一種含有木香油的乳劑及製備方法和用途的製作方法

2023-06-27 14:09:21 2

專利名稱：一種含有木香油的乳劑及製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有木香油的乳劑及其該乳劑的製備方法和用途。
背景技術：
木香為菊科多年生草本木香Aucklandia lappa Decne.的乾燥根，主產於雲南，又稱雲木香，始載於《神農本草經》，2000年版《中國藥典》(一部)收載。
木香中的成分主要有揮髮油、甾醇類、生物鹼、有機酸。近年來的藥理、藥效學研究發現，木香的主要有效成分是以木香烯內脂(Costunolide)和脫氫木香內脂(Dehydrocostuslactone)為主的多種倍半萜類化合物的混合物，在抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抑制血管收縮和免疫調節等方面都有明顯的藥理功效。
Chen等發現木香烯內脂和脫氫木香內脂兩種化合物對人體肝癌細胞Hep3B、HepA2的B肝表面抗原HBsAg及B肝e抗原HBeAg的基因表達均顯示強烈的抑制活性，但對細胞存活的影響甚小。這種抑制作用主要發生在mRNA水平，呈劑量效應關係，IC50分別為1.0μM和2.0μM。這一結果表明，木香烯內脂和脫氫木香內脂有可能被開發成抗B肝病毒的特效藥物。Chen H.C.，Antiviral Res.，1995，2799-109。
Lee等研究發現，對於LPS活化的鼠巨噬細胞RAW 264.7和人體單核白細胞，脫氫木香內脂能抑制NO的生成，還能降低LPS活化體系的TNF-α水平，這種活性在體外和體內都很顯著。該研究小組進一步研究了其作用機制，認為此化合物可使NF-κB失活，進而抑制i-NOS(可誘導的NO合成酶)的基因表達，最終導致對NO生成的抑制。因此，對於伴隨有NO和TNF-α過度生成的內毒素疾病的治療，該化合物可能是一種很好的備選物質Lee H.J.，Planta Medica，1999，65104-108；Jin M.，Arch.Pharm.Res.，2000，3(1)54-58。針對LPS活化的鼠巨噬細胞RAW 264.7，Kang等研究表明了木香烯內脂的抗炎活性。結果表明，該化合物可阻斷MAPK族酶(促細胞分裂劑活化的蛋白質激酶)的活化和DNA與AP-1的結合，從而抑制IL-1β蛋白質和mRNA的表達Kang J.S.，Biochem.Biophy.Res.Commun.，2004，313171-177。
Lee等人首次對木香烯內脂的抗腫瘤作用機制進行了探討。其實驗結果顯示，木香烯內脂通過誘導ROS(活性O)作為遞質的線粒體通透轉移及細胞色素C釋放而強烈誘導癌細胞凋亡。Lee M.G.，Biol.Pharm.Bull.，2001，24(3)303-306。
目前，在市場上銷售的主要是含有木香的複方製劑，均以口服方式給藥，例如木香順氣丸、木香檳榔丸、木香理氣丸、六味木香膠囊等，未見有以木香的有效成分為主要活性物質的藥品。
由於木香油為疏水性，因此製備注射液需要大量的有機溶媒或是使用大量有毒副作用的增溶劑，如使用聚氧乙烯蓖麻油類(Cremophor-EL)等表面活性劑，該類表面活性劑具有致敏性，大量使用後過敏反應的發生率較高，見[魏曉慧，等Chinese Jounal ofpharmaceuticals 2001，32(4)188-192]。
綜上，我們可以看出木香烯內脂和脫氫木香內脂是木香油中多種生物活性的有效成分，本發明人經過大量的實驗研究，開發出一種富含木香烯內酯和脫氫木香烯內酯的可供注射用的木香油乳劑，該乳劑的藥理作用強於木香烯內酯、脫氫木香內酯單體。

發明內容
本發明提供了一種含有木香油的乳劑，其特徵在於由木香油、油、表面活性劑、調等滲劑和水組成，其中木香油∶油∶表面活性劑∶調等滲劑的重量比為0.1-10∶0-50∶1-10∶1-10。
乳劑中油可以是植物油、動物油、精油、礦物油、合成油中的一種或幾種，優選為富含甘油三酯的豆油；表面活性劑可以是兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑中的一種或其組合，優選為大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂或聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段聚合物(泊洛沙姆)中的一種或幾種；調等滲劑是甘油、木糖醇、葡萄糖、山梨醇、果糖等中的任一種；優選為甘油；其中還可以含有穩定劑，穩定劑可以是膽固醇、長鏈醇(C14-22)、油酸、亞油酸或其衍生物，其用量是木香油的0-200倍；每100ml木香油注射乳劑中還可以加入1-1000mg的抗氧劑，抗氧劑可以是亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉等鈉鹽，或維生素A、維生素C或維生素E等。
本發明提供了木香油注射乳劑的一種製備方法為將木香油和表面活性劑加入到油中，還可以加入穩定劑，在加熱條件下(30-90℃)，混合至澄明，再將溶於水的表面活性劑和調等滲劑分散到水中，在高速攪拌下將含有木香油的油溶液加到水相中形成粗乳劑，再通過超聲粉碎機、高壓乳勻機進一步乳化，得放置穩定、粒度均勻、無毒的乳劑。
本發明提供了木香油注射乳劑的另一種製備方法為將木香油加入到油中，還可以加入穩定劑，在加熱條件下(30-90℃)，混合至澄明，再將表面活性劑和調等滲劑高度分散到水中，在高速攪拌下將含有木香油的油溶液加到水相中形成粗乳劑，再通過超聲粉碎機、高壓乳勻機進一步乳化，得放置穩定、粒度均勻、無毒的乳劑。
本發明提供的木香油其中含有50-100％(不包含100％)的木香烯內脂和脫氫木香內脂，優選含有80-100％(不包含100％)，更優選為含有90-100％(不包含100％)，其中木香烯內脂和脫氫木香內脂之間的比例為1∶(0.1-10)，更優選比例為1∶1.5-3。
本發明提供的木香油可以通過常規的溶劑提取方法獲得，也可採用CO2超臨界萃取法，但優選使用本發明提取方法獲得，其中本發明提取方法為取乾燥的木香粗粉60-100℃下用60-95％乙醇提取2-4次，用醇量為5倍，每次提取的時間為1-3小時，合併濾液，濾液減壓濃縮至密度為1.00-1.30，加5倍體積的水稀釋後用石油醚或乙酸乙酯萃取3次，合併有機溶劑層，減壓濃縮回收溶劑，浸膏上矽膠柱，上樣量(相當於生藥量)與矽膠用量的比例為1∶1.5-4(w/w)，先用石油醚洗2-4個柱體積，繼續用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)洗脫3-5個柱體積，收集洗脫液於40℃減壓回收溶劑，乾燥即得。
本發明提供了木香油乳劑在製備治療或預防由多種原因引起的內毒素血症的藥物中的應用，具體地在製備治療或預防嚴重創傷、燒燙傷、失血或嚴重感染的藥物中的應用。
本發明提供了木香油乳劑與抗生素聯合應用，在製備治療或預防細菌感染性疾病的藥物中的應用。
本發明提供了木香油乳劑在製備治療或預防伴有LPS和TNF-α過度生成的疾病的藥物中的應用。
本發明提供了木香油乳劑在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
本發明提供的木香油乳劑，活性成分的含量為0.1mg/ml～200mg/ml，可以靜脈注射用藥也可以口服用藥。
本發明所提供的木香油乳劑，活性成分含量高，滿足了臨床藥效所需的高濃度，可以注射給藥，拓寬了臨床使用範圍；不含有有機溶媒及有毒副作用的增溶劑，因此無過敏性，降低了毒副作用和刺激性，並提高了藥物的穩定性；該乳劑還可以延長藥物在體內的作用時間，使藥效具有持續性，並提高了血液中的藥物濃度，增加藥物的生物利用度，從而有利於藥物治療效果的提高。


圖1木香油和兩個單體對內毒素休克兔微血流的作用圖2木香油和兩個單體對內毒素休克兔微血管管徑的作用圖3木香油和兩個單體對內毒素休克兔微循環網交點的作用圖4木香油和兩個單體對內毒素休克兔血清IL-1的作用圖5木香油和兩個單體對內毒素休克兔血清IL-6的作用圖6木香油和兩個單體對內毒素休克兔血清TNF-α的作用
具體實施例方式
製備例1製備木香油取乾燥的木香粗粉1000g，用60％乙醇室溫浸泡，回流提取三次(3×5000ml)，每次提取時間為2小時，合併濾液，濾液減壓濃縮至密度為1.20，加5倍體積的水稀釋後用乙酸乙酯萃取3次，合併酯層，減壓濃縮回收溶劑後上矽膠柱(200-300目，2000g)，先用石油醚洗3個柱體積，繼續用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)洗脫4個柱體積，收集洗脫液於40℃減壓回收溶劑即得木香油35g，含木香烯內酯32％，脫氫木香內酯49％(w/w)。
製備例2製備木香油取乾燥的木香粗粉500g，用95％乙醇醇室溫浸泡，回流提取三次(3×3000ml)，每次提取時間為2小時，合併濾液，濾液減壓濃縮至密度為1.20，加5倍體積的水稀釋後用石油醚萃取3次，合併醚層，減壓濃縮回收溶劑後上矽膠柱(200-300目，1000g)，先用石油醚洗3個柱體積，繼續用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)洗脫4個柱體積，收集洗脫液於40℃減壓回收溶劑即得木香油19g，含木香烯內酯38％，脫氫木香內酯57％(w/w)。
製備例3製備木香油乳劑取製備例2木香油1g、精製蛋黃磷脂1.2g，油酸0.04g加入到5.0g精製大豆油中，加熱(50-90℃)，混合至澄明，作為油相。將甘油2.25g分散至注射用水中，作為水相。在攪拌條件下，將上述油相滴加到水相中，製得粗乳劑，加注射用水至100ml。將所得到的粗乳劑在壓力為100Mpa的條件下，通過高壓乳勻機進一步乳化，調節pH值5.0-9.0，分裝後滅菌即得10mg/ml的乳劑。
製備例4製備木香油乳劑取製備例2木香油1.0g，精製蛋黃磷脂2.0g，油酸0.06g加入到10.0g精製大豆油中，加熱(50-90℃)，混合至澄明，作為油相。將泊洛沙姆1.2g、甘油2.25g分散至注射用水中，作為水相。在攪拌條件下，將上述油相滴加到水相中，製得粗乳劑，加注射用水至100ml。將所得到的粗乳劑在壓力為100Mpa的條件下，通過高壓乳勻機進一步乳化，調節pH值5.0-9.0，分裝後滅菌即得10mg/ml的乳劑。
製備例5製備木香油乳劑將製備例2所得木香油1.0g，精製蛋黃磷脂3.0g，油酸0.10g加入到10.0g精製大豆油中，加熱(50-90℃)，混合至澄明，作為油相。將甘油2.25g分散至注射用水中，作為水相。在攪拌條件下，將上述油相滴加到水相中，製得粗乳劑，加注射用水至100ml。將所得到的粗乳劑在壓力為100Mpa的條件下，通過高壓乳勻機進一步乳化，調節pH值5.0-9.0，分裝後滅菌即得10mg/ml的乳劑。
製備例6製備木香油乳劑將製備例2所得木香油1.0g，豆磷脂2.0g，油酸0.5g加入到10.0g精製大豆油中，加熱(50-90℃)，混合至澄明，作為油相。將1.2g泊洛沙姆、甘油2.25g分散至注射用水中，作為水相。在攪拌條件下，將上述油相滴加到水相中，製得粗乳劑，加注射用水至100ml。將所得到的粗乳劑在壓力為100Mpa的條件下，通過高壓乳勻機進一步乳化，調節pH值5.0-9.0，分裝後滅菌即得10mg/ml的乳劑。
製備例7製備木香油乳劑將製備例2所得木香油1.0g，油酸0.10g加入到10.0g精製大豆油中，加熱(50-90℃)，混合至澄明，作為油相。將精製蛋黃磷脂1.2g、甘油2.25g高度分散至注射用水中，作為水相。在攪拌條件下，將上述油相滴加到水相中，製得粗乳劑，加注射用水至100ml。將所得到的粗乳劑在壓力為100Mpa的條件下，通過高壓乳勻機進一步乳化，調節pH值5.0-9.0，分裝後滅菌即得10mg/ml的乳劑。
試驗例1木香油體外抑制內毒素誘導的人單核細胞腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-6(IL-6)產生的能力1.1材料受試樣品木香油乳劑，按製備例3方法製備。規格100ml/瓶，10mg/ml，臨用前用空白乳稀釋至所需濃度。
木香烯內酯、脫氫木香內酯取10g按製備例1方法製備的木香油進一步矽膠柱層析(200-300目，300g)，正己烷-丙酮(97∶3)洗脫，TLC監控兩個主斑點成分，合併相同斑點的洗脫液，正己烷-丙酮重結晶分別得兩個單體化合物，理化參數如下脫氫木香內酯無色針晶，mp 49℃，[α]20D-14.8°(c0.42，CHCl3)，EIMS m/z 230(m+，63％)，150(68)，105(42)，82(100)，53(56)，元素分析實測值C77.67％，H 7.97％；計算值C 78.23％，H7.88％，分子式C15H18O2，IR(KBr)vmax1770，1650，1420cm-1；1H NMR(400Hz，CHCl3)δ3.97(1H，dd，J＝9.3Hz，9.3Hz，H-6)，4.82(1H，s，H-14a)，4.90(1H，s，H-14b)，5.06(1H，brd，J＝2.0，H-15a)，5.26(1H，brd，J＝2.0Hz，H-15b)，5.50(1H，d，J＝3.4Hz，H-13a)，6.20(1H，d，J＝3.4Hz，H-13b)；13C NMR(125Hz，CHCl3)δ30.28(t，C-1)，36.24(t，C-2)，149.20(s，C-3)，52.01(d，C-4)，85.22(d，C-5)，47.60(d，C-6)，30.91(t，C-7)，32.57(t，C-8)，139.73(s，C-9)，45.11(d，C-10)，151.21(s，C-11)，170.24(s，C-12)，120.16(t，C-13)，109.59(t，C-14)，112.60(t，C-15)。木香烯內酯無色稜晶，mp 105-106℃，[α]20D+111。(c0.11，CHCl3)，EIMS m/z 232(m+，21％)，109(63)，91(62)，81(100)，53(82)，元素分析實測值C77.67％，H 7.97％；計算值C78.23％，H 7.88％，分子式C15H20O2，IR(KBr)vmax 1770，1670，1440cm-1；1H NMR(400Hz，CHCl3)δ1.42(3H，d，J＝0.5Hz，H-14)，1.69(3H，s，J＝1.5Hz，H-15)，4.56(1H，dd，J＝9.9Hz，8.7Hz，H-6)，4.73(1H，dp，J＝9.9Hz，1.0Hz，H-5)，4.84(1H，ddp，H-1)，5.52(1H，d，J＝3.2Hz，H-13a)，6.26(1H，d，J＝3.6Hz，H-13b)，13C NMR(125Hz，CHCl3)δ127.1(d，C-1)，26.2(t，C-2)，39.5(t，C-3)，141.5(s，C-4)，127.3(d，C-5)，82.0(d，C-6)，50.5(d，C-7)，28.1(t，C-8)，41.0(t，C-9)，137.0(s，C-10)，140.1(s，C-11)，170.5(s，C-12)，119.7(t，C-13)，16.1(q，C-14)，17.4(q，C-15).
大腸桿菌內毒素(LPS)seroype O111B4，Sigma產品，批號034K4105。
TNF-α試劑盒，Diaclone(法國)；IL-6試劑盒，Biosource(美國)；RPMI1640培養液，Gibco(美國)。
1.2方法與結果採用RPMI1640培養人單核細胞株(THP-1)，實驗前一天調整細胞濃度為2×105/ml，接種於96孔培養板，分別加入倍比稀釋的木香油或其兩個單體，最高濃度為2μg/ml，共設7個濃度，然後再分別加入LPS 0111B4，使其終濃度為1ng/ml；37℃，5％CO2條件下培養24小時，取上清測定TNF-α和IL-6的濃度。
結果顯示，本發明的木香油對內毒素誘導的人單核細胞TNF-α和IL-6的分泌具有不同程度的抑制作用，相同指標揮髮油的IC50均小於其單一成分的IC50，說明揮髮油的活性高於兩種單體，兩種單體存在協同作用。(表1)表1木香油及其單體對內毒素誘導的人單核細胞TNF-α和IL-6分泌的抑制作用(IC50，μg/ml)

試驗例2木香油對內毒素所致小鼠死亡的保護作用2.1材料受試樣品木香油乳劑(MX)，按製備例3方法製備。規格100ml/瓶，10mg/ml，臨用前用空白乳稀釋至所需濃度。
木香烯內脂(CL)和脫氫木香內脂(DHCL)同試驗例1。
大腸桿菌內毒素(LPS)seroype O111B4，Sigma產品，批號034K4105，臨用前以生理鹽水配成2mg/ml溶液。
陽性對照藥地塞米松(DT)磷酸鈉注射液，濟南利民製藥有限責任公司產品，規格1ml∶5mg，批號0402308，臨用前以生理鹽水配成所需濃度。
試驗動物清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-21g，山東綠葉製藥有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。
2.2實驗方法與結果動物隨機分為模型對照組(iv LPS 20mg/kg)，溶媒對照組(iv LPS 20mg/kg+空白乳0.1ml/10g)，MX小劑量組(iv LPS 20mg/kg+MX 10mg/kg)，MX中劑量組(iv LPS 20mg/kg+MX 30mg/kg)，MX大劑量組(iv LPS 20mg/kg+MX 100mg/kg)，CL對照組(iv LPS 20mg/kg+CL 100mg/kg)，DHCL(iv LPS 20mg/kg+DHCL 100mg/kg)對照組，DT對照組(iv LPS 20mg/kg+DT 5mg/kg)，每組24隻。禁食12小時後，各組動物分別尾靜脈注射給與相應藥物，iv LPS後立即iv MX，給藥體積分別為0.1ml/10g體重。觀察7內各組存活動物數，計算生存率。數據應用SPSS統計軟體進行χ2檢驗。
結果顯示，本發明的木香油能夠提高各組動物的生存率，對內毒素所致小鼠死亡有明顯的保護作用，同時揮髮油的保護作用要好於兩個單體。(表2)表2木香油對內毒素所致小鼠死亡的保護作用

與LPS組比，*P＜0.05。
試驗例3木香油對家兔內毒素休克的保護作用3.1材料受試樣品木香油乳針劑(MX)，按製備例3製備。規格100ml/瓶，10mg/ml，臨用前用空白乳稀釋至所需濃度。
木香烯內脂(CL)和脫氫木香內脂(DHCL)同試驗例1。
大腸桿菌內毒素(LPS)serotype O111B4，Sigma產品，批號034K4105，臨用前以生理鹽水配成2mg/ml溶液。
陽性對照藥地塞米松(DT)磷酸鈉注射液，濟南利民製藥有限責任公司產品，規格1ml∶5mg，批號0402308，臨用前以生理鹽水配成所需濃度。
試驗動物普通級大白兔，雌雄不限，體重1.5-1.6kg，山東綠葉製藥公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。RM6240C型多道生理信號採集處理系統，成都儀器廠製造。
3.2實驗方法與結果動物隨機分為模型對照組(iv LPS 2mg/kg)，溶媒對照組(iv LPS 2mg/kg+空白乳2ml/kg)，MX小劑量組(iv LPS 2mg/kg+MX 5mg/kg)，MX中劑量組(iv LPS 2mg/kg+MX 10mg/kg)，MX大劑量組(iv LPS 2mg/kg+MX 20mg/kg)，CL對照組(iv LPS 2mg/kg+CL 20mg/kg)，DHCL對照組(iv LPS 2mg/kg+DHCL 20mg/kg)，DT對照組(iv LPS 2mg/kg+DT 1mg/kg)，每組6隻。禁食12小時後，戊巴比妥鈉麻醉(30mg/kg，iv)，右頸總動脈插管測動脈血壓。各組動物分別靜脈注射給與相應藥物，緩慢給與LPS(iv)，約10min注射完畢，立即給與相應溶媒或藥物(iv)。分別於LPS攻擊前(0h)和攻擊後1、2、4、6h取靜脈血製備血清用於細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的測定，LPS攻擊前(0h)和攻擊後0.5、1、2、4、6小時並於觀察眼球結膜微循環，6小時處死動物並取肺、心、肝、腎組織作常規病理檢查。所有數據應用SPSS統計軟體進行方差分析。
3.2.1木香油對家兔內毒素休克時血壓的影響結果顯示，本發明的木香油對內毒素休克時家兔血壓和脈壓差的降低有改善作用，呈現劑量依賴性，20mg/kg劑量下，4h後家兔血壓基本恢復至正常水平，與相應時間點LPS組比有顯著差異。LPS組脈壓差4h後顯著降低，而本發明的木香油在10和20mg/kg劑量下，脈壓差保持穩定，實驗過程中沒有明顯改變。兩個單體對內毒素休克時家兔血壓和脈壓差的降低也有一定的改善作用，但較揮髮油弱，在20mg/kg劑量時的作用僅與揮髮油10mg/kg劑量作用相當。另外在實驗過程中，LPS組和溶媒對照組分別2隻、1隻動物死亡，而本發明的木香油3個劑量組均為發生死亡，說明其對內毒素休克致死具有一定的保護作用。(表3、4)表3木香油對內毒素休克家兔平均動脈血壓(mABP)的影響(x±s，n＝6)


與相應時間點LPS組比，*P＜0.05，**P＜0.01a注釋由於LPS組和空白乳對照組在實驗過程中有個別動物死亡，LPS組和溶媒對照組4h動物數為5，LPS組6h動物數為4表4木香油對內毒素休克家兔脈壓差(PP)的影響(x±s，n＝6)

與LPS組比，*P＜0.05，**P＜0.01a注釋由於LPS組和空白乳對照組在實驗過程中有個別動物死亡，LPS組和溶媒對照組4h動物數為5，LPS組6h動物數為43.2.2木香油對家兔內毒素休克時微循環的影響結果顯示，LPS組在攻擊後0.5h左右眼球結膜微血管迅速收縮，毛細血管數減少，血流停止。之後微血管略微擴張，管壁不光滑、粗細不勻，毛細血管略有增加，血流瘀滯，呈泥沙狀。溶媒對照組與LPS組變化一致。本發明的木香油5mg/kg劑量下對微循環有一定的改善作用，使血流增快，微血管管徑和網交點亦有恢復，10、20mg/kg劑量下對微循環有明顯的改善作用，20mg/kg劑量能完全對抗2mg/kgLPS引起的微循環障礙。兩個單體對內毒素休克家兔的微循環也有一定的改善作用，但作用比揮髮油弱，在20mg/kg劑量下還不能完全對抗2mg/kgLPS引起的微循環障礙，作用強度僅與揮髮油10mg/kg劑量相當，見圖1、2、3。
3.2.3木香油對家兔內毒素休克時血清細胞因子的影響內毒素休克時體內產生過多的炎症細胞因子是造成組織損傷的主要原因之一，其中最主要的是TNF-α、IL-6和IL-1。LPS攻擊家兔後，TNF-α一過性升高，2h達峰值，隨後迅速降低，6h降低至正常水平，而IL-6和IL-1從2h起持續升高。本發明的木香油能顯著抑制LPS攻擊所致TNF-α、IL-6和IL-1的升高，抑制作用呈現劑量依賴性。兩個單體對內毒素休克家兔血清TNF-α、IL-6和IL-1的升高也有較好的抑制作用，但比相同劑量下揮髮油的作用弱，見圖4、5、6。
3.2.4肺、腎、心、肝等器官病理改變的影響病理組織切片顯示，內毒素性休克時肺泡及腎小管中可見明顯的出血性改變，小部分心肌細胞變性，部分肝細胞壞死，溶媒對照組的病理改變與LPS組相似。用本發明的木香油治療後，可使肺、腎、心、肝等組織無明顯出血、壞死等病理改變，基本維持正常組織結構。
3.3結論本發明的木香油對內毒素休克有較好的治療作用，能夠對抗內毒素休克時血壓和脈壓差的下降，改善微循環，改善肺、腎、心、肝等組織病理損傷，其保護作用可能是通過中和內毒素和抑制內毒素引起的炎症因子(IL-1、IL-6和TNF-α)分泌而發揮的。木香烯內脂和脫氫木香內脂單體對內毒素休克也有一定的治療作用，但比相同劑量下揮髮油的作用弱。
試驗例4木香油體內殺菌活性及與抗生素的協同殺菌作用4.1材料受試樣品木香油乳針劑(MX)，按製備例3製備。規格100ml/瓶，10mg/ml，臨用前用空白乳稀釋至所需濃度。
木香烯內脂(CL)和脫氫木香內脂(DHCL)同試驗例1。
大腸桿菌J5株，由青島醫學院提供。
亞胺培南(imipenem，IMP)，美國默克公司默沙東藥廠。
試驗動物清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-21g，山東綠葉製藥有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。
4.2實驗方法與結果動物隨機分為生理鹽水對照組，MX治療組(30mg/kg)，CL治療組(30mg/kg)，DHCL治療組(30mg/kg)，IMP治療組(1mg/鼠)，MX與IMP協同治療組(MX 30mg/kg+IMP 1mg/只)，CL與IMP協同治療組(CL 30mg/kg+IMP 1mg/只)，DHCL與IMP協同治療組(DHCL30mg/kg+IMP 1mg/只)，每組20隻。選用E Coli J5株，實驗前，將細菌置普通培養基內37℃培養過夜，3000g離心15min收集細菌，用無菌生理鹽水洗滌一次，懸浮於無菌生理鹽水備用。小鼠禁食12小時後，各組動物分別尾靜脈注入E Coli J5 2×107CFU/只(0.1ml)，之後立即注入相應藥物。觀察72h生存率。
結果顯示，本發明的木香油具有一定的抗菌作用，能提高E Coli J5感染小鼠的生存率，其與IMP聯合應用時有協同作用，進一步提高感染小鼠的生存率。在相同劑量下，兩個單體的抗菌活性與揮髮油相比稍弱，感染小鼠的生存率略低。兩個單體與抗生素亞胺培南也表現出了一定的協同作用，感染小鼠的生存率進一步提高，但其與協同作用不如揮髮油。許多研究表明抗生素是把「雙刃劍」，在殺滅細菌的同時又誘導G-桿菌釋放大量的LPS，本發明的木香油可以中和LPS並抑制LPS誘導的炎症因子的產生，從而提高感染動物的生存率。(表5)表5木香油和兩個單體的體內殺菌作用

試驗例5.木香油對體外培養腫瘤細胞增殖的抑制作用[]木香油按製備例1製備木香烯內脂(Costunolide)和脫氫木香內脂(Dehydrocostus lactone)同前。
藥物先以DMSO溶解成100mg/ml。臨用前以完全培養液配成相應濃度。RPMI1640培養基GIBCO公司生產。新生牛血清(超級)，杭州四季青生物工程材料有限公司，生產批號000523。胰蛋白酶，Sigma公司生產。MTT，Sigma公司。注射用鏈黴素，山東瑞陽製藥有限公司，1g(100萬單位)/支，批號200105101。注射用青黴素鈉，山東魯抗醫藥股份有限公司，80萬單位/支，批號L020318。其它常用化學試劑為國產分析純。
細胞株人肝癌細胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌細胞株HO8910、人前列腺癌胞PC-3M、人肺腺癌細胞株A549、人結腸癌細胞株HCT-8、人食管癌細胞株CaEs-17、人腦膠質瘤細胞株U251、人胃癌細胞株BGC-823、人胃腺癌細胞株SGC-7901、人早幼粒白血病細胞株HL60，均購自中國醫學科學院藥物研究所藥理室。
儀器CO2培養箱，超淨工作檯，酶標儀，倒置顯微鏡，細胞培養瓶(Costar，USA)，96孔細胞培養板(Costar，USA)。
軟體Microsoft Excel7.0統計分析軟體；Microcal Origin 6.0數據處理軟體。
實驗方法RPMI1640培養基一袋加水一升，補加2克碳酸氫鈉，10萬單位青黴素和100mg鏈黴素，調節pH值至7.4，用0.22um除菌濾膜過濾除菌。90ml培養基加滅活新生牛血清10ml即為完全培養液。胰蛋白酶用D-hanks緩衝液溶解後過濾除菌。
所有細胞均培養於含5ml完全培養液細胞培養瓶中，37℃、5％CO2、飽合溼度下。貼壁細胞以0.25％胰蛋白酶消化後傳代，懸浮細胞1000rpm離心10min後棄原培養液加新鮮培養液傳代。
貼壁培養細胞胰蛋白酶消化後，懸浮細胞離心後，加完全培養液懸浮細胞，臺盼藍染色計數活細胞數目，用完全培養液調整細胞數目至1×105個細胞/毫升。將細胞加入到96孔培養板，每孔100μl。加完細胞的培養板於CO2培養箱中培養12小時後倒掉原培養液，於96孔板中加入含A、B、C藥物的完全培養液，藥物濃度最高為20μg/ml，按0.5倍倍比稀釋，共設七個濃度梯度，另設不含藥組為對照組，每個處理設四個平行孔。振蕩混勻後放入培養箱中繼續培養48h。培養結束後，取出培養板，倒掉原培養液，加入100μl含0.5mg/ml MTT的RPMI1640培養液，繼續在培養箱中放置4h，取出培養板，小心吸去培養板孔中上清，加入150μl DMSO，振蕩使藍紫色甲臢結晶充分溶解。於Bio-TEK Synergy HT酶標儀上測定每孔光吸收，測定波長570nm，參考波長630nm。根據各孔光吸收值計算藥物對細胞增殖的抑制率。

根據藥物濃度對數和對應的抑制率，利用Micro Origin軟體作線性回歸，根據直線方程求出藥物對細胞的半抑制濃度(IC50)。實驗結果見表6。
表6木香油及其單體對體外培養的腫瘤細胞增殖的抑制作用(IC50，μg/ml)

結果表明，木香油和兩個單體均可明顯抑制多種人源腫瘤細胞株的體外增殖，其半抑制濃度IC50均小10μg/ml，但相同劑量的揮髮油IC50均小於其單一成分的IC50。表明木香油中各成分間有一定的協同作用。
試驗例6.木香乳劑抑制小鼠體內移植瘤生長的抑制作用木香油靜脈乳劑按製備例方法製備。環磷醯胺上海華聯製藥有限公司(批號000205)和上海第十二製藥廠(批號011015)。
動物及瘤株昆明種小白鼠，體重18-22g，雄性，由山東省天然藥物工程技術研究中心動物中心提供。C57BL/6純系小鼠，體重18-22g，雄性，購自中國醫學科學院實驗動物研究所，許可證號。小鼠S180肉瘤、H22肝癌、Lewis肺癌、U14宮頸癌均由中國醫學科學院藥物研究所藥理室引進。
實驗方法S180、H22和U14腫瘤均於昆明種小鼠腹腔內傳代，一般傳代後7天長出腹水。無菌注射器取出腹水後用注射用生理鹽水稀釋3倍後，接種於昆明種小鼠腋下皮下，0.2ml/只。Lewis肺癌於C57BL/6小鼠腋下傳代，接瘤後10天左右，取生長狀態良好瘤組織，加入5倍量生理鹽水後研磨成勻漿，過100目篩得瘤細胞懸液，接種於C57BL/6小鼠腋下，0.2ml/只。接瘤後第二天按表2所示組別和劑量分組給藥。連續給藥10天，末次給藥後24小時，脫頸椎處死小鼠，剝取瘤組織稱重，計算抑瘤率。實驗結果分別見表7。

表7木香油及其單一成分對小鼠體內移植瘤生長的抑制作用

注各組瘤重與模型組比較**，P＜0.01。與相同劑量單體1組瘤重比較#，P＜0.05。與相同劑量單體2組瘤重比較△，P＜0.05。
結果表明木香油在10～100mg/kg劑量範圍內可以明顯抑制小鼠體內移植瘤的生長。單體1和單體2在10～100mg/kg劑量範圍內可劑量依賴性地抑制小鼠移植性腫瘤的生長。相同劑量的木香油對腫瘤生長的抑制作用明顯大於其單一成分的抑制作用，表明木香烯內酯和脫氫木香烯內酯用於抑制腫瘤有一定的協同作用。
權利要求
1.一種含有木香油的乳劑，其特徵在於由木香油、油、表面活性劑、調等滲劑和水組成。
2.根據權利要求1所述的乳劑，其特徵在於木香油∶油∶表面活性劑∶調等滲劑的重量比為0.1-10∶0-50∶1-10∶1-10。
3.根據權利要求1所述的乳劑，其特徵在於木香油含有50-100％(不包含100％)的木香烯內脂和脫氫木香內脂。
4.根據權利要求3所述的乳劑，其特徵在於木香油含有80-100％(不包含100％)的木香烯內脂和脫氫木香內脂。
5.根據權利要求3或4所述的乳劑，其特徵在於木香烯內脂和脫氫木香內脂的重量比為1∶(0.1-10)。
6.根據權利要求5所述的乳劑，其特徵在於木香烯內脂和脫氫木香內脂的重量比為1∶1.5-3。
7.根據權利要求1所述的乳劑，其特徵在於木香油由以下方法得到取乾燥的木香粗粉60-100℃下用60-95％乙醇提取2-4次，用醇量為5倍，每次提取的時間為1-3小時，合併濾液，濾液減壓濃縮至密度為1.00-1.30，加5倍體積的水稀釋後用石油醚或乙酸乙酯萃取3次，合併有機溶劑層，減壓濃縮回收溶劑，浸膏上矽膠柱，上樣量(相當於生藥量)與矽膠用量的比例為1∶1.5-4(w/w)，先用石油醚洗2-4個柱體積，繼續用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)洗脫3-5個柱體積，收集洗脫液於40℃減壓回收溶劑，乾燥即得。
8.根據權利要求1所述的乳劑，其特徵在於油是植物油、動物油、精油、礦物油、合成油中的一種或幾種；表面活性劑是兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑；調等滲劑是甘油、木糖醇、葡萄糖、山梨醇、果糖等中的任一種。
9.根據權利要求8所述的乳劑，其特徵在於油是富含甘油三酯的豆油。
10.根據權利要求8所述的乳劑，其特徵在於表面活性劑是大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂或聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段聚合物(泊洛沙姆)中的一種或幾種。
11.根據權利要求8所述的乳劑，其特徵在於調等滲劑是甘油。
12.據權利要求1所述的乳劑，還含有穩定劑，穩定劑是膽固醇、長鏈醇(C14-22)、油酸、亞油酸或其衍生物，其用量是木香油的0-200倍。
13.根據權利要求1所述的乳劑，其特徵在於每100ml木香油注射乳劑中還可以加入1-1000mg的抗氧化劑。
14.根據權利要求1或12-13所述的乳劑製備方法為將木香油、表面活性劑加入到油中，還可以加入穩定劑，在加熱條件下(30-90℃)，混合至澄明，再將溶於水相的表面活性劑和調等滲劑分散到水中，在高速攪拌下將含有人參皂苷的油溶液加到水相中形成粗乳劑，再通過超聲粉碎機、高壓乳勻機進一步乳化，即得。
15.根據權利要求1或12-13所述的乳劑的另一種製備方法為將木香油加入到油中，還可以加入穩定劑，在加熱條件下(30-90℃)，混合至澄明，再將表面活性劑和調等滲劑高度分散到水中，在高速攪拌下將含有木香油的油溶液加到水相中形成粗乳劑，再通過超聲粉碎機、高壓乳勻機進一步乳化，即得。
16.權利要求1或12-13所述的乳劑，在製備治療或預防由多種原因引起的內毒素血症的藥物中的應用，具體地在製備治療或預防嚴重創傷、燒燙傷、失血或嚴重感染的藥物中的應用。
17.權利要求1或12-13所述的乳劑，在製備治療或預防細菌感染性疾病的藥物中的應用。
18.權利要求1或12-13所述的乳劑在製備治療或預防伴有LPS和TNF-α過度生成的疾病的藥物中的應用。
19.權利要求1或12-13所述的乳劑在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種含有木香油的乳劑及其製備方法。該乳劑中富含木香烯內酯和脫氫木香內酯，可以靜脈注射用藥也可以口服用藥。本發明還提供了其在製備治療或預防由多種原因引起的內毒素血症的藥物中的應用，還提供了其與抗生素聯合應用，在製備治療或預防細菌感染性疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61P35/00GK1768774SQ20051011318
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月16日 優先權日2004年10月20日
發明者許卉, 王振華, 劉生生, 楊鐵虹, 林東海 申請人:山東綠葉製藥有限公司