用於預防和治療病毒誘發腫瘤的組合物的製作方法

2023-06-28 03:35:26 1

專利名稱：用於預防和治療病毒誘發腫瘤的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預防和治療病毒誘發的腫瘤的預防劑和治療劑，特別是涉及到來源於麴黴屬的發酵提取物組合物，這些組合物可用作預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤如乳頭狀瘤病毒誘發的腫瘤的表面用藥物。
發明的
背景技術：
在哺乳動物中誘發腫瘤的病毒非常多。確實，現在已發現六十八種以上都能單獨誘發腫瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒。其中一些與良性腫瘤，比如尋常疣有關，而其它的則與感染哺乳動物的口腔以及生殖器黏膜發育不良和癌的病源物密切相關。另外一些能誘發腫瘤的病毒包括各種RNA病毒和皰疹病毒。
近來，還發現免疫系統功能低下如獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)的個體易受人類乳頭狀瘤病毒感染從而引起全身生長腫瘤，給患者造成精神和身體上的巨大痛苦。
治療病毒誘發的腫瘤常用的方法包括以下任何一種方法(1)外科手術(雷射或手術)；(2)利用有機酸如冰醋酸和/或水楊酸將腫瘤「燒」掉；(3)將一種由基瘤製成的抗腫瘤疫苗小範圍地注射到腫瘤中；(4)應用藥物治療[例如鬼臼樹脂；幹擾素和5-氟-2，4-(1H，3H)-嘧啶-酮；2-4-雙氧-5-氟嘧啶。也即是氟尿嘧啶或5-FU]來除去腫瘤。
然而目前一般使用的對去除病毒誘發的腫瘤有效的治療方法仍存在以下一種或多種缺陷(1)它們會損傷健康未感染組織；(2)會造成疤痕和外貌損傷；(3)可引起用此治療的哺乳動物不適；和(4)它們並不能損傷在周圍組織殘留的潛在病毒的DNA。而且，採用這些治療方法，患者會出現嚴重的全身副作用，腫瘤去除不完全和腫瘤的經常性復發。
人們也已知使用光療法可去除喉部乳頭狀腫瘤。這種光療法在抑制約50％的腫瘤生長的同時，也會造成至少六周的全身的皮膚光敏感性和其它微小的反應。而且，儘管這種技術取得了明顯成功，而潛伏病毒的DNA仍然是殘留在周圍組織。
美國紙件專利No.5,073,630公開了一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫刺激特性的聚合鎂酐和蛋白磷醯亞油酸銨。這種抗病毒劑是由一種麴黴屬選擇系的無細胞濾過物製備成的。但是那種化合物不溶於水且分子量大(316,000道爾頓)。而且，該化合物的重新獲得仍有困難。
由此可見仍需要能預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的組合物，該組合物不會損傷健康的未感染的組織，不會導致嚴重的全身副作用，也不會給用此治療的哺乳動物造成疤痕或外貌損傷和/或不適，且可損傷在周圍組織中殘留的潛伏病毒的DNA，這樣可減少腫瘤的去除不完全和經常性復發。進一步來說，還需要製備這種預防和治療的組合物的方法以及用這種組合物預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的使用方法。發明概述本發明的一個主要目的就是提供用於預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的組合物，該組合物既不會損傷健康的未受感染的組織，也不會對用此治療的哺乳動物造成嚴重的全身副作用、疤痕、外貌損傷或不適，而且還能損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，從而減少了腫瘤的去除不完全和腫瘤經常性復發。
本發明的另一個主要目的是提供用於預防和治療哺乳動物中病毒誘發腫瘤的組合物的簡便、易行的製備方法。
本發明還有一個主要目的是提供預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的方法，這些方法既不會損傷健康的未感染的組織，也不會對用該方法治療的哺乳動物造成嚴重的全身副作用，疤痕，外貌損傷或者不適，而且還能損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，這樣就減少了腫瘤的去除不完全和經常性復發。
根據本發明所述，本文公開了用於預防和治療哺乳動物中病毒誘發腫瘤的組合物。這些組合物既不會損傷健康的未受感染的組織，也不會對用該組合物治療的哺乳動物引起嚴重的系統副作用、疤痕形成、外貌損傷或不適。而且，這些組合物會損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，從而減少了腫瘤的去除不完全和經常性復發。
這些預防和治療的組合物優選表面使用。
本發明的預防和治療組合物優選發酵提取物/和或其衍生物。這些發酵提取物的更好優選是一種麴黴屬發酵提取物。優選的麴黴屬發酵提取物是一種黑麴黴屬發酵提取物。特別優選黑麴黴1.2 AN29和黑麴黴1.2 AN39發酵提取物。
本發明的組合物另外還優選含有藥劑上可接受的載體的發酵提取物和/或其衍生物。
本發明的優選組合物包括濃縮的發酵提取物。如需要的話，這些提取物可進行凍幹處理。
這些發酵提取物特別優選無細胞的全部粗提物。而且，這些無細胞的全部粗提物通過分子量截止為10000的膜超濾，這樣得到保留物為10000分子量的滲透物。
如需要，本發明的組合物可以是酶組合物，這些組合物可以是本發明所公開的發酵提取物的衍生物，和/或來源於這些發酵提取物。
本發明的一個特別之處在於，本發明所述的麴黴屬發酵提取物(和/或其衍生物)是用來製備預防和治療哺乳動物中病毒所誘發的腫瘤的組合物。更優選地，麴黴屬發酵提取物(和/或其衍生物)是用來製備哺乳動物所需的表面使用的預防和治療組合物。
另外根據本發明所描述的，本文公開了製備本發明預防和治療組合物的方法。這些方法包括在合適的培養基上培養麴黴屬菌種。這種培養基優選固體表面培養基。這些方法還包括用水從培養基中提取細胞外的化合物，這樣便得到液體的發酵提取物。這些方法還包括過濾所得到的液體發酵提取物，以去除其中的細胞生物質和孢子，這樣得到一種液體發酵提取物。最後，若需要，所公開的方法包括冷凍所得的液體發酵提取物直至使用為止。優選在約4℃時進行這種冷凍。
另一個特別優選之外是，發酵提取物可通過冷凍乾燥而濃縮。經這種冷凍乾燥而得的凍乾粉末(發酵提取物的)可在室溫下用乾燥劑儲存直至使用。
一個特別優選之處是，在保留物冷凍之前發酵提取物可通過分子量截止為10000的截斷膜進一步超濾。這種分子量為10000的超濾保留物的乾燥固體含量為7.6％(w/v)。如需要，可再將保留物經脫水而濃縮。
較為優選地，本發明所公開的方法是用來製備表面使用的預防和治療組合物。
根據本發明所述進一步可知，本文公開了預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的方法。這些方法的使用既不會損傷健康的未受感染的組織，也不會對用此方法治療的哺乳動物造成嚴重的全身副作用、疤痕、外貌損傷或不適。而且，這些方法的使用會損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，這樣便減少了腫瘤的去除不完全和經常性復發。這些方法包括製備含藥劑上可接受的載體的發酵提取物和/或其衍生物，以便得到預防和/或治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的組合物。這些方法還包括對需要的哺乳動物給予治療有效量的組合物。在預防時，可將這些藥物用在需要這種預防方法的哺乳動物的體表，或者，在治療時，將這些藥物直接用在需要治療的哺乳動物的病毒誘發的腫瘤部位。這些使用方法優選表面用藥。
較為優選地，製備本發明的預防和治療組合物包括製備一種發酵提取物，尤其是麴黴屬的發酵提取物。更為優選地，此方法包括提供一種黑麴黴的發酵提取物。最好的優選是，這種方法包括製備黑麴黴1.2 AN29或1.2 AN39的發酵提取物。
若需要，本方法還包括製備發酵提取物的衍生物。
如需要，本方法還包括通過分子量截止為10000的膜對無細胞全黑麴黴發酵提取物進行超濾和回收分子量為10000的超濾殘留物。如進一步需要，此方法還可包括蒸發濃縮殘留物。
如果需要，本方法還可包括冰凍乾燥發酵提取物，這樣提取物被濃縮而得到粉末，可將凍乾粉末在室溫下使用乾燥劑儲存。
本發明的一個特別之處在於，所公開的是用於預防和治療哺乳動物中EB病毒誘發的腫瘤的表面用防治組合物和其使用方法。
本發明的另一個特別之處是，文本公開了用於預防和治療哺乳動物中棉尾兔乳頭狀瘤病毒誘發的腫瘤的表面用防治組合物和其使用方法。
本發明還有一個特別之處是，本發明所公開的是用於預防和治療哺乳動物中乳頭狀瘤病毒誘發的腫瘤的表面用防治組合物及其使用方法。
一旦看了下面附有實施例的發明時，本發明這些和另外的目的和優點就顯而易見了。
優選的具體說明本發明包含用於防治哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的表面用防治組合物。這些組合物是從發酵提取物和/或其衍生物中製成的。然後可將這些發酵提取物和其衍生物與藥劑上可接受的載體相混合從而製成本發明的治療組合物。
「發酵提取物」一詞是指提取物的環境，特別是發酵環境，這種環境是已用一種適當微生物的培養物進行了接種，並且其中的微生物已經培養(成熟的)。
當「衍生物」和「來源於」用於指發酵提取物時，意思是指從發酵提取物中得到的(衍生或分離的)組合物或組分，如特殊的酶或酶的組合。順便說明一下，有一種衍生物是經濃縮或過濾的發酵提取物。「衍生物」和「源於」同樣可用於指與那些發酵提取物的組合物或組分是等同的，且已證明它們具有與發酵提取物相同的預防和治療作用組合物和混合物。順便說明一下，這一定義包括從發酵提取物中分離出的(如果需要，經純化的)發酵提取物組分本身(如其活性劑)。再順便說明一下，這種定義還包括模擬活性劑構建成(如，合成)的組合物或混合物，具有本發明的發酵提取物的預防和治療作用。
更為特別的，本文所公開的發酵提取物及其衍生物是用一種適當微生物的培養物接種的表面發酵的水提物(或這種水提物的衍生物)。
發酵提取物優選麴黴屬發酵提取物，更好的優選是黑麴黴發酵提取物。最佳的優選是黑麴黴1.2 AN29發酵提取物和黑麴黴1.2 AN39發酵提取物。
特別優選的是，發酵提取物為分子量10000的超濾殘留物[乾燥固體含量為7.6％(w/v)]。殘留物可經蒸發而濃縮。
特別是已發現接種有黑麴黴培養基的表面發酵的水提物對於預防和消除哺乳動物疣起作用。
藥劑上可接受的載體可以是本領域技術人員所熟知的任何載體。這種載體優選親水物質，以便能協助防治組合物穿入皮膚。這些載體包括以下，但並不局限於此，如水性薄荷醇溶液，水，丙二醇，羊毛脂，丁醇，無水醇，異丙醇，二甲基亞碸，乳酸乙醚和其混合物。這種載體的另一個例子是眾所周知的「VEHICLEN」，此組合物包括乙醇、異丙醇、純淨水、LAURETH-4(一種表面活性劑)和丙二醇。
用於製備本發明的防治組合物的發酵提取物(和/或其衍生物)和藥劑上可接受的載體的準確用量優選濃度約為1％(w/v)至15％(w/v)的凍幹發酵提取物(或其衍生物)。特別優選濃度約為8％的凍幹發酵提取物。
預防和治療的組合物可根據需要製備來用於被預防的哺乳動物的部位的表面，或需要治療的哺乳動物所患的腫瘤比如疣的部位的表面。這些成分包括液體組合物，如油膏、搽劑和酊劑的組合物。由於乳膏、肥皂和凝膠能使防治組合物與皮膚和/或腫瘤有充足的時間保持接觸，所以可作為特別優選。
雖然還不是非常明確，但一般認為本發明組合物的作用方式實際上並不一定是直接抗病毒或抗腫瘤。相反，可以認為本發明所公開的組合物的作用方式可能是刺激全身免疫系統的結果。細胞介導的應答可能對AN-1抗原很重要，這種抗原能誘發影響腫瘤生長的非特異性免疫應答。在這方面上，我們認為本發明的組合物可能是一種免疫增強劑。事實上，前面的研究已表明細胞介導的應答很可能對乳頭狀瘤病毒誘發的良性腫瘤和前期癌的消退起作用。
我們還認為發酵提取物的活性成分的分子量約在1000道爾頓至10000道爾頓至之間。而且發現發酵提取物的活性成分的分子量更特別接受10000道爾頓。
本發明的防治組合物對於預防和治療病毒誘發的腫瘤例如那些由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)、馬乳頭狀瘤病毒(EPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)引起的腫瘤是有效的。
製備本發明的防治組合物首先是製備適合的生長培養基。優選固體表面培養基。根據其中培養的微生物的不同，所使用的培養基也不同，這對於本領域的技術人員來說完全能夠確定。如果所培養的是一種麴黴屬，則優選的培養基包括7.9％(w/w)SOLKA FLOC BNB 100(James River Corp.，U.S.A.)；7.9％(w/w)燕麥外殼；7.9％(w/w)花生粉；15.8％(w/w)甜菜漿；0.39％(w/w)KH2P04；13ppm ZnSO4和60％(w/w)水。
然後將培養基滅菌、冷卻並在其上接種需要培養的特定的麴黴屬種孢子。接種和混合後，將培養基移至深約0.75英寸的多孔金屬盤中。然後將這些金屬盤放在30℃-32℃的高溼度的環境中孵育約72小時，這期間麴黴屬菌種得到了培養。再在水(水提物中)攪拌幾小時後回收(提取)到內含物，這樣便得到液體的發酵提取物。然後再將液體發酵提取物過濾(通過末端濾器)以去除提取物中的細胞生物質、孢子和其它不溶物。
如果需要，液體的濾過提取物便可照此使用，或者將其進一步處理，如進行濃縮，以便製備其適合的衍生物。
這種進一步處理的例子包括通過分子量截止為10000的膜的發酵提取物的超濾過程，以便獲得10000MW-UF的殘留物。這種殘留物可含有7.6％(w/w)的乾燥固體組合物。再處理的另一例子是通過蒸發而濃縮(如，2.5倍)。在這種情況下，發現不論是無細胞的發酵粗提物還是分子量為10000(或任意大小)的殘留物均可通過蒸發而被濃縮。
如果不需立即使用，這種液體濾過提取物(和/或其衍生物)最好在4℃冷凍，直至使用。
若需長期儲存，可將這種液體濾過提取物(或其衍生物)進行真空濃縮，然後澄清濾液，將濾液(或其衍生物)冰凍乾燥。由此得到的凍乾粉末可在室溫用乾燥劑儲存直至使用。
所得到的發酵提取物(或其衍生物)的凍乾粉末極易溶於水。當需要用時，可將凍乾粉末重新溶解在液體比如水中，和/或藥劑上可接受的載體中。
本發明的預防和治療組合可用於防治哺乳動物中病毒誘發的腫瘤。這些方法包括給需要治療的哺乳動物使用治療有效量的防治組合物，該組合物在藥劑上可接受的載體中含有麴黴屬發酵提取物(或其衍生物)。
「治療有效量」一詞意思是指對於防止或減緩新的或現存病毒誘發可疑的腫瘤生長的預防或治療的有效劑量。
防治組合物的準確用量是指薄薄地覆蓋在所需的哺乳動物(患病)的皮膚表面(如病毒誘發的腫瘤所在部位)的本發明表面用的防治組合物的必需用量。
防治組合物可以按本領域技術人員所熟知的任何適當的方式給藥。這些方式包括皮下或靜脈內注射。給藥優選表面給藥，例如，根據需要，輔以眼用滴管、多孔塗藥器(如紗布，藥籤或布，卷頂塗藥器)、刷子或任意其它的適當用具，將藥塗在皮膚或腫瘤(或其所需的患處)的表面。
如果需要，可在感染之前用防治組合物來防治初期感染。我們發現當感染後不久使用防治組合物，或用於現有的腫瘤時，防治組合物具有顯著抑制腫瘤的能力。還觀察到只要腫瘤存在，每天至少要用這種組合物一至兩次。但是，使用的具體次數可根據需要增多和/或減少，這對於本領域技術熟練人員來說是完全能確定的。應該注意防止皮膚對這些組合物反應的發展，但不管怎樣，我們發現任何這種反應最終均會消失，而對所試驗的物種沒有任何損害。
因此為了描述本發明的防治組合物和其製備方法以及它們的使用方法，現在給出下面的實施例，這些實施例僅僅是舉例說明，而不是也不應被視為對本發明的限制。
實施例1黑麴黴1.2 AN39發酵提取物的製備首先，製備適合的生長培養基，該培養基由7.9％(w/w)SOLKAFLOC BNB 100(James River Corp.，U.S.A.)；7.9％(w/w)燕麥殼；7.9％(w/w)花生粉；15.8％(w/w)甜菜漿；0.39％(w/w)KH2PO4；13ppm ZnSO4；和60％(w/w)水組成。
然後將培養基滅菌、冷卻並接種黑麴黴1.2 AN39孢子，該孢子按照布達佩斯條約1992年7月30日以登記號21126保藏在農業研究所培養物保藏中心(NRRL)1815 N.University St.，Peoria，Illinois(U.S.A.)。
經接種和混合後，將培養基移至深約0.75英寸的多孔金屬盤中。然後將這些盤放在30℃至32℃的高溼度(水分足)的環境中孵育約72小時，以製備所需的黑麴黴1.2 AN39培養物。再在水(水提物)中攪拌數小時收穫到培養物，隨後過濾(通過末端濾器)以去除細胞生物質、孢子和其它不溶物。
再將濾液真空濃縮，接著澄清濾液。所得的組合物為黑麴黴1.2AN39發酵提取物，稱之為「AN-1」。
然後將一部分液體濾過提取物冰凍乾燥製成AN-1發酵提取物粉末。這種發酵提取物的凍乾粉末可在室溫下使用乾燥劑儲存直至使用。
實施例2黑麴黴1.2 AN29發酵提取物的製備黑麴黴1.2 AN29發酵提取物按實施例1所述黑麴黴1.2 AN39發酵提取物的相同製備方法製備，不同之處是用黑麴黴1.2 AN29孢子接種冷卻了的滅菌培養基，這種黑麴黴1.2 AN29孢子按照布達佩斯條約的規定於1993年9月7日以登記號21139保藏在農業研究所培養物保藏中心(NRRL)1815 N.University St.，Peoria，Illinois(U.S.A.)。把這種組合物稱之為「AN-2」。
然後將一部分液體濾過提取物冰凍乾燥製成AN-1發酵提取物粉末。再將這種發酵提取物的凍乾粉末在室溫下用乾燥劑儲存直至使用。
實施例3黑麴黴發酵提取物的體外治療指數評價本發明酶組合物的體外抗EB病毒(EBV)和皰疹型病毒的功效是為了證實本發明的治療組合物在體內的潛在作用。
抗病毒劑的藥效的評斷標準是通過比較細胞毒性的半數有效量與抗病毒的半數有效量的比率。這種比率就是「體外治療指數」或「選擇性指數」。對於危急病症，抗病毒劑的選擇指數必須大於100才表明如(1)中所述的動物實驗中對病毒抑制的有效作用。
本文所述的評估是通過Raji細胞與通常稱為P3HR-1的EBV病毒細胞系的雙重感染來進行的。P3HR-1是一種標準的實驗室EBV菌株。雙重感染後，便可測定培養物中的早期抗原。1.人類包皮成纖維細胞的製備在包皮環切術後儘可能獲得新生兒的包皮，並在補加有(每mlDMEM)50μg萬古黴素、3μg二性黴素B、100單位青黴素和25μg慶大黴素的Dulbecco基本必需培養基(DMEM)(GIBCO BRL，LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，Maryland U.S.A.)中於37℃放置4小時。
然後取出培養基，將包皮切成小碎片，用Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)(GIBCO BRL)重複衝洗，這樣可去掉鈣和鎂，洗到不再看見紅細胞為止。
接著用0.25％(w/v)胰蛋白酶對組織進行胰蛋白酶作用，在CO2孵育器中持續攪拌15分鐘。在這15分鐘的後期，組織被沉在瓶底。再將含細胞的上清液經無菌乾酪布注入含DMEM和10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，USA)的第二個瓶中。每次過濾細胞後，用含少量DMEM的血清衝洗乾酪布。再將新鮮的胰蛋白酶加入上述的包皮碎片中，重複上述過程直到沒有細胞為止。
整個受胰蛋白酶作用的過程中，第二個瓶(含培養基和受胰蛋白酶作用的細胞)是放在冰中的。
然後將第二瓶中的含細胞的培養基以大約1000RPM(約100g)於4℃離心10分鐘(所需要的最小離心力是使細胞形成小球而不對細胞產生損傷)。去掉上清液，並將細胞再懸浮於約50ml的含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中。
之後細胞置於適當數量的25cm2的組織培養瓶中。將細胞保留在50μg/ml DMEM萬古黴素和3μg/ml DMEM二性黴素B中於37℃下約72小時，直至細胞傳代融合。然後對細胞進行如上所述的傳代培養，但使用大瓶和新鮮培養基。這一過程還需重複兩次直至得到四個傳代。2.EBV的篩選試驗A.病毒根據(12)所述過程，所使用的傳染性EBV原型是來源於P3HR-1細胞系(按登記號VR 603從美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland(U.S.A.)得到的)的上清液的病毒。這種細胞系產生非轉化病毒，該病毒在初期感染或B細胞雙重感染後可導致早期抗原(EA)的形成。B.細胞系Raji(按照登記號CCL86從美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland(U.S.A.)得到的)是含有60EBV基因組/細胞的伯基特淋巴瘤細胞系，曾用作篩選對EBV早期抗原(EA)表達的抗病毒活性的原始細胞。
所有的病毒細胞系(P3HR-1和Raji病毒細胞系)均保留在RPMI-1640培養基(GIBCO BRL)中，培養基中補加有10％(v/v)胎牛血清、2.05mN/ml L-穀氨醯胺培養基和25μg/ml慶大黴素培養基。每周兩次用新鮮培養基替代培養基體積的一半，並將細胞濃度調至(12)所述的3×105/ml。然後將細胞在37℃下含5％(v/v)CO2的溼潤(90％)環境中保留至使用。3.用單克隆抗體的免疫螢光試驗如(12)所述用EBV的P3HR-1菌株感染Raji細胞。於37℃被動吸收45分鐘後加入上述實施例1中所得的組合物，並用不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)衝洗細胞培養物。之後將培養物放在RPMI-1640培養基(上述的)於37℃孵育兩天，以產生病毒基因表達。48小時的孵育完成後，按(12)所述用血細胞計數器計算每個標本的細胞數，然後將其點在有弓形體病的玻片(BellcoGlass Co.，U.S.A.)孔中並風乾。
然後按(12)所述將針對擴散的早期抗原EA(D)(DuPont，U.S.A.)產生的單克隆抗體(由Dr.Gary Pearson，GeorgetownUniversity，U.S.A.無償提供)加入玻片孔中的Raji細胞中。再加入螢光素共軛山羊抗鼠IgG抗體(Fisher Scientific，U.S.A.)，按(12)所述的步驟，用螢光顯微鏡肉眼計算玻片孔中螢光陽性細胞的數目。然後計算並比較含EA(D)的培養物中細胞的總數，如(12)所述，EBV的早期抗原表達在不顯示螢光的Raji細胞中被抑制了。
4.體外細胞毒性AN-1的體外細胞毒性在上述得到的人類包皮成纖維細胞中測定，隨後把在(13)所述的條件和技術做如下改變實驗前24小時，將低傳代人類包皮成纖維細胞固定在有96孔、濃度為每孔2.5×104細胞的組織培養皿(8×12平底孔)(Becton Dickinson Labware，U.S.A.)中。細胞置於含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，U.S.A.)的0.1ml DMEM中。然後將細胞放在CO2孵育器中於37℃孵育24小時。再吸出培養基並將100μl含2％(v/v)胎牛血清的DMEM加入除第一排的八個孔之外的其它孔中。將上述實施例1所得到的凍幹發酵提取物(AN-1)溶解在含2％(v/v)胎牛血清的DMEM中直至濃度為100μg/ml。再將125微升AN-1分別加入第一排的每個孔中，並用Cetus液體處理器(Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.)將全部現存的孔移去25μl，用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM按1∶5連續稀釋AN-1，使孔中的AN-1濃度範圍為100μg/ml到0.03μg/ml，再將培養皿放在CO2孵育器中於37℃孵育7天。然後吸去含AN-1溶液的無細胞培養基，並在每孔中加入Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水中的0.01％(v/v)的中性紅200μl。將此置於CO2孵育器中於37℃孵育1小時。去掉染料，用Nunc平皿清洗器(Nunc，Inc.，U.S.A.)衝洗細胞。撤去Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水衝洗後，每孔中加入50％(v/v)EtOH/1％(v/v)冰醋酸(水中)200μl。通過在軌道混合器上轉動15分鐘使內含物混合。然後，用平皿讀數器(Beckman Instruments Inc.，U.S.A.)於550nm讀出每孔的光密度。
對每個實驗系統中經用100μg/ml AN-1處理的人類包皮成纖維細胞(通常為靜止細胞)的視覺檢驗顯示沒有毒性。
AN-1的細胞毒性也已在人類包皮成纖維細胞增殖實驗(迅速生長的人類包皮成纖維細胞)中測定。迅速生長的人類包皮成纖維細胞的細胞增殖實驗已經完成。實驗前24小時，將人類包皮成纖維細胞(上述所得的)以每孔含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中含有2.5×104個細胞的濃度種在有6個孔的組織培養皿中(有2×3平底孔)(Becton Dickinson Labware，U.S.A.)。在實驗的當天，按1∶5的增量在含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中連續稀釋，使每個孔中AN-1的濃度範圍在100μg/ml-0.03μg/ml。然後從細胞中吸去培養基，並在每個孔中加入2ml AN-1濃縮物。隨後將細胞置CO2孵育器中於37℃孵育72小時。去除溶液中含AN-1的無細胞培養基並用不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水衝洗細胞(單層細胞)。再經抽吸去除Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水。在每個孔中加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶並孵育直至細胞開始從平皿孔的底部分離。用力來回吸取細胞-培養基混合物以使細胞懸液分散，將0.2ml混合物加入9.8ml稀釋了的ISOTON III(Coulter Electronics Inc.，U.S.A.)中，用Coulter計數器(Coulter Electronics Inc.，U.S.A.)計算細胞數。對每個樣本的三個複製孔計數三次。
用這種比較嚴格的毒性實驗發現AN-1在100μg/ml時沒有毒性。AN-1在100μg/ml(IC50大於100μg)時對未轉染(無EBV)的Raji伯基特淋巴瘤細胞系也沒有毒。如(12)中85頁所述該方法是用於AN-1對未轉染(無EBV)Raji伯基特淋巴瘤細胞的毒性測定的。5.結果這些篩選結果如下所述，其中EC50(50％有效濃度)是抑制50％病毒的細胞病原性所需的濃度；IC50(50％抑制濃度)是抑制50％細胞增殖所需的濃度；和S.I.代表「選擇指數」。SI＝IC50/EC50。(1)。
當檢測AN-1對Raji細胞(～60EBV Copies/細胞)中EB病毒(EBV)的早期抗原(EA)表達的抗病毒活性時，所得的選擇指數(SI)大於137(IC50＞100μg/ml÷EC500.73μg/ml)，如下EBV(RAJI細胞)免疫螢光法-微克(MCG)/mlEC50＝0.73；IC50＞100；SI＞137由於RAJI細胞中AN-1的選擇指數大於100(＞137)，表明在哺乳動物試驗中對病毒的抑制有效。
無環鳥苷(對多種皰疹病毒具有抑制活性的一種抗病毒標準物)的EC50為4.9μg(ACV EC504.9)。因而，AN-1的粗樣本的藥效超過無環鳥苷的6.71倍。可以預測出，經純化後，AN-1組合物的特殊活性還會增加。
抗病毒劑AN-1的粗製品在體外100μg/ml時，對I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、人類巨細胞病毒或水痘帶狀皰疹病毒均無抑制作用。
實施例4黑麴黴發酵提取物用作表面治療劑使用NIH(國家健康研究所)的棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)的兔模型體系能在兔中找到與疾病相關的人類乳頭狀瘤病毒的體內研究的最佳動物模型體系。這種體系以前是用來檢驗測定病毒劑的。
CRPV是中西部棉尾兔天然特有的，它能誘發皮膚乳頭狀瘤，其中約25％進一步形成侵害性癌。將CRPV注射在家兔的皮膚上會不斷地形成疣。因此，CRPV兔模型體系可用於檢驗不同的抗病毒劑的阻止或減緩疣生長的功效。
在NIH的CRPV一兔模型體系中進行上述實施例1中所得到的無細胞凍幹發酵粗提物(AN-1)的治療作用的對比試驗。該試驗的第一步是比較動物腫瘤的存在和大小，這些試驗動物或者a)僅接受50％(v/v)甘油的局部治療(第1組)；或b)接受含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油的治療(第2組)；或c)開始九周根本不進行治療，感染了CRPV後再用含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油治療。這樣，將第2組(預防作用)和第3組(治療作用)與第1組和對照組進行比較，可以研究本發明的組合物的預防和治療作用。方法和技術1.病毒的製備從野兔的腫瘤中分離出CRPV並用(2)中所述的標準方法進行製備，得到不含細胞殘渣的10％(w/v)棉尾兔疣的勻漿。經不斷稀釋滴定病毒，並在家養雄性荷蘭兔身上劃痕，如(3)中所述，這樣約3-4周後形成疣。然後用等密度CsCl密度梯度將一部分該病毒純化，如(4)中所述產生純化病毒顆粒。
之後將切除的腫瘤放在液氮中冷凍，用研缽和研棒將其研碎，如(4)所述便製成10％(w/v)的懸浮液。按(2)所述再將病毒的上清液用於43g/100ml、32g/100ml和27g/100ml的速度分級梯度，並在18℃以70,000g(在SW27轉子中)離心2小時，這些在(2)中進行了描述。收集病毒帶，透析48小時，稀釋並用CsCl使密度達到1.34g/ml，這些也在(2)中進行了描述。再將病毒綁在SW50.1轉子中以100,000g於18℃下離心40小時，收集並透析，這些在(2)中作了進一步描述。2.實驗記錄按(2)所述用純化的CRPV病毒顆粒(上述所得的)對兩隻兔(C1和C2)進行免疫接種。
使三組中的每七隻兔均感染上上述所得到的CRPV。用50μl現有病毒的1∶4稀釋液(約32ID50單位)感染每隻兔背部的八個部位(左邊四處和右邊四處)。如(3)所述，用劃痕法進行這種感染。
一周後，開始表面治療。用100μl的50％(v/v)甘油去離子水每天兩次給第1組(對照組)的樣本進行治療。用100μl含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油去離子水每天兩次給第2組的樣本進行治療。第3組的樣本用100μl與治療第2組樣本相同的組合物每天治療兩次，但這種治療是在感染後的第九周初才開始的，此時大多數的感染灶都已長出了腫瘤。每組的治療均持續兩月。
通過用特殊方法接觸感染的腫瘤部位並用一種「橡皮澱帚」使這種接觸保持約5秒從而使治療引進.這樣來實現這些治療方法。3.細胞的DNA的分離從第2部分三個小組的各個樣本中取出腫瘤、切碎並用蛋白酶處理(消化)，這些在(5)中進行了描述。然後在冷卻的消化物中加入氯化鉀和乙醇，以分別沉澱其中的蛋白絡合物和所有細胞的核酸，這些也在(5)中進行了描述。用十二烷基硫酸鈉-蛋白酶消化，苯酚-氯仿提取和乙醇沉澱後，再用核糖核酸酶A處理去除RNA。4.放射性標記的CRPV DNA的製備從上述第3部分的分離的DNA中得到CRPV DNA，並根據(2)所述將其分子克隆到pBR322(Clontech Laboratories，U.S.A.)中。如(2)所述，在適用瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫適當的DNA帶後，用EcoRI處理，從質粒載體中去除克隆化的CRPV DNA。根據(6)所述再經切口平移用32p-dCTP對CRPV DNA進行放射性標記。通常獲得約3×108cpm/μg的比活。5.DNA分析如(5)所述在嚴格條件下進行DNA濾膜雜交。根據(5)所述從上述第三部分中由蛋白酶和洗滌劑、酚和氯仿分離的DNA中提取細胞的DNA，隨後用基因擴增(TM)(Perkin-Elmer，U.S.A.)和來源於CRPV E6開放讀框的寡聚體引物通過聚合酶鏈反應(PCR)進行分析。引物所用的序列為5′-GAACTGCCTGCCACGCTCGC-3′序列標識號15′-CGCCTGGCCCTAGGTCAAC-3′.序列標識號2循環35次後，雜交到放射性標記CRPV DNA探針上之後，擴增0.5μg細胞DNA可能會在初始樣本中測得少於1fg的CRPV DNA。見(3)。6.血清試驗從第二部分中的每個樣本中抽取外周血用於CRPV毒性蛋白的體液抗體中酶聯免疫吸附測定(ELISA)試驗。根據(7)中所述，將上述本實施例第1部分的純化病毒顆粒與弗氏完全和不完全佐劑結合以產生抗-CRPV血清。如(7)所述在標準的酶聯免疫吸附測定試驗中使用10ng純化的毒粒蛋白，發現這些血清具有7.7×104-4.7×105的效價。這些血清在酶聯免疫吸附測定試驗中是作為陽性對照[如(7)所述]以檢測試驗動物中的體液CRPV抗體。用1mg凍乾粉末(上述實施例1所得)作為抗原測定血清對黑麴黴發酵提取物(AN-1)的反應性。在兩組試驗中，對來源於感染前的和研究結束時的兔子的血清進行了分析。效價至少增加4倍的對比結果表明有顯著性意義。7.統計分析採用(8)所述的卡方試驗法檢驗有疣或無疣的單個樣本組與對照組對比的顯著性。用(9)、(10)和(11)中所述的FisherExact Test評定血清抗體效應的差異性。用(9)-(11)所述的方法使用Fisher Exact Test計算「P值」。這兒所使用的，P值是指概率指數。我們認為等於或小於0.05的概率指數(P)具有顯著性意義，表明這種結果隨機出現的機會少於5％。8.結果A.臨床觀察後面討論的臨床觀察的結果總結如下表1所示表1表面使用黑麴黴發酵提取物對CRPV所引起的疣的生長和去除作用的臨床觀察感染部位重量/腫瘤數

開始治療後八周，在第1組(未使用任何組合物)的動物中96％的腫瘤感染部位和沒有接受任何治療的第3組中動物的94％的中觀察到了腫瘤。相比之下，在第2組動物中僅有80％觀察到了腫瘤。第2組是用組合物進行預防處理的組，且是直至此時使用任何組合物的唯一的樣本。因而，可以發現，在CRPV感染的一周內開始延長表面用藥一段時間，八周後與對照組相比腫瘤數減少了17％。又過了九周後(沒有繼續治療)，與對照組相比發現樣本的腫瘤數減少了43％。
腫瘤的17％和43％減少證實了本發明的組合物的預防作用。
對於第3組的樣本(用組合物進行治療的組)，發現當對有現存腫瘤(CRPV感染後九周出現)的樣本表面反覆使用AN-1時，大約八周後，這些樣本比對照組樣本減少了24％的腫瘤(第3組樣本腫瘤感染部位的百分比為57％，P＞0.05)。這24％的腫瘤減少證實了本發明的組合物的治療功效。
總之，該試驗證實了本發明的組合物對防治病毒誘發腫瘤的預防和治療作用。
1)皮膚反應試驗中發現使用AN-1幾周後每組有幾個樣本出現「皮炎」(紅的、凹凸不平的表面)，這種皮炎開始僅在用藥的附近出現。然而，隨著實驗的進行，我們發現皮炎會有更大範圍地擴展。
所觀察到的皮炎使人想起退行性疣患者身上所見的皮膚發紅和瘙癢。
由於樣本以前或持續暴露於黑麴黴抗原，人們懷疑樣本可能曾經有過遲髮型變態反應。如所觀察到的這種遲髮型超敏反應是一種細胞免疫應答。動物的屍體剖檢發現對大多數器官沒有不適的副作用。在一些用AN-1治療的動物的腫瘤部位，表皮被中等量淋巴細胞和小量巨噬及漿細胞浸潤。在與超敏反應有關的無乳頭狀瘤病毒感染的小結處可見到同樣的浸潤。
2)疣的消退感染後112天，各組均出現一些腫瘤消退。此時，第1組感染部位腫瘤的百分比為75％。所以，有25％腫瘤消退。由於用發酵提取物進行治療，第3組的樣本的腫瘤中另外有24％疣消退。但是，第3組中一些已消退的腫瘤是用AN-1治療前消退的腫瘤，這取決於中間腫瘤大小的測量。B.血清的觀察用酶聯免疫吸附測定試驗檢測各樣本的試驗前血清和試驗後血清對CRPV和AN-1抗原的反應性的血清試驗如表2所示。C1和C2分別代表對照樣本#1和對照樣本#2，它們是作為此酶聯免疫吸附測定試驗的對照
表2用CRPV和AN-1抗原的酶聯免疫吸附測定試驗的結果每隻動物血清的效價

將血清按1∶10稀釋，然後再稀釋兩倍。將陽性對照的血清按1∶10稀釋後再稀釋六倍。效價為稀釋度的倒數。當490毫微米時的吸收率為0.1或更大時是最後稀釋的終點。四倍或更多的增加可認為有顯著性意義。對照組包括用上述(3)中的純化CRPV病毒顆粒免疫接種過的樣本。
上述表2的結果表明，第3組有5隻動物對CRPV抗原產生顯著的血清學陽性反應(後/前之比等於或大於4)，相反第1組僅有1隻樣本有此反應。按照Fisher Exact Test，第1組樣本(未使用任何本發明的組合物)與第3組樣本(使用本發明的組合物治療)對CRPV抗原的反應的差異具有顯著性意義(P＝0.05)。
還觀察到第3組有4隻樣本對AN-1抗原有血清學陽性反應，相比第1組只有1隻樣本有此反應。雖然這似乎進一步表明本發明組合物的功效，但從統計學來說，這一比例表明第1組和對照組動物的反應沒有顯著性差異。
儘管發現增強的抗原反應與所觀察到的腫瘤生長或不生長沒有關聯，但通常在第2和3組中對一種抗原的反應的增加與對其它抗原的反應的增加是相等的。對疣消退的血清學反應的作用還不清楚。這些結果表明，全身的超敏反應，如通過皮膚反應所觀察到的，可作為AN-1促進乳頭狀瘤消退的途徑。C.分子檢測本試驗中，如(3)所述的PCR-雜交分析是在三組樣本的腫瘤陰性部位進行的，目的是檢測在每個CRPV誘發的腫瘤中CRPV的實際存在。研究表明第1組有23％(3/13)之多的試驗部位有CRPV DNA，相比，第2組僅有6.5％(2/31)的試驗部位，第3組有9.5％(2/21)的試驗部位(見表3)。與此相比，在作為陽性對照的腫瘤樣本中有76％發現CRPV DNA。
表3PCR DNA分析的結果<

1如(3)所述，取出感染部位以得到總DNA，用PCR擴增證明CRPVDNA的存在並用Southern Blot Analysis進行分析。對三個研究組的第一組所有腫瘤陰性部位進行檢驗。僅對每組腫瘤陽性部位的代表性抽樣進行了檢驗。2CRPV DNA陽性數與檢測數之比(％)。這是本表中原始材料的總結。3原始材料如下兔子數CRPV DNA陽性的感染部位兔模型體系中的這些結果似乎表明在人類以及其它哺乳動物中達到預防和治療的目的時本發明組合物的功效。
實施例5黑麴黴發酵提取物用作表面治療劑對鼻部長有疣型腫瘤的兩匹馬均進行兩周治療。用棉紗布將上述實施例1所得到的液體濾過發酵提取組合物(冰凍乾燥前)塗在每隻馬鼻子一側疣的表面上。作為對照，用棉紗布將滅菌的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)塗在每隻馬鼻子另一側疣的表面上。1.實驗記錄治療是這樣進行的，將30ml溶液(PBS對照組合物)置於數層紗布上，再輕敷在疣上直至吸收。每次治療期間重複兩次，以使患處吸收。治療在第0、1、2、3、7和14天進行。觀測在第0、1、2、3、7、14、21和30天進行。2.結果大約治療開始後第7天，用組合物進行治療的一側鼻中的疣外觀上開始改變(變得較白，而另外的為粉紅色外觀)。
到第21天，發現敷有PBS的一側疣變得更大，似乎數量增多了。這些疣為粉紅色且生存能力很強。用組合物治療的一側的疣依然存在，但它們的大小和數量沒有增長。另外，它們外表為白色且很硬。
到第30天，與第20天對比沒有什麼改變。3.結論本發明的組合物對疣具有治療作用。用PBS處理的疣變得更大且擴散了，表明在這兩種處理的初始時疣仍未成熟。因此，第30天時用PBS處理和用組合物治療的疣在外觀上的差異是有顯著性意義的。
實施例6黑麴黴發酵提取物用作表面治療劑用於體內研究人類乳頭狀瘤病毒相關疾病的另一個極好的動物模型體系是重度聯合免疫缺損(SCID)小鼠。
重度聯合免疫缺損小鼠是從別的動物中移植細胞的嵌合動物。這類重度聯合免疫缺損小鼠幾乎很少有移植物抗宿主疾病。由於移植重度聯合免疫缺損小鼠的引進細胞支持感染，所以重度聯合免疫缺損小鼠是檢驗治療和預防組合物的一種有吸引力的模型。參考Milman，G.，and D′Souza，P.，ASM News(1990)Vol.56，No.12 at 639-642，可以得到重度聯合免疫缺損小鼠的全部說明，其內容也包括在本文中。
此模型包括用棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)對已移植到重度聯合免疫缺損小鼠的背部的紐西蘭白(NZW)兔耳的皮膚進行感染。然後判斷潛在的抗乳頭狀瘤病毒治療對抑制疣生長的能力。由於重度聯合免疫缺損小鼠在免疫學上為T和B細胞功能缺損，所以這種模型用來檢驗本發明的防治組合物(黑麴黴發酵提取物AN-1)的功效時不考慮任何這些免疫因素的介入。
上述實施例1所得的關於凍幹無細胞發酵粗提物(AN-1)的治療作用的對照試驗是按以下所述進行的
材料和方法CRPV原料病毒原料是通過研磨棉尾兔疣得到10％(v/v)的組織勻漿，再將其離心以去除細胞殘渣而製成。上清液貯存於-70℃直至使用。
紐西蘭白兔皮膚的移植和感染將紐西蘭白兔耳皮膚移植到麻醉的小鼠的背部兩側並進行數周的治療。然後用27G的針(100×)劃痕並在擦傷的組織處放5μl的未稀釋的CRPV培養物，這樣使兩側腹的組織受感染。
混合物的製備所有的混合物均在水乳膏中製備，得到最終濃度達8％(w/v)並加有10％(v/v)二甲基亞碸(DMSO)的凍幹提取物。將400mg混合物加入4.1g乳膏中並攪拌15分鐘。為了幫助溶解將混合物置於56℃水浴1小時。最後，加入0.5ml DNSO並再攪拌該混合物。在治療之間將混合物在4℃下儲存。
損傷的治療感染(PI)後3天開始在CRPV感染的移植物的左右兩側每天兩次進行表面治療，持續到感染(PI)後第6周。每個治療組有5隻小鼠，每組感染移植物為10隻。
功效的判斷用下述的損傷記分法從第2周至第8周每周判斷治療功效分數 臨床表現0無明顯的感染1感染部位的皮膚增厚2小而分散的乳頭狀瘤3大而分散的乳頭狀瘤4半融合的乳頭狀瘤5融合的乳頭狀瘤6稠密的角蛋白角質為了數據的分析，將治療組移植物的損傷分數加在一起進行平均。確定曲線以下的面積(AUC)，對於未進行治療的對照組動物則計算每次處理的曲線以下面積的減少百分比。
結果結果總結於下面表4中
表4

在這一模型中，一般認為曲線以下面積減少大於未治療動物的20％則有顯著性差異，可能表明有效的治療作用。使用無細胞的黑麴黴粗提物(AN-1)曲線以下面積的減少為21.1％。因此，可以看到當在這種模型中實驗時，使用AN-1發酵提取物能使疣的生長明顯減少。
在沒有脫離本發明的基本構思的情況下可進行許多改進。因此，對於本領域技術人員來說都清楚除了在本文中特別加以描述的以外，在所附的權利要求範圍內，本發明是能夠實施的。參考文獻(1)Takeshima，H.，Antiviral Agents.In The Search forBioactive Compounds from Microorganisms，Omura，S.，ed.，Springer-Verlag，N.Y.，N.Y.(1992)at page 50.(2)Watts，S.，et al.，(1983)Virology 125 at 127-138.(3)Ostrow，R.，et al.，(1992)Antiviral Res.17 at 99-113.(4)Ostrow，R.，et al.，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 at1634-1638.(5)Manias，D.，et al.，(1989)Cancer Res.49 at 2514-2519.(6)Ostrow，R.，et al.，(1981)Virology，108 at 21-27.(7)Poindexter，N.，and Schlieverr，P.，(1985)J.of Infect.Dis.151 at 65-72.(8)Dowdy，S.，and Wearden，S.，Chi-Square Distributions InStatistics for Research，J.Wiley Sons，Inc.，N.Y.，N.Y.(1983)at 97-124.(9)Latscha，R.，(1955)Biometrika 40 at 74-86.(10)Finney，D.J.，(1948)Biometrika 35 at 145-156.(11)Fisher，R.A.，Statistical Methods for Research Workers，14thed.，Hafner，N.Y.，N.Y.(1973).(12)Lidin，B.，et al.，(1992)Antiviral Res.17 at 79-89.(13)Korba，B.E.and J.L.Gerin(1992)Antiviral Res.19，55-70.
權利要求
1.一種用於預防和治療哺乳動物中病毒誘發腫瘤的防治組合物，它由藥劑上可接受的載體和麴黴屬發酵提取物或其衍生物組成。
2.權利要求1所述的防治組合物，其中麴黴屬發酵提取物為黑麴黴發酵提取物。
3.權利要求2所述的防治組合物，其中黑麴黴發酵提取物為黑麴黴1.2 AN29發酵提取物。
4.權利要求2所述的防治組合物，其中黑麴黴發酵提取物為黑麴黴1.2 AN39發酵提取物。
5.麴黴屬發酵提取物用於製造預防和治療哺乳動物中病毒誘發的腫瘤的防治組合物。
6.權利要求5所述的用途，其中麴黴屬發酵提取物用於製造預防和治療的表面用的組合物。
7.一種用於製備預防和治療哺乳動物中病毒誘發腫瘤的防治組合物的方法，該方法包括的步驟有在適當的培養基上培養麴黴屬菌種，用水從培養基中提取細胞外的混合物，以便得到液體發酵提取物，過濾所得的液體發酵提取物，以去除其中的細胞生物質和孢子，由此便製成防治組合物。
8.權利要求7所述的方法，其中培養的步驟包括在適當的固體表面培養基上培養麴黴屬菌種。
9.權利要求7所述的方法，還包括冷凍液體發酵提取物直至其使用的步驟。
10.權利要求7所述的方法，其中培養麴黴屬菌種的步驟包括在適當的培養基上培養黑麴黴。
11.權利要求10所述的方法，其中黑麴黴為黑麴黴1.2 AN29。
12.權利要求10所述的方法，其中黑麴黴為黑麴黴1.2 AN39。
13.預防和治療哺乳動物中病毒誘發腫瘤的方法包括給需要治療的哺乳動物使用治療有效量的防治組合物，該組合物包括麴黴屬發酵提取物或其衍生物和藥劑上可接受的載體。
14.權利要求13所述的方法，其中治療有效量是在所需哺乳動物的體表，比如病毒誘發的腫瘤部位上表面用藥。
15.權利要求13所述的方法，其中麴黴屬發酵提取物為黑麴黴發酵提取物。
16.權利要求13所述的方法，其中黑麴黴發酵提取物為黑麴黴1.2 AN29發酵提取物。
17.權利要求13所述的方法，其中黑麴黴發酵提取物為黑麴黴1.2 AN39發酵提取物。
18.權利要求13所述的方法，其中病毒誘發的腫瘤為乳頭狀瘤病毒誘發的腫瘤。
19.一種黑麴黴1.2 AN29發酵提取物及其衍生物。
20.一種黑麴黴1.2 AN39發酵提取物及其衍生物。
全文摘要
本發明涉及用於預防和治療病毒誘發腫瘤的防治劑，特別是來源於麴黴屬發酵提取物的組合物，及其應用、直接使用或製備成一種藥劑來防治哺乳動物中病毒誘發的腫瘤。這些腫瘤包括乳頭狀瘤病毒誘發的腫瘤。該組合物是表面給藥的。
文檔編號C12R1/685GK1134671SQ94194047
公開日1996年10月30日 申請日期1994年9月16日 優先權日1993年9月27日
發明者E·W·博耶, R·L·查爾斯 申請人:索爾維酶有限公司