI各I.5μ1,10Xbuffer25y1，BSA0.5μI，無菌水補至50μI；載體pCS-CG取2μg，酶NheI和XhoI各2μ1，10Xbuffer25y1，BSAO.5μI，無菌水補至50μI;37°C酶切2h。I%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。將回收的載體和片段於16°C連接過夜轉化DH5a感受態，同時設載體對照和自連對照。連接產物轉化後的單克隆菌落做菌落PCR初步鑑定正確後，提質粒酶切以及測序進一步鑑定其正確性。在經多克隆篩選及測序鑑定無誤後，大量擴增獲得超純無內毒素質粒。取適量質粒對293T細胞進行瞬時轉染後收集細胞進行WesternBlot檢測，通過特異性單克隆抗體檢測可見在相應位置有明顯的陽性條帶(圖lb)。按脂質體試劑說明書(Lipofectamine2000,Invitrogen)轉染293T細胞，具體方法如下I)轉染前24h，用胰蛋白酶消化對數生長期的293FT細胞，以含10%血清的培養基調整細胞密度為5X105細胞/ml，重新接種於25cm2細胞培養瓶，37°C、5%C02培養箱內培養。24h後待細胞融合度達70%-80%時即可用於轉染。2)轉染前2h將細胞培養基更換為無血清培養基。3)向一滅菌離心管中加入所製備的各質粒溶液(pCMVDR8.2D64E載體8μg，PCS-NS3質粒4μg.pCMV-CElE2質粒4μg)。與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為O.3時，在室溫下孵育5分鐘。4)將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻，取50μILipofectamine2000試劑在另一管中與O.3mlOpti-MEM混合，在室溫下孵育5min。5)把稀釋後的質粒與稀釋後的Lipofectamine2000進行混合,輕輕地混勻後，室溫孵育15min。6)將Lipofectamine2000與質粒混合液小心加入至293FT細胞的培養液中，混勻，於37°C、5%C02細胞培養箱中培養。7)培養8h後倒去含有轉染混和物的培養基，每瓶細胞加入5ml的pH值為7.4的PBS液，輕輕洗去殘餘的轉染混和物後倒去。8)每瓶細胞中加入5ml含10%血清的細胞培養基，於37°C、5%C02培養箱內繼續培養48小時。收集細胞後，參照《分子克隆實驗指南》的SDS-PAGE方法進行樣品處理和電泳，電轉移到硝酸纖維素膜上，用小鼠抗NS3的單克隆抗體作一抗，IRdye-800cw標記的兔抗小鼠抗體(Licor公司)作二抗進行免疫印跡(Westernblot)鑑定,有特異性抗原表達者為穩定轉染細胞克隆。附圖Ib顯示了Westernblot鑑定結果,說明質粒能有效表達NS3蛋白。I.3表達質粒PVRC-E1E2的制各在真核表達質粒pVRC的多克隆位點，將編碼HCV包膜蛋白E1E2的基因序列插入。在經多克隆篩選及測序鑑定無誤後，大量擴增獲得超純無內毒素質粒。取適量質粒對293T細胞進行瞬時轉染後收集細胞進行樣品處理和電泳，電轉移到硝酸纖維素膜上，用小鼠抗HCVEI,E2的單克隆抗體作一抗,IRdye-800cw標記的兔抗小鼠抗體(Licor公司)作二抗進行免疫印跡(Westernblot)鑑定，有特異性抗原表達者為穩定轉染細胞克隆。附圖Ic顯示了Westernblot的鑑定結果,說明質粒能有效表達HCVE1,E2蛋白。實施例2=HCV假病毒顆粒的製備2.I細胞培養採用含10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium,DMEM)(GIBCO)培養人293FT細胞。培養條件為37°C>5%C02。細胞傳代方法如下I)棄去舊培養液，加入5ml滅菌PBS溶液，輕輕清洗細胞後棄去。2)加入Iml胰酶消化液，輕輕流過細胞後棄去，用殘存液體消化細胞l_2min，直到細胞完全消化下來。3)加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基5ml，用刻度吸管吹打，將瓶壁上的細胞衝洗下來。4)補加液體至10ml，混勻後分至兩個新的培養瓶中，繼續培養。細胞株的凍存I)取培養2-3天生長旺盛的細胞，用含90%胎牛血清和10%二甲基亞碸配成凍存液，將細胞配成2x106-2x107個/ml。2)在Iml細胞凍存管中加入Iml細胞懸液，混勻後密封。置4°CIh,-20°C2h，然後直接放入液氣中或直液氣蒸汽上過夜後浸入液氣中。細胞復甦I)從液氮罐中取出細胞凍存管。2)迅速放入盛有37°C溫水的水浴中解凍。3)用70%酒精擦拭消毒後，移至淨化臺上，吸出細胞懸液至培養瓶中，補加3ml含10%FBS的DMEM完全培養基，置37°C、5%C02孵箱培養。4)次日更換一次培養液後再繼續培養。2.2質粒轉染293FT細胞採用脂質體(Lipofectamine2000,Invitrogen)介導質粒轉染,具體方法與前述質粒鑑定方法相同。2.3假病毒顆粒的分離根據慢病毒載體的特性，使用20%蔗糖超速離心的方法進行濃縮和純化。具體方法如下I)收集轉染後48/h的293FT細胞上清液。[0086]2)於4°C，4000g離心lOmin，除去細胞碎片後以O.45μm濾器過濾上清液。3)把病毒粗提液樣品小心加入5ml20%蔗糖溶液上方，SW32超速離心管(Beckman超速離心機)，4°C,22000rpm超速離心120min。4)棄去上清，浙幹後加入適量PBS溶解後即為病毒濃縮液。5)將病毒濃縮液移出，分裝後保存在病毒管中，-80度長期保存。取其中一支進行病毒生物學滴度測定。圖2顯示其電鏡與westernblot鑑定結果。實施例3=HCV假病毒顆粒疫苗的動物實驗為證實假型慢病毒的免疫效果，我們採用分別採用HCV假病毒顆粒疫苗，DNA疫苗，腺病毒載體疫苗對BalB/c小鼠進行免疫後，比較分析其免疫效果。3.I疫苗的製備方法HCV假病毒顆粒疫苗由本單位自製，為表面為HCVE1E2包膜蛋白並攜帶HCVNS3基因的假型慢病毒。由於HCV病毒有不同的型別，E1E2在不同型別的差別較大，本實例選取了中國流行率較高lb，作為HCVE1E2模板製備了表達質粒，並包裝獲得了相應型別的假病毒顆粒。並根據p24定量，以注射用生理鹽水配置成20ug/ml。添加佐劑的疫苗組,選用氫氧化招佐劑1.Omg/ml(按Al3+計算，lmg/ml)。免疫分組分組---------_^第一針(O周)第二針(3周)第三針(6周)第四針(9周)A__HCVpp__HCVpp__HCVpp__HCVppBHCVpp+佐齊IJ__HCVpp+佐齊IJ__HCVpp+佐劑HCVpp+佐劑C_PBS__PBS__PBS_PBS動物免疫雌性SPF級BALB/c小鼠，體重16-18克，每組12隻。於第0、28天肌肉注射蛋白疫苗，免疫劑量O.Iml0第98天時採用Ad-SSl免疫，免疫劑量O.1ml，肌肉注射。每次免疫後兩周眼眶採血，並於末次免疫後兩周摘眼球取血，分離血清，測定前凍存於-20°C。將小鼠脫頸處死後無菌取脾，研磨分離獲得脾細胞懸液，計數調整細胞濃度後立即用於ELISP0T檢測。免疫保護效果檢測I.小鼠血清中E1E2特異性IgG的ELISA測定採用真核表達的HCVEl,E2蛋白包被ELISA板。將小鼠血清以PBS從I:100作倍比稀釋，以PBS組I:50稀釋後檢測的A450/650值的平均值的2.I倍作為(Cutoff)界值，各組實驗動物血清抗E1，E2的幾何平均滴度見圖3a。2.小鼠血清中NS3特異性IgG的ELISA測定採用原核表達的C44p蛋白包被ELISA板。將小鼠血清以PBS從I:100作倍比稀釋，以PBS組I:50稀釋後檢測的A450/650值的平均值的2.I倍作為(Cutoff)界值，各組實驗動物血清抗-NS3的幾何平均滴度見圖3b。3.HCVEI,E2，NS3特異性細胞免疫測定小鼠Y-IFN細胞因子ELISP0T試劑購自BD公司。按說明書操作，在包被抗用抗γ-IFN抗體後，每孔加入100ul含El，E2，NS3抗原多肽的脾細胞培養懸液，每孔脾細胞數為5x105個，37°C5%C02靜置培養24h;棄去培養液後，分步加入檢測抗體和顯色液顯色，Bioreader4000斑點分析儀計數斑點形成數(SFC)。根據斑點數的多少判斷特異性殺傷T細胞的數量，該數量的多少與細胞免疫強度呈正相關。結果見圖4。參考文獻[I]李振宇，徐開林.慢病毒載體構建及結構優化[J].國外醫學分子生物學分冊，2002，24:310-313.[2]Suzuky,Y.,Craigie,R..Theroadtochromatin-nuclearentryofretroviruses[J].Naturereviews.Microbiology:2007,5(3)187-96.[3]SolaimanF,ZinkMA,XuG,etal.Modularretro-veetorfbrtransgenicandtherapeuticuse.MolecularReprodDevelop,2000,56:309-315.[4]鄧繼先，沈偉.用慢病毒載體製備轉基因動物的研究進展[J].生物工程學雜誌·2004，24(9):18-20.[5]NaldiniL,BlQmerU，GallayP，OryD，etal.Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector[J].Science.1996；272(5259):263-7.[6]DulITiZuffereyRiKellyM，etal.Athird-generationlentivirusvectorwithaconditionalpackagingsystem[J].JVirol.1998,72(11):8463-71.[7]HuB，TaiA,WangP.Immunizationdeliveredbylentiviralvectorsforcancerandinfectiousdiseases[J].ImmunolRev.2011Jan；239(1):45-61.[8]YoshimitsuM，SatoT，TaoK.BioluminescentimagingofamarkingtransgeneandcorrectionofFabrymicebyneonatalinjectionofrecombinantlentiviralvectors[J].PNAS.2004(48):16909-14.[9]ZuffereyR，ThomasDull，RonaldJ.MandeI,etal.Self-inactivatinglentivirusvectorforsafeandefficientinvivogenedelivery[J].JViroll998；72:9873-9880.[10]Fischer,A.andM.CavazzanaCalvo.IntegrationofRetrovirusesAFineBalancebetweenEfficiencyandDanger[J].PLoSMed.2005,2(I):22-24.[ll]DirkNehring，RalfPoertner，MatthiasSchweizer,etal.IntegratedinlinefiltrationAmethodtoproducehighlyconcentratedretroviralvectortitersupernatant[J]·Desalination，2009，246(246):241-247.[12]TeresaRodriguesa，ManuelJ.T.Carrondo，PaulaM.Alvesa,etal.PurificationofretroviralvectorsforclinicalapplicationBiologicalimplicationsandtechnologicalchallenges[J].JournalofBiotechnology，2007，127(3):520-541.[13]ChristianeSH，MartinE,EdithJ，etal.SyntheticDouble-StrandedRNAsAreAdjuvantsfortheInductionofTHelperIandHumoralImmuneResponsestoHumanPapillomavirusinRhesusMacaques[J].PLoSPathog.2009,5(4):1-15.[0117][14]SalaunB，GreutertM,RomeroP.Toll-likereceptor3isnecessaryfordsRNAadjuvanteffects.Vaccine[J].2009Marl3；27(12):1841-7.[15]BotosI,LiuL,WangY,SegalDM,etal.Thetoll-likereceptor3:dsRNAsignalingcomplex[J].BiochimBiophysActa.2009Sep-Oct;1789(9-10):667-74.[16]孫瑞利，張宇，胡錦躍.Toll樣受體3在病毒感染及細胞凋亡中的生物學功能[J]·國際病理科學與臨床雜誌.2009，29(I):37-40.[17]LeavittAD,ShiueLandHEVarmus.Site-directedmutagenesisofHIV-Iintegrasedemonstratesdifferentialeffectsonintegrasefunctionsinvitro[J].J.Bio.Chem，1993；268:2113-2119.[18]EngelmanA.InVivoAnalysisofRetroviralIntegraseStructureandFunction[J].Adv.VirusRes.199952:411_426。權利要求1.一種攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗，該疫苗具有在施用於動物時能同時產生體液和細胞免疫反應的藥物用途，該假病毒外膜包含病原微生物的中和抗原，同時攜帶具有分子佐劑效應並能編碼抗原的雙鏈RNA。2.如權利要求I所述的假病毒顆粒疫苗，其核心特點在於採用具有分子佐劑效應並能編碼抗原的雙鏈RNA取代螢光報告基因，利用假病毒的基因攜帶能力將其導入宿主細胞並在宿主細胞表達，從而誘導產生抗原特異性的細胞免疫反應。3.如權利要求I所述的假病毒顆粒疫苗，其特徵在於，所述包裝質粒選自己經改造為具整合缺陷特性的pCMVAR8.2D64E;真核表達載體和自滅活的慢病毒轉導質粒pCS。4.如權利3所述的pCMVAR8.2D64E質粒，為包裝質粒，為在pCMVAR8.2質粒基礎上將HIV整合酶的64位胺基酸D突變為E，使該質粒不具有整合酶活性。5.如權利2所述的表達載體，為包含病原微生物中和抗原基因的真核表達質粒。6.如權利2所述的pCS載體，為包含具有分子佐劑效應並能編碼抗原的雙鏈RNA的自滅活載體質粒。7.如權利要求1-3中任一項所述的假病毒顆粒疫苗，其特徵在於，該系統包括使用含有病原微生物的中和抗原基因的真核表達質粒和能編碼抗原的雙鏈RNA的轉導質粒以及包裝質粒共轉染宿主細胞，培育該宿主細胞，和從培養基上清中收集假病毒顆粒。8.如權利要求1-7所述病原微生物，包括C型肝炎病毒，B型肝炎病毒，流感病毒，呼吸道合胞病毒，黃熱病毒，登革熱病毒，人類免疫缺陷病毒等。9.假病毒顆粒以及可接受的生理載體和/或佐劑用於製備針對微生物感染的疫苗的用途，所述假病毒顆粒包含病原微生物的表面中和抗原，並含有以下異源核酸能編碼抗原的雙鏈RNA，所述疫苗可一次或多次對有此需要的動物施用。10.權利要求9的用途，其中所述病原微生物在此以C型肝炎病毒為具體實例，其中所述表面中和抗原為El和E2蛋白，異源核酸編碼C型肝炎病毒NS3蛋白、其變體或其片段，並帶有可接受的生理載體和/或佐劑。11.權利要求9或10的用途，其中所述假病毒顆粒通過腹膜內途徑、靜脈內途徑、肌內途徑、經口途徑、黏膜途徑、舌下途徑、皮下途徑、鼻內途徑或皮內途徑施用。12.權利要求11的用途，其中所述假病毒顆粒通過肌內途徑施用，並且其中所述有此需要的動物為人，大猩猩，嚙齒類動物。13.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有權利要求1-9所述的假病毒顆粒和藥學上可接受的載體。14.如權利要求I所述的假病毒顆粒的用途，其特徵在於，用於製備治療和預防以下疾病的藥物腫瘤、病毒性疾病。專利摘要發明名稱攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗。所屬
技術領域：
：1.生物技術2.基因工程疫苗。本發明涉及一種攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗，該疫苗通過採用整合缺陷的pCMVΔR8.2D64E包裝質粒、pCS轉導載體和中和抗原表達載體共同轉染宿主細胞後，即包裝獲得顆粒表面呈現中和抗原而核心攜帶具有佐劑效應的雙鏈RNA靶抗原基因的假病毒顆粒疫苗。本疫苗為顆粒疫苗，易於收穫，抗原性強，並且應用安全，在多種病原，尤其是突發病毒感染性疾病的防治中具有良好的應用前景。文檔編號A61P35/00GKCN102961757SQ201210431175公開日2013年3月13日申請日期2012年11月2日發明者譚文杰,鄧瑤,管潔,文波申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan